المخدرات تقارب استجابة الاستقرار المستهدف، DARTS، هو وسيلة قوية للكشف عن أهداف البروتين جزيء صغير رواية. ويمكن استخدامه للتحقق من التفاعلات المعروفة للبروتينات الصغيرة الجزيء والعثور على أهداف البروتين المحتملة للمنتجات الطبيعية. في هذه الدراسة، ونحن زيادة تعزيز قدرات تحليل البيانات من تجربة السهام من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين وتقدير تقارب التفاعلات البروتين ligand.
يمكن رسم التفاعلات البروتين ligand ضد اثنين من المنحنيات، منحنى البروتينية ومنحنى الاعتماد على الجرعة. لقد استخدمنا التفاعل mTOR-rapamycin كحالة مثالية لإنشاء بروتوكول لدينا. تنمو الخلايا 293T باستخدام DMEM مع 10٪ مصل الأبقار الجنينية, الجلوتامين مليمولار, و 1٪ المضادات الحيوية.
احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الثقافة إلى 80 إلى 90٪ التقاء، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني الباردة. استخدام مكشطة الخلية لجمع الخلايا في كمية مناسبة من خلية الباردة تحلل العازلة ونقل الخلايا التحلل في أنبوب 1.5 ملليمتر.
عكس لخلط العازلة تحلل وخلايا lysing جيدا واحتضان أنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 18،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. نقل المابير في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر والحفاظ على المبردة على الجليد.
أداء BCA المقسّم إلى تقريب تركيز البروتين من اللساتات وحساب تخفيف pronase على أساس تركيز البروتين. أولاً، نقل الـ lysate إلى أنبوبين 1.5 ملليلتر، 99 ميكرولترر لكل منهما. إضافة ميكرولتر واحد من محلول الأسهم جزيء صغير إلى كل aliquot من lysate واحتضان أنبوبين لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز.
على الجليد، وإنشاء المخففات المسلسل من محلول pronase المذاب حديثا في 1x TNC. بعد الحضانة مع جزيء صغير، وتقسيم كل aliquot إلى 20 ميكرولترات من العينات في خمسة أنابيب. لضمان نفس الوقت الهضم، على فترات محددة من كل 30 ثانية، إضافة اثنين microliters من حلول pronase أعدت للعينات وفقا لذلك.
لمجموعة التحكم واحدة، إضافة اثنين microliters من المخزن المؤقت عبر الوطنية. بعد خمس إلى 20 دقيقة ، أوقف هضم الأنابيب الستة عن طريق إضافة اثنين من microliters من كوكتيل مثبطات البرودة 20x protease على فترات 30 ثانية. تخلط جيدا واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
تخفيف كل عينة مع ستة ميكرولترات من 5x SDS-PAGE تحميل العازلة وغلي العينات في حمام مائي في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الآن، لأداء لطخة الغربية، تحميل كميات متساوية من البروتين في آبار هلام 8٪ SDS-PAGE، جنبا إلى جنب مع علامة الوزن الجزيئية المناسبة. تشغيل الجل لمدة 30 دقيقة في 80 فولت، ثم ضبط الجهد إلى 120 فولت ومواصلة تشغيل لمدة ساعة إلى ساعتين.
تحقق من أن الجزيء الصغير يمكن أن يرتبط مباشرة بالبروتينات المستهدفة المحتملة. في هذا البروتوكول، الحضانة مع جزيء صغير أكد الحماية ضد تحلل البروتين. وتبين أن ثلاث نطاقات محمية بالاحتضان مع الراباميسين على مراقبة المركبات.
وأوضح النشاف الغربية وجود بروتين mTOR في البروتين منخفضة إلى نسب البروتين والحد منه والخسارة مع زيادة النسب. Proteolysis من mTOR بواسطة pronase كان من الواضح أن منعت من وجود rapamycin وإضافة rapamycin ولدت تحولا واضحا في منحنى proteolytic. Rapamycin الجرعة تعتمد على تعزيز مستوى mTOR, مما يشير إلى ارتفاع استقرار mTOR مع العلاج راباميسين.
ويشير القياس الكمي لكثافات نطاق البروتين المستهدف إلى أن mTOR هو البروتين المستهدف للراباميسين. من أجل الحصول على أفضل تأثير متدرج، قد يكون لهذه التجربة أن تتكرر عدة مرات للحصول على مجموعة مناسبة من pronase على نسب البروتين.
