Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement, y compris les AHA (13GRNT16990019 à WT) et NHLBI (HL097246 et HL119371 à WT).

1. Silanisation et biomolécules fonctionnalisation de diapositive ou Polycarbonate Membrane Note: Beaucoup de produits chimiques et de solutions dans ce protocole ont des taux d&#39;évaporation élevés (de l&#39;éthanol (EtOH), acétone, etc.). Autres étapes impliquent des temps d&#39;incubation longs pour faible taux d&#39;évaporation. Film de paraffine est recommandé de sceller les conteneurs. Attention: Beaucoup de produits chimiques (y compris: l&#39;acide sulfurique, de l&#39;acétone, (3-aminopropyl) triéthoxysilane, glutaraldéhyde, EtOH) sont considérées comme dangereuses ou volatile. Consulter la fiche de données de sécurité (FDS) de chaque matériau pour le stockage, la manipulation et l&#39;élimination avant utilisation. <ol><li> Placez nouvelle lame de verre mesurant 75 mm par 50 mm par 1 mm, en propre, plat de coloration de lame de verre, sans égard à l&#39;orientation, assurer la pleine immersion. Utiliser un récipient pour les étapes 1.1-1.12. Remarque: Pour la co-culture, comprennent le polycarbonate (PC) membrane avec 0,4 microns la taille des pores, coupé à la taille de 75 mm par 50 mm, pour tous ste ultérieureps pour PC fonctionnalisation et l&#39;ensemencement CE. </li><li> Immergez-diapositive dans l&#39;acide sulfurique (20%), O / N. Attention: Consulter la fiche signalétique pour l&#39;acide sulfurique avant utilisation. </li><li> Laver glissière en les immergeant dans de l&#39;eau désionisée (DI) pendant 5 minutes, trois fois, en changeant chaque fois DI. </li><li> Plongez diapositive dans l&#39;acétone pendant 30 min. Attention: Consulter la fiche signalétique pour l&#39;acétone avant de l&#39;utiliser. </li><li> Plongez diapositive dans 6% (3-aminopropyl) triéthoxysilane solution / acétone O / N. Attention: Consulter la fiche signalétique pour (3-aminopropyl) triéthoxysilane et de l&#39;acétone avant de l&#39;utiliser. </li><li> Immerger diapositive dans de l&#39;acétone pendant 5 minutes, trois fois, en changeant chaque fois de l&#39;acétone. Attention: Consulter la fiche signalétique pour l&#39;acétone avant de l&#39;utiliser. </li><li> Laver par immersion dans un diaporama DI pendant 5 minutes, trois fois, en changeant chaque fois DI. </li><li> Plongez diaporama en solution glutaraldéhyde / DI de 1,5% pendant 60 min. Attention: Consulter la fiche signalétique pour glutaraldéhyde avant utilisation. </li><li> Laver par immersion dans un diaporama DI pendant 5 minutes, deux fois, en changeant chaque fois DI. </li><li> Placer la lames dans 70% d&#39;éthanol (EtOH) pendant 30 min dans stérile, hotte à flux laminaire. </li><li> Retirer de l&#39;EtOH et évaporer à permettre résidu restant. Immerger les lames en DI et le drain stérile afin de réhydrater les diapositives. Remarque: Diapositives ou une membrane de PC peut être scellé dans le support de lame de verre et conservé à 4 ° C jusqu&#39;à une semaine. Lors de l&#39;utilisation pour la culture cellulaire, répétez les étapes 1.10 et 1.11. </li><li> Retirer la lame du support de diapositives et le placer dans un 100 mm par 100 mm boîte de Pétri carrée dans la hotte à flux laminaire. Remarque: Ce récipient sera utilisé pour toutes les étapes restantes. <ol><li> Préparer diapositive ou PC pour l&#39;ensemencement des cellules endothéliales pour l&#39;expérience de la monoculture. <ol><li> Manteau de la diapositive fonctionnalisé ou PC (étape 1.11) avec 1 ml de solution de fibronectine (25 ug / ml), d&#39;un côté, recouvrant la surface approximative exposé à la chambre de culture cellulaire. </li><li> Incuber les lames ou PC dans l&#39;incubateur stérile réglé à 37 ° C pendant 1-2 heures. </li><li> Après incubation, aspirer la solution restante à l&#39;aide d&#39;un glass aspirateur pipette reliée à un vide. Remarque: Les lames peuvent maintenant être stocké O / N à 4 ° C pour une utilisation future. </li></ol></li><li> Suivre 1.12.2 étapes seulement pour la préparation d&#39;EC / SMC co-culture. Préparer et ensemencer la culture lisse cellule musculaire (SMC) pour l&#39;expérience de co-culture. <ol><li> Lieu joint en silicone sur le dessus de la glissière (étape 1.11), avec des dimensions de 75 mm sur le diamètre extérieur de 50 mm, diamètre intérieur de 50 mm par 30 mm, épaisseur de 0,5 mm, et des perforations qui alignent avec le vide de la chambre de flux. </li><li> Préparer 1 ml SMC dans 10% de FBS / DMEM suspension. Neutraliser 1 ml de solution de 2 mg / ml de collagène de type I avec 7% de NaHCO 3 et 0,1 M de NaOH solution à pH de 7,4, et mélanger avec SMC suspension avec une densité cellulaire finale de 2 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Répandre la solution SMC au sein de joint et incuber diapositives à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 min. </li><li> Après incubation, couvrir la diapositive avec du sérum 25 ml 0,1% fœtal bovin (FBS) mélangé modifié par DulbeccoEagle Medium (DMEM) pendant 72 heures. </li></ol></li></ol></li><li> Cellules endothéliales de la Culture (ECS) sur membrane lame de verre / polycarbonate. <ol><li> Graine de 1 ml EC dans 10% de FBS / DMEM, avec concentration initiale de 6,0 x 10 5 cellules / ml, sur des surfaces de fibronectine de lame de verre ou une membrane de polycarbonate. </li><li> Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C, 5% CO 2 et 10% de FBS pendant 120 minutes. </li><li> Couvrir les lames contenant des cellules avec plus de 10% de FBS / DMEM, et les placer dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2 O / N, jusqu&#39;à 70% -80% de confluence. </li></ol></li></ol> 2. Détermination de la viscosité du fluide et débit volumétrique Remarque: viscosimètres rotatifs sont des équipements sensibles, et le mode d&#39;emploi de viscosimètre devraient être consultés avant la calibration, la réduction à zéro, ou effectuer des mesures. <ol><li> Déterminer cisaillement fluide désiré (τ) de la littérature de la vascularisation ciblée de l&#39;expérience. </li><li> Measure 1% de FBS / DMEM viscosité (μ), en utilisant un viscosimètre rotatif. </li><li> Déterminer le débit volumétrique requis (Q) de l&#39;équation de Poiseuille: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> , où τ = cisaillement de fluide, μ = viscosité, Q = vol. le débit, la largeur w = chambre, et h = hauteur de la chambre). </li><li> Régler la pompe à débit dérivé dans l&#39;étape 2.3 de flux, et l&#39;utilisation pour toutes les étapes subséquentes. </li></ol> 3. Détermination de l&#39;indice pulsatilité Remarque: Tous les ports de connexion au sein du système doivent être connectés avec Barb lock-ring pour-taille appropriée, ou connexions femelles luer-à-barbe. Le raccordement de tuyaux PVC peut alors être connecté à raccords cannelés, et le circuit terminé. <ol><li> Connectez circuit d&#39;écoulement comme dans la figure 2, avec la chambre (Figure 3) et débitmètre à ultrasons d&#39;amortissement dans le sens d&#39;écoulement correct. Remarque: ultrasons débitmètre est une pièce sensible de l&#39;équipement, etle mode d&#39;emploi doit être consulté avant l&#39;utilisation. </li><li> Remplir circuit d&#39;écoulement et le réservoir avec de l&#39;eau DI, en veillant à ce tube de sortie de réservoir (la pompe) est immergée dans le volume du réservoir. Visualiser la forme d&#39;onde de débit en utilisant un débitmètre. </li><li> Ouvrez la vanne de sortie d&#39;air sur la chambre d&#39;amortissement pour changer le rapport de volume de fluide / air. Fermer valve de décharge à différents intervalles de niveau de liquide et calculer l&#39;indice de pulsatilité (PI = (V Max - V min) / V moyenne) en utilisant la forme d&#39;onde du débit de pointe (V Max), creux (V min), et la moyenne (moyenne V). Des valeurs PI record dans le cahier. </li><li> Mark résultant niveau du liquide et PI sur la chambre d&#39;amortissement, à l&#39;aide d&#39;un feutre à pointe, stylo à encre permanente pour une utilisation future. Déterminer les niveaux de PI souhaités de la pathologie la littérature 11. </li><li> Silicon Tube Formation-facultatif, méthode plus avancée de pulsatilité contrôle <ol><li> Mélanger la base d&#39;élastomère de silicone et un agent de durcissement à différents rapports (par exemple, un base rapport à agent de reticulation de 10: 1 à 36: 1.) de modules d&#39;élasticité varie ciblées, comme illustré auparavant 2 </li><li> Fabriquer des tubes de silicone répétée processus dip-cure, plongeant brièvement canule en acier (14 G) dans le mélange de prépolymère de silicone avec un rapport prédéterminé base-agent de réticulation. </li><li> Placer la canule de prépolymère revêtu dans un four réglé à 60 ° C pendant 4 heures pour durcir le revêtement de polymère sur la canule, à commuter la direction dans le milieu de processus de durcissement. </li><li> Répétez le processus de trempage avec le même mélange d&#39;élastomère de silicone et remettez au four pendant 4 heures supplémentaires, ce qui entraîne dans ~ 0,3 mm d&#39;épaisseur des tubes. </li><li> Retirer le tube de silicone ultra-mince de la canule en acier inoxydable. </li><li> Connectez tubes à l&#39;écoulement circuit au lieu de chambre d&#39;amortissement, et PI de test pour chaque en 3.3. </li></ol></li></ol> 4. Pompe Stérilisation <ol><li> Plongez la chambre d&#39;écoulement (Figure 2), un tube en PVC, et des joints en 10% de peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2). Laver avec DI stérile avant l&#39;étape 4. </li><li> Placez la pompe à sang sur une étagère de l&#39;incubateur de rechange. Remarque: Incubateur étagères doivent être en acier inoxydable, et être capable de supporter le poids de l&#39;ensemble du circuit d&#39;écoulement. </li><li> Remplir le circuit d&#39;écoulement et le réservoir avec 10% de H 2 O 2 en veillant à ce tube de sortie de réservoir (la pompe) est immergée dans le volume du réservoir. Faire circuler H 2 O 2 par pompage dans le circuit pendant 20 min dans la hotte à flux laminaire avec une lumière UV sur. </li><li> Aspirer tous H 2 O 2 à partir de tubes, et laver avec du PBS stérile par pompage à travers le circuit d&#39;écoulement. </li></ol> 5. Débit Assemblée Chambre Remarque: La chambre d&#39;écoulement se compose d&#39;un acrylique, plaque sur mesure, avec des orifices d&#39;aspiration et orifices d&#39;entrée et de flux de sortie (voir Figure 2). Ensemble de chambre consiste à placer la chambre d&#39;écoulement et les joints au-dessus des supports de culture, properly aligné, et il est décrit ci-dessous. <ol><li> Réchauffez 1% de FBS / DMEM dans un bain d&#39;eau à 37 C ° et préparer la chambre d&#39;écoulement. <ol><li> Prenez diaporama CE sur les médias (de l&#39;étape 1.13) et placez le joint sur le dessus avec le côté de la cellule vers le haut. </li><li> (Facultatif) Prenez membrane de PC sur les médias (de l&#39;étape 1.13) et placez le joint sur le dessus avec le côté de la cellule vers le haut. Placer la lame co-culture avec tête de série SMC (étape 1.12.2) sous la membrane de PC. </li></ol></li><li> Aligner canal de vide de la chambre d&#39;écoulement avec les trous dans le joint d&#39;étanchéité (figure 2). </li><li> Fixez tube à vide aux ports de vide (Figure 2) assurant aucune fuite de médias à vide. </li><li> Feuille de polycarbonate de place sous lame de verre et ensemble de chambre de flux de serrage avec pinces à ressort, un de chaque côté de la chambre de débit (figures 2 et 5). </li><li> Système de la Place de l&#39;écoulement dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2, et remplir le circuit avec les médias par pompage du réservoir rempli à basse pulsatilité.Maintenir ce flux pendant 4 heures pour le préconditionnement cellules. </li><li> Régler le volume de fluide dans la chambre d&#39;amortissement au niveau de la PI marquée, et de la culture pour le temps désiré. </li></ol>

<ol>
	<li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves.">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2/NF-&#954;B+Pathway.">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-&#954;B Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).</li><li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Calcification:+Pathophysiology,+Epidemiology,+Imaging+Methods,+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association.">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li><li>Lan, T. -. 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R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pulsatility+flow+stimulates+smooth+muscle+cell+hypertrophy+and+contractile+protein+expression.">High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression.</a> AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).</li><li>Panaritis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatility+Index+of+Temporal+and+Renal+Arteries+as+an+Early+Finding+of+Arteriopathy+in+Diabetic+Patients..">Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients..</a> Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).</li><li>Miao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Flow+Patterns+on+the+Localization+and+Expression+of+VE-Cadherin+at+Vascular+Endothelial+Cell+Junctions:+In+vivo+and+in+vitro+Investigations.">Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations.</a> J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ce protocole décrit un procédé de reproduction d&#39;écoulement pulsatile in vitro, et peut-être première étape dans la détermination instrumentale de la contribution des conditions d&#39;écoulement à des pathologies de la maladie. Des études antérieures utilisant ce protocole ont trouvé des conditions de flux contribuent à la réponse inflammatoire vasculaire. 1, 10 En outre, ce protocole est destiné aux laboratoires expérimentés. En tant que tel, ni en profondeur la mécanique des ...

Les taux de morbidité pour les maladies cardiovasculaires sont la plus grande en Amérique, avec de nombreux résultant de vascularisation malsain. Des artères saines sont constituées de tissu élastique, avec une surface luminale doux revêtu d&#39;une cellule endothéliale (CE) monocouche. Débit artériel peut être modélisée comme une fonction d&#39;onde d&#39;oscillation avec un débit moyen positif. L&#39;indice de pulsatilité (PI) est le quotient d&#39;oscillation ampleur et débit moyen (PI = (Max -. Min.) / Moyenne), 1 et a été modélisée in vitro avec élasticité variable de la cuve 2 élasticité artérielle est important dans le stockage de l&#39;écoulement. énergie des contractions cardiaques, dilatant sous pression systolique, et joue un rôle important dans la modulation de PI d&#39;écoulement de sang. Parce que le coeur maintient une approche cohérente, pulsatile, débit volumétrique, expansion artérielle augmente la zone de coupe, l&#39;amélioration de la stabilité de l&#39;écoulement en réduisant la vitesse d&#39;écoulement, contrainte de cisaillement, et PI. Fréquemment, les changements artères malsaines présentes à l&#39;élasticitéou de conformité, l&#39;affichage de raidissement remodelage vasculaire, le tissu cicatriciel ou calcification 3, 4. En outre, d&#39;autres troubles vasculaires, tels que hyperplasie néo-intimale (NIH), 5 l&#39;hypertension et l&#39;anévrisme et 6 fibrose vasculaire 4, peuvent se contracter le diamètre du vaisseau. Cependant, le traitement médicamenteux en cours et le traitement de l&#39;appareil de maladies vasculaires négligent souvent l&#39;importance du respect de la paroi de la cuve ou le débit sanguin dans la dynamique maladie vasculaire qui est souvent compliquée par des changements dans la morphologie de la cuve et des propriétés. Ni l&#39;angioplastie par ballonnet ni stenting repondre la complication de la paroi 7 élasticité. Par conséquent, la modélisation in vitro de sang flux résultant de la maladie artérielle et des traitements est important dans les enquêtes sur les pathologies de la maladie et l&#39;efficacité future du traitement. Ici, nous décrivons un procédé de réplication du flux sanguin physiologiques et pathologiques conçu pour déterminer la réponse cellulaire dans la maladie vasculaire Pathollogies. L&#39;écoulement du fluide provoque la contrainte de cisaillement à la paroi de la cuve, qui est un signal mécanique important dans la santé des vaisseaux, affectant toutes les cellules dans le système vasculaire. Plusieurs capteurs mécaniques sur l&#39;endothélium vasculaire pour le cisaillement de fluide ont été identifiés, y compris cil primaire démontré dans des études récentes pour endothéliale mechanosensing 8. L&#39;activité des cellules endothéliales et la morphologie sont affectés par la vitesse d&#39;écoulement, la direction et pulsatilité. En outre, des cellules musculaires lisses (SMC) la migration peut être affectée par mécano-signaux de circulation à faible vitesse par liquide interstitiel 9, et peut également se faire par la signalisation paracrine à partir de cellules endothéliales par leur réponse à l&#39;écoulement et mécano-transduction des signaux de débit via cytokine libérer 10. La &quot;dose&quot; dépendance de cisaillement moyen, PI, et la signalisation paracrine peut également être interdépendants. A cet effet, la détermination de la réponse cellulaire à un cisaillement fluide vasculaire avec &quot;dosage&quot; varié en culture monocoucheou co-culture in vitro pourrait fournir des indications mécanistes dans le remodelage vasculaire et d&#39;améliorer la maladie et la prédiction de traitement. Le système d&#39;écoulement utilisé dans cette expérience se compose d&#39;une pompe à sang, un réservoir d&#39;air de l&#39;écoulement d&#39;amortissement en amont, un débitmètre en aval seulement utilisée lors de la configuration expérimentale, une culture de cellules en aval, la chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles, et le réservoir de support. Contrôle des variables de flux vasculaires tels que débit moyen, battements par minute, et PI peut être atteint par le taux de contrôle de flux, la fréquence du pouls et de la pression d&#39;amortissement mise en place. Pompes à sang pulsatiles sont disponibles avec course variable déplacement, à la fréquence de course contrôlée, directement liées à signifier débit volumétrique, et la fréquence d&#39;impulsion. Introduction d&#39;un réservoir d&#39;air à l&#39;intérieur du circuit d&#39;écoulement permet un amortissement de la pression, la réduction de l&#39;oscillation d&#39;écoulement de grandeur. Media est un fluide incompressible, tandis que l&#39;air à l&#39;intérieur de la chambre d&#39;amortissement est compressible, permettant excès de pression de la vague de flux pour êtreabsorbée par compression de l&#39;air. Le rapport air des médias permet un contrôle sur la quantité de l&#39;amortissement se produit. Une chambre d&#39;écoulement de culture de cellules sur mesure 75 mm de longueur par 50 mm de largeur a été créé à partir d&#39;acrylique. Écoulement entre par l&#39;orifice d&#39;entrée, et se dilate à travers le collecteur d&#39;admission, assurer un écoulement uniforme dans la totalité de la chambre d&#39;écoulement. Flux et des structures similaires sont présents à la sortie de la chambre. Les cellules sont ensemencées sur des lames fonctionnalisées, et ensuite fixés à la chambre d&#39;écoulement. Cela permet à de grandes populations, facilement récupérés après l&#39;étude. Des expériences de co-culture peuvent utiliser une membrane de polycarbonate poreux pour éliminer le contact de cellule à cellule entre les cultures tout en permettant le transport cytokine / débit. Ce système a déjà été utilisé pour modéliser l&#39;écoulement de haute PI et son effet sur ​​la culture monocouche endothéliale et CE / SMC co-culture 1, 10, pour étudier la réponse cellulaire à la maladie de PI pathologiquement élevé. En décrivant le protocole utilisé pour modéliser ces flux conconditions, nous espérons aider les autres dans la détermination de la contribution de signal de débit à la cellule de réponse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide (70mm x 50mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Membrane</td>
			<td>Millipore Corp.</td>
			<td>HTTP09030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>RD 475464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (25 &#956;g/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damping Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65066, 65063, 65062</td>
			<td>Various sizes may be required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Connections</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Chamber</td>
			<td>Machined in-house</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri Dish</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-14007-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Holder</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>WHE-900303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter</td>
			<td>Sonotec, GmbH</td>
			<td>Sonoflow co.55/060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 G Steel Cannula</td>
			<td>General Laboratory Supply</td>
			<td>S8365-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

Maladie vasculaire est une cause fréquente de décès aux États-Unis. Ici, nous présentons une méthode pour examiner la contribution de la dynamique des flux vers les pathologies de maladies vasculaires. Artères malsaines présentent souvent raidissement de paroi, des cicatrices, ou une sténose partielle qui peuvent tous affecter les taux d&#39;écoulement des fluides, et l&#39;ampleur des flux pulsatile, ou de l&#39;indice de pulsatilité. Replication de différentes conditions d&#39;écoulement est le résultat d&#39;un réglage de la pression d&#39;écoulement en aval de la chambre une pompe à sang amortissement. L&#39;introduction d&#39;air dans un système fermé de circulation permet à un milieu compressible pour absorber la pression pulsatoire de la pompe, et donc varier l&#39;indice de pulsatilité. Le procédé décrit ici est tout simplement reproduit, avec entrée hautement contrôlable, et les résultats facilement mesurables. Certaines limitations sont reconstitution de la forme d&#39;onde d&#39;impulsion physiologique complexe, qui est seulement une approximation par le système. Les cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et les fibroblastes, sont affectées par le thr d&#39;écoulement de sangOugh l&#39;artère. La composante dynamique de la circulation sanguine est déterminée par l&#39;observation de sortie et la paroi artérielle cardiaque. Cellules vasculaires mécano-transduction de la dynamique d&#39;écoulement peut déclencher la libération de cytokines et de diaphonie entre les types de cellules dans l&#39;artère. Co-culture de cellules vasculaires est une image qui reflète plus précise interaction cellule-cellule sur la paroi du vaisseau sanguin et de la réponse vasculaire de signalisation mécanique. Contribution de la dynamique des flux, y compris la réponse des cellules aux composants dynamiques et moyennes (ou stables) de flux, est donc une mesure importante dans la détermination de la pathologie de la maladie et l&#39;efficacité du traitement. Grâce à l&#39;introduction d&#39;un modèle in vitro de co-culture et de la pression d&#39;amortissement en aval de la pompe de sang qui produit le débit cardiaque simulé, diverses pathologies de maladies artérielles peuvent être étudiées.

Maintien des conditions d&#39;écoulement est tributaire de l&#39;assemblage correct du circuit de flux (Figure 1). Le tube diamètre est important dans la sélection d&#39;un ensemble, avec des diamètres plus grands réduire la résistance d&#39;écoulement et la chute de pression subséquente, avant et après la chambre de culture. Pour assurer la vitesse de pression et de débit destiné, assembler le système avec débitmètre avant l&#39;expérience avec des tubes destinés. Align...

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In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Ce protocole se réplique du flux sanguin physiologique ou pathologique in vitro pour aider à déterminer la réponse des cellules dans des pathologies de la maladie. En introduisant une pression en aval de la chambre une pompe à sang amortissement, le flux sanguin à travers le système vasculaire peut être récapitulé et prélevée sur une monocouche de l&#39;endothélium vasculaire ou une co-culture mimétique.

Modèle in vitro de physiologiques et pathologiques Blood Flow avec application aux enquêtes de cellules vasculaires Rénovation

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

9.5K vues.  University of Colorado at Boulder.  Ce protocole se réplique du flux sanguin physiologique ou pathologique in vitro pour aider à déterminer la réponse des cellules dans des pathologies de la maladie. En introduisant une pression en aval de la chambre une pompe à sang amortissement, le flux sanguin à travers le système vasculaire peut être récapitulé et prélevée sur une monocouche de l'endothélium vasculaire ou une co-culture mimétique. 

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel tridimensionnelle chambre d&#39;écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d&#39;écoulement physiologiques

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

Shock Wave application cultures cellulaires

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingénierie tissulaire de la tumeur stromale Microenvironnement avec application de Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

Cellulaire in vitro modèle de culture pour le contrôle des produits chimiques toxiques inhalés

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

A microfluidique débit Chambre Modèle pour Platelet Transfusion et Hémostase mesures Platelet Déposition et la formation de fibrine en temps réel

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...