الكتاب نود أن نعترف مصادر التمويل، بما في ذلك AHA (13GRNT16990019 إلى WT) وNHLBI (HL097246 وHL119371 لWT).

1. Silanization وجزيء حيوي Functionalization من الشرائح أو البولي غشاء ملاحظة: العديد من المواد الكيميائية والحلول في هذا البروتوكول لديهم معدلات التبخر عالية (الإيثانول (ETOH)، والأسيتون، وغيرها). خطوات أخرى تستلزم مرات حضانة طويلة لمعدلات التبخر منخفضة. يوصى فيلم البرافين لختم الحاويات. تحذير: تعتبر خطرة، أو متقلبة: العديد من المواد الكيميائية (حمض الكبريتيك، والأسيتون، (3-أمينو) triethoxysilane، غلوتارالدهيد، ETOH بما في ذلك). استشارة رقة بيانات سلامة المواد (MSDS) من كل مادة لتخزين السليم، والمناولة، والتخلص منها قبل الاستخدام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريحة زجاجية جديدة قياس 75 مم 50 مم 1 ملم، في نظيفة، شريحة زجاجية طبق تلطيخ بغض النظر عن التوجه، وضمان الانغماس الكامل. استخدام حاوية لخطوات 1،1-1،12. ملاحظة: لثقافة مشتركة، تشمل البولي (PC) الغشاء مع 0،4 ميكرون حجم المسام، وقطع لحجم 75 مم 50 مم، لجميع الظريف لاحقاملاحظة لfunctionalization PC وEC البذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الشرائح في حامض الكبريتيك (20٪)، O / N. تحذير: استشر MSDS لحامض الكبريتيك قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح عن طريق غمر في الماء منزوع الأيونات (DI) لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات، وتغيير DI كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الشرائح في الأسيتون لمدة 30 دقيقة. تحذير: استشر MSDS لالأسيتون قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الشرائح في 6٪ (3-أمينو) حل triethoxysilane / الأسيتون O / N. تحذير: استشر MSDS ل(3-أمينو) triethoxysilane والأسيتون قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الشرائح في الأسيتون لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات، وتغيير الأسيتون في كل مرة. تحذير: استشر MSDS لالأسيتون قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح عن طريق غمر في DI لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات، وتغيير DI كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الشرائح في 1.5٪ محلول غلوتارالدهيد / DI لمدة 60 دقيقة. تحذير: استشر MSDS لغلوتارالدهيد قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح عن طريق غمر في DI لمدة 5 دقائق، مرتين، وتغيير DI كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشريحةالصورة إلى 70٪ من الإيثانول (ETOH) لمدة 30 دقيقة في العقيمة، غطاء تدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ETOH والسماح بقايا لتتبخر المتبقية. تزج الشرائح في DI معقمة وهجرة من أجل ترطيب الشرائح. ملاحظة: الشرائح أو قد تكون مختومة غشاء PC في حامل شريحة زجاجية وتخزينها في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد. عند الاستخدام لزراعة الخلايا، كرر الخطوات من 1.10 و 1.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريحة من حامل الشرائح ووضعه في 100 ملم 100 ملم طبق بتري مربع في غطاء تدفق الصفحي. ملاحظة: سيتم استخدام هذه الحاويات لجميع الخطوات المتبقية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشريحة أو PC لزرع الخلايا البطانية لتجربة زراعة محصول واحد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف الشريحة functionalized أو PC (الخطوة 1.11) مع 1 مل من محلول فبرونيكتين (25 ميكروغرام / مل)، على جانب واحد، وتغطي مساحة تقارب تتعرض لغرفة زراعة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح أو PC في حاضنة معقمة وضعت في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، ونضح الحل المتبقية باستخدام غلاSS الشافطة ماصة متصلة فراغ. ملاحظة: الشرائح يمكن الآن المخزنة O / N عند 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 1.12.2 فقط لإعداد EC / SMC ثقافة مشتركة. إعداد والبذور الملساء الخلايا العضلية (SMC) ثقافة لتجربة الثقافة المشتركة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان سيليكون طوقا على رأس الشريحة (الخطوة 1.11)، مع أبعاد 75 مم 50 مم القطر الخارجي، قطرها الداخلي 50 ملم بنسبة 30 مم، سماكة 0.5 مم، والثقوب التي تتماشى مع غرفة تدفق فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 مل SMC في 10٪ FBS / DMEM تعليق. تحييد 1 مل من محلول من 2 ملغ / مل الكولاجين النوع الأول بنسبة 7٪ NaHCO 3 و 0.1 M محلول هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة من 7.4، وتخلط مع SMC تعليق مع كثافة الخلية النهائية من 2 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشر الحل SMC داخل حشية واحتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وتغطية الشريحة مع المصل 25 مل 0.1٪ بقري جنيني (FBS) مختلطة في لDulbecco التعديلالنسر المتوسطة (DMEM) لمدة 72 ساعة. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا البطانية الثقافة (ECS) على الغشاء شريحة زجاجية / البولي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 1 مل ECS في 10٪ FBS / DMEM، مع التركيز الأولي من 6.0 × 10 5 خلية / مل، على الأسطح فبرونيكتين من شريحة زجاجية أو غشاء البولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، وFBS 10٪ لمدة 120 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح غطاء تحتوي على خلايا مع إضافية 10٪ FBS / DMEM، ومكان في الحاضنة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 O / N، حتى 70٪ -80٪ متموجة. </li></ol></li></ol> 2. تحديد اللزوجة السائل ومعدل التدفق الحجمي ملاحظة: مقاييس اللزوجة الدوارة هي المعدات الحساسة، وينبغي الرجوع إلى دليل المستخدم جهاز قياس اللزوجة قبل معايرة، التصفير، أو أداء القياسات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد القص السوائل المطلوب (τ) من أدب الأوعية الدموية استهدفت التجربة و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس آثافةه 1٪ FBS / DMEM اللزوجة (μ)، وذلك باستخدام جهاز قياس اللزوجة الدوراني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المطلوب معدل التدفق الحجمي (Q) من بوازوي المعادلة: <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> ، حيث τ = السوائل القص، μ = اللزوجة، Q = المجلد. معدل التدفق، ث = غرفة العرض، وح = ارتفاع الغرفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مضخة لمعدل المستمدة في الخطوة 2.3 تتدفق، واستخدام لجميع الخطوات اللاحقة. </li></ol> 3. تحديد مؤشر Pulsatility ملاحظة: يجب أن تكون متصلا جميع منافذ اتصال داخل منظومة مع قفل حلقة إلى شوكة بحجم مناسب، أو الإناث اتصالات بالتركيبة إلى تعليق لاذع. ثم قد تكون مرتبطة توصيل أنابيب PVC إلى التجهيزات تعليق لاذع، وأكملت الدائرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الدائرة تدفق كما في الشكل 2، مع التخميد غرفة (الشكل 3) وبالموجات فوق الصوتية متر تدفق في اتجاه وتدفق الصحيح. ملاحظة: بالموجات فوق الصوتية تدفق متر هو جزء حساس من المعدات، ووينبغي استشارة دليل المستخدم قبل استخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الدائرة التدفق والخزان بالماء DI، من خلال ضمان أنبوب مخرج الخزان (ضخ) هي غارقة داخل حجم الخزان. تصور الموجي تدفق باستخدام تدفق متر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح صمام إطلاق الهواء في الغرفة التخميد لتغيير نسبة حجم السائل / الهواء. انهيار صمام إطلاق الهواء على فترات مختلفة مستوى السائل وحساب مؤشر pulsatility (PI = (V ماكس - V مين) / V الوسط) باستخدام ذروة الموجي تدفق (V ماكس)، الحوض الصغير (V مين)، ويعني (V الوسط). سجل القيم PI في دفتر الملاحظات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة أدى مستوى السوائل وPI على غرفة التخميد، وذلك باستخدام شعر يميل، قلم حبر دائم للاستخدام في المستقبل. تحديد مستويات PI المرجوة من أمراض الأدب 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيليكون أنبوب Formation- الاختياري، طريقة أكثر تقدما من السيطرة على pulsatility <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج قاعدة سيليكون المطاط الصناعي وكيل علاج في نسب مختلفة (على سبيل المثال، لوبانسبة الإلكتروني إلى crosslinker من 10: 1 إلى 36: 1) لاختلفت الرجوعية المرنة المستهدفة، كما هو موضح سابقا 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال أنابيب السيليكون بتكرار عملية تراجع، علاج، لينخفض ​​لفترة وجيزة قنية الصلب (14 G) إلى سيليكون خليط prepolymer مع نسبة محددة سلفا قاعدة إلى crosslinker. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قنية المغلفة prepolymer في فرن وضعت في 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لعلاج طلاء البوليمر على قنية، والتحول الاتجاه في منتصف عملية المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار عملية غمس مع نفس خليط سيليكون المطاط الصناعي ووضع مرة أخرى في الفرن لمدة 4 ساعات إضافية، مما يؤدي إلى ~ 0.3 ملم أنابيب سميكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب سامسونج سيليكون من قنية الفولاذ المقاوم للصدأ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب تدفق الدائرة بدلا من التخميد غرفة، واختبار PI لكل واحد كما في 3.3. </li></ol></li></ol> 4. مضخة التعقيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج غرفة التدفق (الشكل 2)، الأنابيب البلاستيكية، وحشيات في 10٪ بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2). يغسل مع DI معقم قبل الخطوة 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مضخة الدم على الرف حاضنة الفراغ. ملاحظة: يجب أن تكون الرفوف حاضنة الفولاذ المقاوم للصدأ، وتكون قادرة على دعم وزن الدائرة تدفق بأكملها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الدائرة التدفق والخزان مع 10٪ H 2 O 2 عن طريق ضمان أنبوب مخرج الخزان (ضخ) هي غارقة داخل حجم الخزان. تعميم H 2 O 2 عن طريق الضخ عبر الدائرة لمدة 20 دقيقة في غطاء تدفق الصفحي مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح عن H 2 O 2 من الأنابيب، ويغسل مع برنامج تلفزيوني العقيمة التي كتبها الضخ عبر الدائرة التدفق. </li></ol> 5. تدفق الجمعية الغرفة ملاحظة: تتكون غرفة التدفق من الاكريليك، لوحة العرف، مع منافذ فراغ ومدخل والموانئ تدفق منفذ (انظر الشكل 2). ويتألف مجلس غرفة من وضع غرفة التدفق وحشيات على رأس الشرائح الثقافة، والمؤيدperly الانحياز، ويوصف أدناه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء 1٪ FBS / DMEM في 37 ° C حمام المياه وإعداد غرفة التدفق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ EC تنزلق للخارج وسائل الإعلام (من الخطوة 1.13) ومكان طوقا على أعلى مع الجانب الخلية يصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) اتخاذ غشاء PC من وسائل الإعلام (من الخطوة 1.13) ومكان طوقا على أعلى مع الجانب الخلية يصل. ضع الشريحة ثقافة مشتركة مع المصنفة SMC (الخطوة 1.12.2) تحت غشاء PC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة قناة فراغ الغرفة تدفق مع الفتحات الموجودة في طوقا (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق فراغ أنبوب إلى الموانئ فراغ (الشكل 2) ضمان عدم تسرب سائل الإعلام إلى فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ورقة البولي مكان تحت شريحة زجاجية وتدفق المشبك التجمع الغرفة مع المشابك الربيع، واحدة على كل جانب من غرفة التدفق (أرقام 2 و 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النظام مكان تدفق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، وملء الدائرة مع وسائل الاعلام عن طريق الضخ من الخزان شغل في انخفاض pulsatility.الحفاظ على هذا التدفق لمدة 4 ساعة لشروط مسبقة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط حجم السائل في التخميد الغرفة إلى مستوى PI ملحوظ، والثقافة عن الوقت المطلوب. </li></ol>

<ol>
	<li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves.">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2/NF-&#954;B+Pathway.">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-&#954;B Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).</li><li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Calcification:+Pathophysiology,+Epidemiology,+Imaging+Methods,+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association.">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li><li>Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+fibrosis+in+atherosclerosis.">Vascular fibrosis in atherosclerosis.</a> Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+endothelial+recovery+and+reducing+neointimal+hyperplasia+using+sequential-like+release+of+acetylsalicylic+acid+and+paclitaxel-loaded+biodegradable+stents.">Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents.</a> Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).</li><li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Remodeling+in+Hypertension+Roles+of+Apoptosis+Inflammation,+and+Fibrosis.">Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).</li><li>Greil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+carotid+artery+flow+velocities+after+stent+implantation:+a+fluid+dynamics+study+with+laser+Doppler+anemometry.">Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry.</a> J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).</li><li>Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+as+biomechanical+sensors+in+regulating+endothelial+function.">Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function.</a> Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).</li><li>Liu, S. Q., Goldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+blood+shear+stress+in+the+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+migration.">Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration.</a> IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).</li><li>Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pulsatility+flow+stimulates+smooth+muscle+cell+hypertrophy+and+contractile+protein+expression.">High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression.</a> AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).</li><li>Panaritis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatility+Index+of+Temporal+and+Renal+Arteries+as+an+Early+Finding+of+Arteriopathy+in+Diabetic+Patients..">Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients..</a> Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).</li><li>Miao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Flow+Patterns+on+the+Localization+and+Expression+of+VE-Cadherin+at+Vascular+Endothelial+Cell+Junctions:+In+vivo+and+in+vitro+Investigations.">Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations.</a> J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لإعادة إنتاج تدفق نابض في المختبر، ويمكن أن يكون خطوة أولى مفيدة في تحديد مساهمة ظروف تدفق لأمراض المرض. وقد وجدت دراسات سابقة باستخدام هذا البروتوكول تساهم ظروف التدفق إلى الاستجابة الالتهابية الأوعية الدموية. 1، 10 بالإضافة إلى ذ...

معدلات الإصابة بالأمراض لأمراض القلب والشرايين هي الأكبر في أميركا، مع ما يترتب على كثير من الأوعية الدموية غير صحية. تتكون الشرايين سليمة من الأنسجة المرنة، مع سطح اللمعية الناعمة المغلفة مع خلية البطانية (EC) أحادي الطبقة. قد تكون على غرار تدفق الدم باعتبارها وظيفة موجة تتأرجح مع معدل تدفق متوسط ​​إيجابي. مؤشر pulsatility (PI) هو حاصل من حجم التذبذب ويعني تدفق (PI = (ماكس - مين) / متوسط) (1)، وقد غرار في المختبر مع مرونة الأوعية متغير 2 الشرياني مرونة مهمة في تخزين التدفق. الطاقة من انقباضات القلب، معلقا تحت ضغط الانقباضي، وتلعب دورا هاما في تحوير PI تدفق الدم. لأن يحافظ على قلب ثابت، نابض، التدفق الحجمي، وتوسيع الشرايين ويزيد من مساحة العابرة للقطاعات، وتعزيز الاستقرار عن طريق الحد من تدفق سرعة تدفق، إجهاد القص، وPI. في كثير من الأحيان، والتغيرات الشرايين غير الصحية الحالية للمرونةأو الامتثال، وعرض تشنج من إعادة الأوعية الدموية، وندبا أو تكلس 3، 4. بالإضافة إلى ذلك، واضطرابات الأوعية الدموية الأخرى، مثل تضخم neointimal (NIH)، 5 تمدد الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم وتليف الأوعية الدموية 6 4، قد انقباض قطر السفينة. ومع ذلك، العلاج من تعاطي المخدرات الحالية ومعالجة الجهاز من أمراض الأوعية الدموية في كثير من الأحيان يتجاهلون أهمية الامتثال جدار الوعاء الدموي أو تدفق الدم ديناميكية في أمراض الأوعية الدموية التي كثيرا ما تتسبب بتغيرات في التشكل السفينة والممتلكات. لا قسطرة البالون ولا الدعامات لرد على مضاعفات جدار مرونة 7. لذلك، في المختبر نمذجة تدفق الدم الناتج عن أمراض الشرايين وعلاجات مهمة في التحقيق في الأمراض المرض وفعالية في المستقبل من العلاج. هنا، نحن تصف طريقة تكرار الفسيولوجية والمرضية تدفق الدم تهدف إلى تحديد استجابة الخلايا في pathol أمراض الأوعية الدمويةogies. يسبب تدفق السوائل إجهاد القص في جدار الوعاء الدموي، وهي إشارة الميكانيكية الهامة في مجال الصحة السفينة، مما يؤثر على كل الخلايا داخل الأوعية الدموية. وقد تم تحديد عدد من أجهزة الاستشعار الميكانيكية على بطانة الأوعية الدموية للالقص السوائل، بما في ذلك هدب الأساسي هو مبين في الدراسات الحديثة عن البطانية mechanosensing 8. تتأثر نشاط الخلايا البطانية والتشكل من خلال سرعة تدفق والتوجيه، وpulsatility. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر خلايا العضلات الملساء (SMC) الهجرة عن طريق الاشارات والميكانيكية من انخفاض سرعة تدفق من خلال الخلالي السوائل 9، ويمكن أيضا أن تكون من خلال الإشارات نظير الصماوي من الخلايا البطانية من خلال استجابتها لتدفق ووالميكانيكية تنبيغ إشارات التدفق عبر خلوى الإفراج عن 10. و&quot;جرعة&quot; اعتماد القص نفسه، PI، ويشير نظير الصماوي قد تكون مترابطة أيضا. تحقيقا لهذه الغاية، وتحديد استجابة الخلايا الوعائية إلى القص السوائل مع متنوعة &quot;الجرعات&quot; في الثقافة أحادي الطبقةأو زملاء الثقافة في المختبر يمكن أن توفر رؤى الآلية في إعادة الأوعية الدموية وتحسين المرض والتنبؤ العلاج. نظام تدفق المستخدمة في هذه التجربة يتكون من مضخة الدم، تدفق التخميد خزان الهواء المنبع، تدفق متر المصب يستخدم فقط أثناء الإعداد التجريبية، ثقافة الخلية المصب، موازية لوحة غرفة تدفق، وخزان وسائل الإعلام. السيطرة على المتغيرات تدفق الأوعية الدموية مثل يعني معدل التدفق، يدق في الدقيقة الواحدة، ويمكن أن يتحقق من خلال PI السيطرة على معدل التدفق، وتواتر النبض، وإدخال ضغط التخميد. هي مضخات الدم نابض المتاحة مع نزوح السكتة الدماغية متغير، في تواتر السكتات الدماغية التي تسيطر عليها، تتصل مباشرة يعني معدل التدفق الحجمي، وتواتر النبض. مقدمة من خزان الهواء داخل الدائرة تدفق يسمح للضغط التخميد، والحد من حجم التذبذب التدفق. وسائل الإعلام هو سائل غير قابل للإنضغاط، في حين أن الهواء داخل غرفة التخميد هو انضغاط، مما يسمح للضغط الزائد من موجة تدفق لتكونتمتصه ضغط الهواء. الهواء لنسبة وسائل الإعلام يسمح للسيطرة على كيفية حدوث الكثير من التخميد. تم إنشاء مخصص الثقافة خلية تدفق غرفة 75 ملم في الطول بمقدار 50 ملم في العرض من الاكريليك. يدخل التدفق من خلال مدخل الميناء، ويوسع من خلال فتحة متعددة، وتوفير تدفق ثابت عبر مجمل غرفة التدفق. تدفق وهياكل مماثلة موجودة في منفذ الغرفة. هي المصنفة الخلايا على الشرائح functionalized، وتعلق بعد ذلك إلى غرفة التدفق. وهذا يسمح لعدد كبير من السكان واسترجاعها بسهولة بعد الدراسة. تجارب المشارك الثقافة قد تستخدم غشاء البولي يسهل اختراقها للقضاء على اتصال خلية الى خلية بين الثقافات بينما يسمح النقل خلوى / التدفق. وقد سبق استخدام هذا النظام لنمذجة تدفق PI عالية وتأثيره على الثقافة أحادي الطبقة البطانية وEC / SMC شارك في الثقافة 1، 10، للتحقيق في استجابة الخلايا للأمراض PI عالية بشكل مرضي. من خلال وصف بروتوكول يستخدم لنمذجتها يخدع تدفقditions، ونأمل في مساعدة الآخرين في تحديد مساهمة إشارة تدفق إلى استجابة الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide (70mm x 50mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Membrane</td>
			<td>Millipore Corp.</td>
			<td>HTTP09030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>RD 475464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (25 &#956;g/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damping Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65066, 65063, 65062</td>
			<td>Various sizes may be required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Connections</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Chamber</td>
			<td>Machined in-house</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri Dish</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-14007-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Holder</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>WHE-900303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter</td>
			<td>Sonotec, GmbH</td>
			<td>Sonoflow co.55/060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 G Steel Cannula</td>
			<td>General Laboratory Supply</td>
			<td>S8365-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

أمراض الأوعية الدموية هو سبب شائع للوفاة في الولايات المتحدة. هنا، فإننا نقدم وسيلة لدراسة مساهمة ديناميكية تدفق نحو الأمراض أمراض الأوعية الدموية. الشرايين غير صحية غالبا ما تكون موجودة مع تشنج الجدار، تندب، أو تضيق جزئي والتي قد تؤثر على جميع معدلات تدفق السوائل، وحجم تدفق نابض، أو مؤشر pulsatility. تكرار ظروف تدفق مختلف هو نتيجة لضبط ضغط تدفق التخميد غرفة المصب مضخة الدم. إدخال الهواء داخل نظام تدفق مغلقة تسمح وسيلة للانضغاط على امتصاص ضغط نابض من المضخة، وبالتالي تختلف مؤشر pulsatility. الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة ويرد بكل بساطة، مع إدخال السيطرة عليها إلى حد كبير، ونتائج قابلة للقياس بسهولة. بعض القيود هي الترفيه من التعقيد الفسيولوجية الموجي النبض، والذي يقترب فقط من قبل النظام. تتأثر الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، والخلايا الليفية من قبل عبتي تدفق الدمough الشريان. يتم تحديد العنصر الديناميكي لتدفق الدم عن طريق الانتاج وجدران الشرايين القلبية الامتثال. الأوعية الدموية خلية والميكانيكية تنبيغ ديناميكية تدفق قد تؤدي إلى إطلاق سراح خلوى وعبر الحديث بين أنواع الخلايا داخل الشريان. شارك في ثقافة من خلايا الأوعية الدموية هي صورة تعكس أكثر دقة التفاعل خلية خلية على جدار الأوعية الدموية والأوعية الدموية استجابة لإشارات الميكانيكية. مساهمة ديناميكية تدفق، بما في ذلك استجابة الخلية إلى عناصر دينامية ويعني (أو ثابتة) من التدفق، وبالتالي فهو مقياس مهم في تحديد علم الأمراض وفعالية العلاج. من خلال إدخال في المختبر نموذج التعاون ثقافة وضغط التخميد المصب من ضخ الدم الذي ينتج النتاج القلبي محاكاة، قد يتم التحقيق مختلف الأمراض مرض الشرايين.

الحفاظ على ظروف التدفق هي التي تعتمد على التجميع الصحيح من الدائرة تدفق (الشكل 1). أنابيب قطرها هو اختيار هامة في التجمع، وبأقطار أكبر خفض مقاومة تدفق وهبوط الضغط لاحق قبل وبعد غرفة الثقافة. لضمان يقصد الضغط وسرعة تدفق وتجميع النظام مع تدفق متر قبل التجربة مع ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling at JoVE.com

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

هذا البروتوكول يعيد الفسيولوجية أو المرضية تدفق الدم في المختبر للمساعدة في تحديد استجابة الخلايا في أمراض المرض. عن طريق إدخال ضغط التخميد غرفة المصب مضخة الدم، وتدفق الدم عبر الأوعية الدموية ويمكن تلخيصها وفرضت على أحادي الطبقة من بطانة الأوعية الدموية أو المحاكاة ثقافة مشتركة.

في المختبر نموذج الفسيولوجية والمرضية تدفق الدم مع التطبيق على التحقيقات الأوعية الدموية إعادة عرض خلية

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

in-vitro-model-physiological-pathological-blood-flow-with-application

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

9.5K Views.  University of Colorado at Boulder.  هذا البروتوكول يعيد الفسيولوجية أو المرضية تدفق الدم في المختبر للمساعدة في تحديد استجابة الخلايا في أمراض المرض. عن طريق إدخال ضغط التخميد غرفة المصب مضخة الدم، وتدفق الدم عبر الأوعية الدموية ويمكن تلخيصها وفرضت على أحادي الطبقة من ...

Video: In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

رواية ثلاثي الأبعاد التدفق جهاز الدائرة لدراسة Chemokine الموجه التسرب من خلايا اعارة تحت ظروف تدفق الفسيولوجي

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

صدمة الموجة التطبيق إلى الخلية الثقافات

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

هندسة الأنسجة اللحمية من الورم المكروية مع التطبيق على غزو الخلية السرطانية

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

في المختبر خلية الثقافة نموذج لاستنشاق الفحوصات الكيميائية السامة

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل<em&gt; في المختبر</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

للدائرة نموذج ميكروفلويديك تدفق لصفائح الدم نقل والإرقاء يقيس ترسب الصفائح الدموية والليفين تشكيل في الوقت الحقيقي

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...