Die Autoren möchten Finanzierungsquellen, einschließlich der AHA (13GRNT16990019 zu WT) und NHLBI (HL097246 und HL119371 zu WT) zu quittieren.

1. Silanisierung und Biomolekül Funktionalisierung von Slide oder Polycarbonatmembran Hinweis: Viele der Chemikalien und Lösungen innerhalb dieses Protokolls haben hohe Verdunstungsraten (Ethanol (EtOH), Aceton, etc.). Weitere Schritte zur Folge haben lange Inkubationszeiten für niedrige Verdampfungsraten. Paraffinfilm wird empfohlen, um Behälter zu versiegeln. Achtung: Viele der Chemikalien (einschließlich: Schwefelsäure, Aceton, (3-Aminopropyl) triethoxysilan, Glutaraldehyd, EtOH) als gefährlich oder flüchtig. Wenden Sicherheitsdatenblatt (MSDS) der einzelnen Materialien für die ordnungsgemäße Lagerung, Handhabung und Entsorgung vor dem Gebrauch. <ol><li> Legen Sie neue Objektträger Abmessungen 75 mm x 50 mm von 1 mm, in sauberen, Glasobjektträger Färbeschale ohne Rücksicht auf Orientierung, die Gewährleistung der vollen Immersion. Verwenden Sie Container für Schritte 1,1-1,12. Hinweis: Für die Co-Kultur, sind Polycarbonat (PC) Membran mit 0,4 um Porengröße, der Größe von 75 mm × 50 mm geschnitten, für alle nachfolgenden steps für PC Funktionalisierung und EC Aussaat. </li><li> Tauchen Folie in Schwefelsäure (20%), O / N. Achtung: Konsultieren MSDS für Schwefelsäure vor dem Gebrauch. </li><li> Indem in entionisiertem Wasser (DI) für 5 min, dreimal eingetaucht, Ändern DI jedes Mal waschen Folie. </li><li> Einzutauchen Folie in Aceton für 30 min. Achtung: Konsultieren MSDS für Aceton vor der Verwendung. </li><li> Einzutauchen Schieber in 6% (3-Aminopropyl) triethoxysilan / Aceton-Lösung, O / N. Achtung: Konsultieren MSDS für (3-Aminopropyl) triethoxysilan und Aceton vor der Verwendung. </li><li> Einzutauchen Folie in Aceton 5 min, dreimal Wechsel Aceton jedesmal. Achtung: Konsultieren MSDS für Aceton vor der Verwendung. </li><li> Durch in DI für 5 min dreimal Eintauchen, Ändern DI jedes Mal waschen Folie. </li><li> Tauchen Folie in 1,5% Glutaraldehyd / DI-Lösung für 60 min. Achtung: Konsultieren MSDS für Glutaraldehyd vor der Verwendung. </li><li> Durch in DI für 5 Minuten, zweimal eingetaucht, Ändern DI jedes Mal waschen Folie. </li><li> Den Objektträgers in 70% Ethanol (EtOH) für 30 Minuten in sterilen Laminarströmungshaube. </li><li> Entfernen EtOH und lassen verbleibende Rückstand verdampft. Tauchen Sie Folien in sterilem DI und Drain, um die Folien rehydrieren. Hinweis: Die Objektträger oder PC-Membran kann in Glasobjekthalter bis zu einer Woche versiegelt und bei 4 ° C gelagert. Bei der Verwendung für die Zellkultur, wiederholen Sie die Schritte 1.10 und 1.11. </li><li> Entfernen Sie die Folie von der Objektträgerhalter und legen Sie sie in einen 100 mm mal 100 mm quadratischen Petrischale in der Sterilbank. Anmerkung: Dieser Behälter wird für alle verbleibenden Schritte verwendet werden. <ol><li> Bereiten Schlitten oder PC für die endotheliale Zellaussaat zur Monokultur-Experiment. <ol><li> Beschichten das funktionalisierte Folie oder PC (Schritt 1.11) mit 1 ml Fibronektin-Lösung (25 ug / ml), auf der einen Seite für den ungefähren Bereich an Zellkulturkammer ausgesetzt. </li><li> Dias oder PC Inkubieren in sterilen Brutschrank bei 37 ° C für 1-2 h eingestellt. </li><li> Nach der Inkubation, saugen Sie den verbleibenden Lösung unter Verwendung eines glass Aspirator Pipette mit einem Vakuum verbunden. Hinweis: Die Objektträger können nun zur weiteren Verwendung gelagert O / N werden bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Folgen 1.12.2 Schritte nur zur Herstellung von EG / SMC Co-Kultur. Bereiten Sie und Samen glatten Muskelzellen (SMC) Kultur für Co-Kultur-Experiment. <ol><li> Ort Silikondichtung auf der Oberseite des Schiebers (Schritt 1.11), mit den Abmessungen von 75 mm × 50 mm Außendurchmesser, Innendurchmesser von 50 mm bis 30 mm, einer Dicke von 0,5 mm und Perforationen, die mit Durchflusskammer-Vakuum auszurichten. </li><li> Bereiten Sie 1 ml SMC in 10% FBS / DMEM Suspension. Neutralisieren 1 ml Lösung von 2 mg / ml Kollagen Typ-I mit 7% NaHCO 3 und 0,1 M NaOH-Lösung auf pH-Wert von 7,4 und mit SMC-Suspension mit der endgültigen Zelldichte von 2 x 10 6 Zellen / ml zu mischen. </li><li> Verteilt SMC Lösung innerhalb Dichtung und inkubieren Objektträger bei 37 ° C und 5% CO 2 für 30 min. </li><li> Nach der Inkubation, bedecken die Objektträger mit 25 ml 0,1% fötalem Rinderserum (FBS) in Dulbeccos Modified vermischtEagle-Medium (DMEM) 72 h. </li></ol></li></ol></li><li> Kultur Endothelzellen (ECs) auf Glasobjektträger / Polycarbonat-Membran. <ol><li> Samen 1 ml ECs in 10% FBS / DMEM mit Anfangskonzentration von 6,0 x 10 5 Zellen / ml, auf Fibronectin Oberflächen der Glasträger oder Polycarbonatmembran. </li><li> Inkubieren Zellen im Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 und 10% FBS für 120 min. </li><li> Deckgläser enthaltenden Zellen mit zusätzlichen 10% FBS / DMEM, und in Inkubator 37 ° C, 5% CO &amp; sub2; O / N bis 70% -80% konfluent. </li></ol></li></ol> 2. Bestimmung der Fluidviskosität und Volumendurchfluss Hinweis: Rotierende Viskosimeter sind empfindliche Geräte, und das Viskosimeter Bedienungsanleitung sollte vor der Kalibrierung, Nullstellen, oder die Durchführung von Messungen herangezogen werden. <ol><li> Bestimmen Sie gewünschte Fluidscher (τ) aus der Literatur des Experiments die gezielte Gefäßsystem. </li><li> Measure 1% FBS / DMEM-Viskosität (μ) mit einem Rotationsviskosimeter. </li><li> Bestimmen Sie benötigten Volumenstrom (Q) von Poiseuille-Gleichung: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> . wobei τ = Fluidscherungs, μ = Viskosität, Q = vol. Durchfluss, w = Kammerbreite und h = Kammerhöhe). </li><li> Pumpenaggregat zur Durchflussmenge in Schritt 2.3 abgeleitet, und verwenden Sie für alle folgenden Schritte. </li></ol> 3. Bestimmung der Pulsatilitätsindex Hinweis: Alle Verbindungsanschlüsse innerhalb des Systems sollte mit geeigneter Größe Lock-Ring-zu-Widerhaken oder weiblichen Luer-to-Widerhaken-Verbindungen angeschlossen werden. Verbindungs ​​PVC-Schlauch kann dann auf Schlauchtüllen verbunden werden, und die Schaltung vervollständigt. <ol><li> Schließen Strömungskreislauf, wie in Abbildung 2, mit Dämpfungskammer (Abbildung 3) und Ultraschall-Durchflussmesser in der richtigen Flussrichtung. Hinweis: Ultraschall-Durchflussmesser ist ein empfindliches Gerät, undDie Bedienungsanleitung sollte vor der Verwendung konsultiert werden. </li><li> Füllen Strömungskreislauf und das Reservoir mit DI-Wasser, indem sichergestellt wird, Reservoirauslass Rohr (zur Pumpe) in Speichervolumen eingetaucht. Visualisieren Flusswellenform mit einem Durchflussmesser. </li><li> Öffnen Sie das Entlüftungsventil an der Dämpfungskammer Fluid / Luft-Volumenverhältnis zu ändern. Schließen Entlüftungsventil an verschiedenen Flüssigkeitsstand Abständen und berechnen Pulsatilitätsindex (PI = (V max - V Min) / V Mittelwert) unter Verwendung von Flusswellenformspitze (V max), Mulde (V min) und bedeutet (V Mittelwert). PI-Werten in Notebook. </li><li> Mark resultierenden Flüssigkeitsstand und PI auf dem Dämpfungsraum mit einem Filz gekippt, permanent Tintenfeder für die zukünftige Verwendung. Bestimmen Sie die gewünschte PI Ebenen aus der Pathologie Literatur 11. </li><li> Silikon-Schlauch Formation- Optionale, erweiterte Verfahren zur Steuerung Pulsatilität <ol><li> Mischen Sie das Silikon-Elastomer Basis und Härter in verschiedenen Verhältnissen (zB ein base-to-Vernetzer-Verhältnis von 10: 1 bis 36: 1.) für unterschiedliche Ziel Elastizitätsmoduli, wie zuvor dargestellt 2 </li><li> Herzustellen Silikonschläuche durch wiederholte Tauch Härtungsprozess, kurzes Eintauchen Stahlkanüle (14 g) in Silikon Prepolymermischung mit einem vorbestimmten Basis-Vernetzer-Verhältnis. </li><li> Platzieren des Präpolymeren beschichteten Kanüle in einem Ofen bei 60 ° C für 4 Stunden eingestellt, um die Polymerbeschichtung auf der Kanüle zu heilen, Umschalten der Richtung in der Mitte des Aushärtungsprozesses. </li><li> Wiederholen Sie den Tauchverfahren mit der gleichen Siliconelastomermischung und legen Sie wieder in den Ofen für weitere 4 Stunden, die in ~ 0,3 mm dicken Rohren führt. </li><li> Entfernen Sie die ultradünnen Silikonschlauch von der Edelstahlkanüle. </li><li> Schließen Rohre zu fließen Kreis statt Dämpfungskammer und Test PI für jeden, wie in 3.3. </li></ol></li></ol> 4. Pumpe Sterilisation <ol><li> Eintauchen der Strömungskammer (2), PVC-Schläuche und Dichtungen in 10% Wasserstoffperoxid (H 2 O 2). Waschen mit sterilem DI vor Schritt 4. </li><li> Legen Sie die Blutpumpe auf einem Ersatz Inkubator Regal. Anmerkung: Incubator Regalen sollten aus rostfreiem Stahl bestehen, und in der Lage, das Gewicht des gesamten Strömungskreislauf zu unterstützen. </li><li> Füllen des Strömungskreislaufs und der Behälter mit 10% H 2 O 2 durch Sicherstellung Reservoir Auslaßrohr (Pumpe) ist in Speichervolumen eingetaucht. Zirkulieren H 2 O 2 durch Pumpen durch Kreis für 20 Minuten in der Sterilbank mit UV-Licht auf. </li><li> Aspirieren Sie die gesamte H 2 O 2 aus Schlauch und mit sterilem PBS durch Pumpen durch Strömungskreislauf. </li></ol> 5. Durchflusskammeranordnung Hinweis: Die Durchflusskammer besteht aus einem Acryl, maßgeschneiderte Platte mit Vakuumöffnungen und Eintritts- und Austrittsströmungsöffnungen (siehe Abbildung 2). Kammeranordnung besteht aus der Platzierung der Flusskammer und Dichtungen auf der Oberseite des Kultur Dias, properly ausgerichtet ist, und wird nachfolgend beschrieben. <ol><li> Warm up 1% FBS / DMEM in einem 37 ° C Wasserbad und bereiten Flusskammer. <ol><li> Nehmen EG Rutsche von Medien (aus Schritt 1.13) und Ort Dichtung oben mit Zellseite nach oben. </li><li> (Optional) Nehmen Sie PC-Membran von Medien (aus Schritt 1.13) und Ort Dichtung oben mit Zellseite nach oben. Zeigen Co-Kultur-Objektträger mit gesäten SMC (Schritt 1.12.2) unter PC-Membran. </li></ol></li><li> Ausrichten Vakuumkanal der Strömungskammer mit den Löchern in der Dichtung (Figur 2). </li><li> Bringen Vakuumröhre, um Vakuumanschlüsse (Abbildung 2) zu gewährleisten, keine Medien Lecks Vakuum. </li><li> Platz Polycarbonatfolie unterhalb Glasobjektträger und Klemmströmungskammeranordnung mit Federklemmen, eine auf jeder Seite der Flusskammer (2 und 5). </li><li> Platz Strömungssystem im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2, und füllen Kreis mit Medien durch Pumpen aus gefüllten Vorratsbehälter bei niedrigen Pulsatilität.Halten Sie diese Fluss für 4 Stunden zur Vorkonditionierung Zellen. </li><li> Passen Flüssigkeitsvolumen im Dämpfungsraum um deutliche PI-Ebene, und Kultur für die gewünschte Zeit ein. </li></ol>

<ol>
	<li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves.">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2/NF-&#954;B+Pathway.">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-&#954;B Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).</li><li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Calcification:+Pathophysiology,+Epidemiology,+Imaging+Methods,+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association.">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li><li>Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+fibrosis+in+atherosclerosis.">Vascular fibrosis in atherosclerosis.</a> Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+endothelial+recovery+and+reducing+neointimal+hyperplasia+using+sequential-like+release+of+acetylsalicylic+acid+and+paclitaxel-loaded+biodegradable+stents.">Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents.</a> Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).</li><li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Remodeling+in+Hypertension+Roles+of+Apoptosis+Inflammation,+and+Fibrosis.">Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).</li><li>Greil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+carotid+artery+flow+velocities+after+stent+implantation:+a+fluid+dynamics+study+with+laser+Doppler+anemometry.">Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry.</a> J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).</li><li>Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+as+biomechanical+sensors+in+regulating+endothelial+function.">Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function.</a> Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).</li><li>Liu, S. Q., Goldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+blood+shear+stress+in+the+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+migration.">Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration.</a> IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).</li><li>Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pulsatility+flow+stimulates+smooth+muscle+cell+hypertrophy+and+contractile+protein+expression.">High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression.</a> AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).</li><li>Panaritis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatility+Index+of+Temporal+and+Renal+Arteries+as+an+Early+Finding+of+Arteriopathy+in+Diabetic+Patients..">Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients..</a> Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).</li><li>Miao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Flow+Patterns+on+the+Localization+and+Expression+of+VE-Cadherin+at+Vascular+Endothelial+Cell+Junctions:+In+vivo+and+in+vitro+Investigations.">Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations.</a> J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Wiedergabe pulsatile Strömung in vitro und können instrument erste Schritt bei der Bestimmung Beitrag der Strömungsverhältnisse um Krankheiten Pathologien. Frühere Studien unter Verwendung dieses Protokolls haben festgestellt, Strömungsverhältnisse tragen zu Gefäßentzündungsreaktion. 1, 10 Darüber hinaus dieses Protokoll ist für erfahrene Labors vorgesehen. Als solche weder eingehend Fluidmechanik und auch biochemischen Analyse wird h...

Morbiditätsraten für Herzkreislauferkrankungen sind die größten in Amerika, mit von ungesunden Gefäß viele resultieren. Gesunde Arterien bestehen aus elastischem Gewebe, mit weichen Lumenoberfläche mit einem Endothelzellen (EG) Monoschicht beschichtet. Arteriellen Blutfluss kann als eine oszillierende Wellenfunktion mit positiven mittleren Strömungsgeschwindigkeit modelliert werden. Die Pulsatilitätsindex (PI) ist der Quotient aus Schwingungs Betrag und mittlere Fließ (PI = (Max. - Min.) / Mittelwert), 1 und wurde in vitro mit variabler Gefäßelastizität modelliert 2 Arterielle Elastizität ist bei der Lagerung der Strömung wichtig. Energie von Herzkontraktionen, Dilatation unter den systolischen Druck, und spielt eine bedeutende Rolle bei der Modulation des Blutflusses PI. Weil das Herz für ein konsistentes, pulsatile, Volumenstrom erhöht arterielle Expansionsquerschnittsfläche, die Verbesserung Strömungsstabilität durch die Verringerung der Strömungsgeschwindigkeit, Schubspannung und PI. Häufig ungesunde Arterien geht auf Elastizitätoder die Einhaltung und zeigt Versteifungs von vaskulären Umbau, Narbengewebe oder Verkalkung 3, 4. Zusätzlich können andere vaskuläre Erkrankungen, wie neointimale Hyperplasie (NIH), 5 Aneurysma und Hypertonie 6 und vaskuläre Fibrose 4, Gefäßdurchmesser zu verengen. Allerdings sind die bisherigen medikamentösen Behandlung und Geräte Behandlung von Gefäßerkrankungen vernachlässigen oft die Bedeutung der Gefßwand Compliance oder Blutströmungsdynamik in vaskulären Erkrankung, die häufig durch Veränderungen der Gefäß Morphologie und Eigenschaften kompliziert. Weder Ballon-Angioplastie oder Stenting beantworten Sie die Komplikation der Wandelastizität 7. Daher fließt in vitro Modellierung von Blut von arteriellen Erkrankungen und Behandlungen resultiert, ist bei der Untersuchung von Krankheitspathologien und künftige Wirksamkeit der Behandlung wichtig. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Replikation von physiologischen und pathologischen Blutfluss zur Zellantwort in Gefäßerkrankungen pathol bestimmengien. Fluidstrom bewirkt Scherspannung an der Gefßwand, die ein wichtiges mechanisches Signal in Gefäß Gesundheit ist, die alle Zellen innerhalb des Gefäßsystems. Mehrere mechanische Sensoren an das vaskuläre Endothel zur Fluidscher identifiziert wurden, einschließlich der letzten Untersuchungen für endotheliale mechanosensing 8 gezeigten primären Zilien. Endotheliale Zell-Aktivität und Morphologie von Strömungsgeschwindigkeit, Richtung und Pulsatilität betroffen. Zusätzlich kann der glatten Muskelzellen (SMC) Migration durch mechano-Signale mit niedriger Strömungsgeschwindigkeit durch Interstitialflüssigkeit 9 beeinflusst werden, und kann auch durch die parakrine Signalisierung von Endothelzellen durch ihre Reaktion zu fließen und mechano-Transduktion von Flusssignalen via Zytokin freizugeben 10. Die &quot;Dosis&quot; Abhängigkeit der mittleren Scher, PI, und parakrine Signalisierung kann auch voneinander abhängig zu sein. Zu diesem Zweck wird die Bestimmung des Gefäßzellantwort auf Fluidscherungskupplung mit unterschiedlichen &quot;Dosieren&quot; in Monolayer-Kulturoder Co-Kultur in vitro konnten mechanistische Einblicke in die vaskuläre Remodeling und zur Verbesserung der Erkrankung und Behandlung Vorhersage. Das Flusssystem in diesem Experiment verwendet besteht aus einer Blutpumpe, einem vorgeschalteten Strömungsdämpfungsluftbehälter, einem nachgeschalteten Durchflussmesser nur während der Versuchsaufbau, einem nachgeschalteten Zellkultur, Parallelplatten-Durchflusskammer und Medienspeicher verwendet. Kontrolle der Gefäßdurchflussgrößen wie meine Durchfluss, Schläge pro Minute und PI kann durch Steuerung der Strömungsrate, Impulsfrequenz, und die Einführung der Druckdämpfung erreicht werden. Pulsierenden Blutpumpen sind mit variablen Hub Hubraum, bei kontrollierter Hubfrequenz, die sich direkt auf Volumenstrom und Impulsfrequenz bedeutet. Einführung einer Luftbehälter innerhalb des Strömungskreislaufs ermöglicht Druck Dämpfung reduziert Strömungsoszillation Größenordnung. Medium ist ein inkompressibles Fluid, während Luft in der Dämpfungskammer komprimierbar ist, so dass Überdruck von der Strömungswellen seindurch Luftkompression absorbiert. Die Luft um Medien-Verhältnis ermöglicht eine Kontrolle darüber, wie viel Dämpfung auftritt. Ein kundenspezifisches Zellkultur Durchflußkammer 75 mm Länge und 50 mm Breite wurde aus Acryl hergestellt. Strom tritt durch die Einlassöffnung und expandiert durch den Ansaugkrümmer, eine konsistente Strömung über die Gesamtheit der Strömungskammer. Ähnliche Fluss und Strukturen sind in Kammerausgang vorhanden. Zellen werden auf funktionalisierten Objektträger ausgesät und anschließend in die Strömungskammer angebracht ist. Dies ermöglicht eine große Populationen, einfach nach dem Studium abgerufen. Co-Kultur-Experimente kann eine poröse Polycarbonatmembran zu verwenden, um Zell-zu-Zell-Kontakt zwischen den Kulturen zu beseitigen und ermöglicht Zytokin / Flussverkehr. Dieses System wurde zuvor verwendet, um hohe Strömungs PI und seine Wirkung auf die endotheliale Monolayer-Kultur und EC / SMC Kokultur 1, 10 zu modellieren, um die Zellreaktion zu pathologisch hohen PI Krankheit zu untersuchen. Durch die verwendet werden, um diese Strömungs con Musterprotokoll beschreibtBedingungen, hoffen wir, andere bei der Bestimmung Flusssignal Beitrag zur Antwortzelle zu unterstützen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide (70mm x 50mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Membrane</td>
			<td>Millipore Corp.</td>
			<td>HTTP09030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>RD 475464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (25 &#956;g/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damping Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65066, 65063, 65062</td>
			<td>Various sizes may be required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Connections</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Chamber</td>
			<td>Machined in-house</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri Dish</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-14007-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Holder</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>WHE-900303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter</td>
			<td>Sonotec, GmbH</td>
			<td>Sonoflow co.55/060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 G Steel Cannula</td>
			<td>General Laboratory Supply</td>
			<td>S8365-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

Kreislauf-Erkrankungen ist eine häufige Todesursache in den Vereinigten Staaten. Hier präsentieren wir eine Methode, um den Beitrag der Strömungsdynamik in Richtung Kreislauf-Erkrankungen Erkrankungen zu untersuchen. Ungesunde Arterien oft mit Wandversteifung, Narbenbildung oder partielle Stenose, die alle betreffen können Fluiddurchflußraten, und die Größe der pulsierenden Fluss oder Pulsatilitätsindex vorhanden. Replikation von verschiedenen Strömungsbedingungen ist das Ergebnis der Abstimmung eines Strömungsdruckdämpfungskammer stromab einer Blutpumpe. Einführen von Luft in einem geschlossenen Strömungssystem ermöglicht ein kompressibles Medium auf pulsatile Druck von der Pumpe zu absorbieren und daher variieren die Pulsatilitätsindex. Das hier beschriebene Verfahren ist einfach wiedergegeben werden, mit hoch steuerbaren Eingabe und leicht messbare Ergebnisse. Einige Einschränkungen sind Erholung der komplexen physiologischen Pulswellenform, die nur durch das System angenähert wird. Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten werden durch den Blutfluss thr betroffenOugh die Arterie. Die dynamische Komponente des Blutflusses durch das Herzminutenvolumen und Arterienwand Übereinstimmung bestimmt. Gefäßzelle mechanisch-Transduktion der Strömungsdynamik kann Zytokinfreisetzung und Übersprechen zwischen Zelltypen innerhalb der Arterie auslösen. Co-Kultur von Gefäßzellen ist ein genaueres Bild reflektierenden Zell-Zell-Wechselwirkung an die Blutgefäßwand und Gefäßreaktion zur mechanischen Anzeige. Beitrag der Strömungsdynamik, einschließlich der Zelle als Antwort auf die dynamischen und mittlere (oder stationären) Strömungskomponenten, ist daher eine wichtige Metrik zu bestimmen Krankheitspathologie und die Wirksamkeit der Behandlung. Durch die Einführung eines in vitro Cokulturmodell und Druckdämpfung stromabwärts von Blutpumpe, die simulierte Herzleistung erzeugt, können verschiedene arterielle Erkrankung Pathologien untersucht werden.

Wartung der Strömungsverhältnisse ist angewiesen auf korrekte Montage des Strömungskreislauf (Abbildung 1). Schlauchdurchmesser ist ein wichtiges Auswahl in Montage, mit größeren Durchmessern Reduktionsströmungswiderstand und anschließende Druckabfall vor und nach der Kulturkammer. Um vorgesehenen Druck und Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten, montieren Sie das System mit Durchflussmesser vor dem Experiment mit bestimmt Schläuche. Ausrichtung der Kulturkammer Vakuumkanal (Abbildu...

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In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Dieses Protokoll repliziert physiologische oder pathologische Blutfluss in vitro zur Bestimmung Zellantwort bei Krankheitspathologien unterstützen. Durch Einführung einer Druckdämpfungskammer stromabwärts von einer Blutpumpe, kann die Blutströmung durch die Vaskulatur rekapituliert und auf einer Monoschicht von Gefäßendothel oder eines Mimetikums Kokultur auferlegt.

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

in-vitro-model-physiological-pathological-blood-flow-with-application

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

9.5K Aufrufe.  University of Colorado at Boulder.  Dieses Protokoll repliziert physiologische oder pathologische Blutfluss in vitro zur Bestimmung Zellantwort bei Krankheitspathologien unterstützen. Durch Einführung einer Druckdämpfungskammer stromabwärts von einer Blutpumpe, kann die Blutströmung durch die Vaskulatur rekapituliert und auf einer Monoschicht von Gefäßendothel oder eines Mimetikums Kokultur auferlegt. 

Serie: In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Forschung

Biotechnik

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

Shock Wave Anwendung auf Zellkulturen

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...