Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.

Attenzione: consultare le schede di sicurezza (SDS) di tutte le sostanze chimiche coinvolte prima dell&#39;uso. L&#39;esperimento screening di stupefacenti prevede la sintesi e la manipolazione dei nanomateriali, che possono avere rischi aggiuntivi rispetto alla loro controparte massa. Si prega di verificare le misure di controllo necessarie per essere praticato tutto l&#39;esperimento, compreso l&#39;uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (DPI, ad esempio, i pantaloni di lunghezza di sicurezza, scarpe chiuse, guanti resistenti ai prodotti chimici, e occhiali di protezione). 1. Preparazione dei reagenti chimici per lo screening Drug <ol><li> Precursori per la sintesi Au NC <ol><li> Disciogliere 30 mg di soluzione di oro (III) cloruro (99,99% base oligometalli, 30 wt.% In HCl diluito) in 6,9 ml di acqua ultrapura per preparare 15 mM di oro (III) di cloruro. Attenzione: soluzione di cloruro d&#39;oro è corrosivo e irritante. Indossare corretto DPI per evitare il contatto diretto con gli occhi e la pelle. </li><li> Dissolve 74 mg di HSA o BSA in 1 ml di acqua ultrapura per preparare 74 mg / ml di proteine ​​soluzione madre. </li></ol></li><li> Soluzioni di droga <ol><li> Sciogliere la quantità desiderata di farmaco, per esempio, 1,9 mg per (a) ibuprofene, 2.8 mg di (b) warfarin, 2,3 mg di (c) fenitoina, e 1,5 mg per (d) sulfanilamide in 20 ml di DMSO per preparare 450 mM di soluzioni droga azionari. Nota: DMSO viene selezionato come solvente perché questi farmaci sono idrofobi e hanno scarsa solubilità in acqua. </li></ol></li><li> Altri reagenti <ol><li> Sciogliere 600 mg di pellet NaOH in 10 ml di acqua ultrapura per preparare 1,5 M di NaOH. Sciogliere 2.4 g di urea in 2 ml di acqua ultrapura per preparare 20 M di soluzione di urea. </li></ol></li></ol> 2. Sintesi di proteine ​​Templated Au NC <ol><li> HSA-su modelli Au NC (HSA-Au NC) <ol><li> Inserire due fiale di vetro, ognuno contenente un micro ancoretta magnetica in esso, su due separata della temperatura controllabile ancoretta magneticaRERS. </li><li> Impostare la temperatura di un agitatore magnetico a 60 ° C, ed etichetta la fiala di vetro su di essa come &quot;60 ° C&quot;; mentre l&#39;altro agitatore magnetico viene mantenuta a temperatura ambiente (RT) in cui il flacone di vetro su di esso è etichettato come &quot;RT&quot;. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di HSA, 200 ml di acqua ultrapura, e 200 ml di soluzione di oro (III) cloruro di ciascuna fiala sotto agitazione costante (impostata come 360 ​​rpm se non diversamente specificato) per consentire l&#39;incapsulamento di ioni Au all&#39;interno del modello della proteina. </li><li> 2 minuti più tardi, aggiungere 20 ml di soluzione di NaOH ad ogni flacone in modo da attivare la capacità di ridurre HSA nel formare Au NC e iniziare a registrare il tempo di reazione come 0 min. </li><li> Ogni 20 minuti, 50 ml di disegnare soluzioni da ciascuno del campione ad una piastra nera 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione con un lettore di micropiastre. La configurazione tipica di scansione: λ = 370 nm ex, λ em = 410-850 nm. </li><li> Arrestare il agitatore magnetico dopo 100 min. </li><li> Raffreddare i flaconi di vetro sotto l&#39;acqua corrente in un lavandino. Attenzione: le fiale di vetro sono caldi. Indossare guanti resistenti al calore per evitare di bruciare. </li><li> Tracciare gli spettri di fotoemissione a tutto il tempo per ciascun campione di acquisire la cinetica di formazione di Au NC a diverse condizioni di temperatura. </li></ol></li><li> BSA-su modelli Au NC (BSA-Au NC) <ol><li> Inserire una fiala di vetro contenente un micro ancoretta magnetica sulla sommità di un agitatore magnetico. Lasciare la temperatura come temperatura ambiente. </li><li> Miscelare 200 ml di soluzione di BSA, 200 ml di urea, e 200 ml di soluzione di oro (III) cloruro nel flaconcino di vetro sotto costante agitazione. </li><li> 2 minuti più tardi, aggiungere 20 ml di soluzione di NaOH per attivare la capacità riducente di BSA per formare Au NC e iniziare a registrare il tempo di reazione come 0 min. Misurare lo spettro di fotoemissione della miscela di reazione oraria. Nota: Lo spettro di fotoemissione di BSA-Au NC è misuratameno frequentemente perché il tasso di formazione BSA-Au NC è più lenta di quella di HSA-Au alla stessa temperatura a causa della minore efficacia di urea a svolgersi proteina. </li><li> Fermare l&#39;agitatore magnetico dopo 7 ore. Tracciare gli spettri di fotoemissione a tutti il ​​tempo di vedere la cinetica di formazione dei Au NC da urea denaturazione. </li></ol></li></ol> Screening 3. Piccolo Drug molecolare <ol><li> Schermata relativa affinità di legame di diversi farmaci piccola molecolari per HSA <ol><li> Posizionare cinque fiale di vetro, ciascuna contenente una ancoretta magnetica in esso, in cima ad una temperatura controllabile multipunto agitatore magnetico. Etichettare queste fiale come a, b, c, d, rispettivamente, per ciascun farmaco, vale a dire l&#39;ibuprofene, il warfarin, fenitoina, e sulfanilamide. Etichettare quello con HSA puro come controllo. </li><li> Aggiungere 200 ml di HSA ad ogni flacone. Aggiungere 1 ml di soluzione medicinale ai quattro fiale corrispondenti. Aggiungere 1 ml di DMSO al controllo. Accendere l&#39;agitatore e impostare la velocità di centrifuga a 360rpm e incubare per 1 ora per consentire il legame di HSA droga per completare. </li><li> 1 ora dopo, aggiungere 200 ml di acqua Milli-Q e 200 ml di soluzione di oro (III) cloruro di ciascuna fiala sotto costante agitazione. Impostare la temperatura a 60 ° C sotto costante agitazione per 10 min. Aggiungere 20 ml di NaOH 1,5 M a ciascuna fiala e iniziare a registrare il tempo di reazione come 0 min. </li><li> Disegnare rapidamente 50 ml di soluzione da ogni flaconcino a un piatto nero 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione (risultati etichettati come 0 min). Registra gli spettri di emissione di ciascun campione ogni 10 min. Raccogliere almeno quattro spettri a quattro tempi diversi, cioè 0, 10, 20 e 30 min. </li><li> Ripetere i punti 3.1.1 - 3.1.4 più volte per ottenere risultati con un trend costante. Arrestare il agitatore magnetico. </li><li> Tracciare la fotoemissione spettri risolta in tempo per ogni campione (a - d, e controllo). Identificare l&#39;intensità massima di tutti i campioni e complotto contro il tempo per confrontare la cinetica di formazione dei Au NC a dimodelli di proteina-droga caricata fferent. </li></ol></li><li> Misurare la costante di legame di un farmaco specifico per HSA <ol><li> Ripetere i punti 3.1.1 - 3.1.4. Sostituire la soluzione farmaco con soluzioni ibuprofene a quattro diverse concentrazioni (tra cui un campione di controllo utilizzando HSA solo senza droga carico). Etichettare il flacone di vetro secondo la concentrazione di farmaco corrispondentemente. </li><li> 10 minuti più tardi, raffreddare i flaconi di vetro sotto l&#39;acqua corrente in un lavandino. Attenzione: le fiale di vetro sono caldi. Indossare guanti resistenti al calore per evitare di bruciare. </li><li> Disegna 50 ml di soluzioni sopra di ogni fiala per un piatto nero 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione. </li><li> Ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.3 altre due volte per ottenere altre due serie di risultati a diverse concentrazioni del farmaco. </li><li> Arrestare il agitatore magnetico. Tracciare gli spettri di fotoemissione e analizzare i risultati. <ol><li> Per i dati grezzi ottenuti in ciascun lotto, tracciare gli spettri di fotoemissione di ciascuncampione in software come software OriginPro e scoprire l&#39;intensità di picco. </li><li> Calcolare e tracciare l&#39;intensità di fluorescenza relativa [(I 0 - I) / I 0] contro la concentrazione del farmaco, dove io e mi riferisco a 0 l&#39;intensità di fluorescenza di ragazza NC formato in-droga caricato HSA e puro HSA, rispettivamente. </li><li> Calcolare la costante di legame inserendo i dati in un unico luogo di modello di legame utilizzando l&#39;equazione di Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), dove R max indica il segnale di risposta massima, C è la concentrazione di ligando e K D è la costante di legame. Eseguire questo software come OriginPro. Selezionare il menu di analisi non lineare Montaggio Adattamento curva, quindi selezionare la funzione Hill Crescita / categoria sigmoidale. Nella Impostazioni: pagina di selezione funzione, fare clic su Adatta a mostrare i risultati a muro. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Solution-Based+Medicinal+Library+Screening+against+Human+Serum+Albumin.">High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin.</a> Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).</li><li>Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Analytical+Strategy+to+Measure+Drug&#8211;Plasma+Protein+Interactions:+From+High-Throughput+to+In-Depth+Analysis.">Global Analytical Strategy to Measure Drug&#8211;Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis.</a> Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).</li><li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdomain+Ib+Is+The+Third+Major+Drug+Binding+Region+of+Human+Serum+Albumin:+Toward+The+Three-Sites+Model.">Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model.</a> Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).</li><li>Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine-NMR+Experiments+for+High-Throughput+Screening:+Theoretical+Aspects,+Practical+Considerations,+and+Range+of+Applicability.">Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).</li><li>Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).</li><li>Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Design+of+Diflunisal+Analogues+with+Reduced+Affinity+for+Human+Serum+Albumin.">Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin.</a> J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+NMR-Based+Screening+with+Competition+Binding+Experiments.">High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).</li><li>Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correspondence+of+Fatty+Acid+and+Drug+Binding+Sites+on+Human+Serum+Albumin:+A+Two-Dimensional+Nuclear+Magnetic+Resonance+Study.">Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study.</a> Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).</li><li>Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Magnetic+Resonance+of+Hyperpolarized+Fluorine+for+Characterization+of+Protein&#8211;Ligand+Interactions.">Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein&#8211;Ligand Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).</li><li>Salvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boosting+the+Sensitivity+of+Ligand&#8211;Protein+Screening+by+NMR+of+Long-Lived+States.">Boosting the Sensitivity of Ligand&#8211;Protein Screening by NMR of Long-Lived States.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).</li><li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+Dichroism+Spectroscopic+Detection+of+Ligand+Binding+Induced+Subdomain+IB+Specific+Structural+Adjustment+of+Human+Serum+Albumin.">Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).</li><li>Navratilova, I., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment+Screening+by+Surface+Plasmon+Resonance.">Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance.</a> ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Phase+SPR+Biosensor+for+Efficient+Targeted+Drug+Screening+with+High+Sensitivity+and+Stability.">Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability.</a> Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).</li><li>Lu, Y., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-Nanometre+Sized+Metal+Clusters:+From+Synthetic+Challenges+to+The+Unique+Property+Discoveries.">Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).</li><li>Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+Engineering+and+Controlled+Conversion+for+The+Synthesis+of+Monodisperse+Thiolate-Protected+Metal+Nanoclusters.">Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters.</a> Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).</li><li>Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Sized,+Thiolate-Protected+Gold+Nanoclusters.">Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters.</a> Nanoscal. 2, 343-362 (2010).</li><li>Jiang, D. -. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expanding+Universe+of+Thiolated+Gold+Nanoclusters+and+Beyond.">The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond.</a> Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).</li><li>Aikens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+Structure+of+Ligand-Passivated+Gold+and+Silver+Nanoclusters.">Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters.</a> J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).</li><li>Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+Activities+of+Subnanometer+Gold+Clusters+(Au16&#8211;Au18,+Au20,+and+Au27&#8211;Au35)+for+CO+Oxidation.+ACS.">Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16&#8211;Au18, Au20, and Au27&#8211;Au35) for CO Oxidation. ACS.</a> ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).</li><li>Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-Protected+Gold+Clusters+Revisited:+Bridging+the+Gap+between+Gold(I)&#8722;Thiolate+Complexes+and+Thiolate-Protected+Gold+Nanocrystals.">Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)&#8722;Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).</li><li>Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+the+Crystal+Structure+of+A+Thiol-Protected+Au25+Cluster+and+Optical+Properties.">Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Highly+Luminescent+Au22(SG)18+Nanocluster.">Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster.</a> J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+at+the+Core&#8211;Ligand+Interface+of+Au+Lipoic+Acid+Nanoclusters+That+Enhances+the+Near-IR+Luminescence.">Oxidation at the Core&#8211;Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence.</a> J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).</li><li>Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Atomic-Level+Strategy+for+Unraveling+Gold+Nanocatalysis+from+the+Perspective+of+Aun(SR)m+Nanoclusters.">An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters.</a> Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).</li><li>Niesen, B., Rand, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Film+Metal+Nanocluster+Light-Emitting+Devices.">Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices.</a> Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).</li><li>Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-Small+Fluorescent+Metal+Nanoclusters:+Synthesis+and+Biological+Applications.">Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications.</a> Nano Toda. 6, 401-418 (2011).</li><li>Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+Near-Infrared+Gold+Nanoclusters+for+Tumor+Fluorescence+Imaging+in+Vivo.">Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo.</a> Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).</li><li>Archana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-Receptor-Specific,+Non-Toxic,+Near-Infrared-Emitting+Au+Cluster-Protein+Nanoconjugates+for+Targeted+Cancer+Imaging.">Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging.</a> Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).</li><li>Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-Assisted+Synthesis+of+BSA-Protected+Small+Gold+Nanoclusters+and+Their+Fluorescence-Enhanced+Sensing+of+Silver(I)+Ions.">Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions.</a> Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).</li><li>Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+Nanocluster+Based+Fluorescent+Sensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Cyanide+in+Water.">Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water.</a> 20, 951-1907 (2010).</li><li>Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+Tumor+Targeting+of+Renal-Clearable+Luminescent+Gold+Nanoparticles:+Long+Tumor+Retention+and+Fast+Normal+Tissue+Clearance.">Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).</li><li>Negishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Loading+of+Small+Aun+Clusters+(n+=+10&#8211;39)+onto+BaLa4Ti4O15+Photocatalysts:+Toward+an+Understanding+of+Size+Effect+of+Co-Catalyst+on+Water+Splitting+Photocatalytic+Activity.">Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10&#8211;39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity.</a> J. Phys. Chem. C. , (2015).</li><li>Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Directed+Synthesis+of+Highly+Fluorescent+Gold+Nanoclusters.">Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).</li><li>Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Stability+Induced+by+Ligand+Binding+Correlates+with+Changes+in+Protein+Flexibility.">Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility.</a> Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+Analysis+of+Ligand-Induced+Changes+in+Protein+Thermal+Unfolding+Applied+to+High-Throughput+Determination+of+Ligand+Affinities+with+Extrinsic+Fluorescent+Dyes.">Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes.</a> Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).</li><li>Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Based+Fluorescent+Metal+Nanoclusters+for+Small+Molecular+Drug+Screening.">Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening.</a> Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).</li><li>Shortridge, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ci sono diversi passaggi critici che devono essere evidenziate in questo metodo. Nel protocollo di screening della affinità di legame relativo dei diversi farmaci molecolari piccoli passi 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e sono fondamentali per ottenere buoni risultati mostrano tendenza coerente per la forza vincolante relativa. In queste fasi, le azioni di aggiunta di sostanze chimiche e disegno di soluzioni di reazione per la misura dovrebbe essere il più rapidamente possibile per minimizzare l&#39;effetto ritardo e la stessa se...

Albumine siero come albumina sierica umana (HSA) e albumina di siero bovino (BSA) sono la proteina più abbondante nel plasma e svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della pressione osmotica del comparto sangue. Sono inoltre riconosciuti come proteine ​​di trasporto per le piccole molecole di bassa solubilità in acqua, come gli steroidi, acidi grassi, ormoni tiroidei, e una vasta gamma di farmaci. L&#39;associazione di proprietà (ad esempio, siti di legame, affinità o la forza vincolante) di queste molecole di siero albumine costituisce un tema importante nella farmacocinetica. 1-4 diversi metodi analitici sono stati sviluppati per studiare le proprietà di legame dei farmaci diversi per siero albumine, come ad esempio cristallografia a raggi X, risonanza magnetica nucleare 5,6 (NMR), 7-11 e risonanza plasmonica superficiale (SPR), 12,13 etc. Tuttavia, questi metodi sono vincolate mediante un processo di analisi noioso e che richiede tempo (ad esempio, la crescita del monocristallo per X-ray Crystallostudio grafico), requisito di attrezzature specializzate e costose (SPR), o che necessitano di marcatura isotopica costosi (NMR) per la rilevazione. E &#39;quindi altamente auspicabile sviluppare modalità alternative per lo screening piccolo farmaco molecolare in un modo veloce, straight-forward, ed economicamente efficiente. Nanocluster oro (Au NC) sono un tipo speciale di nanomateriali, che contengono diverse decine di atomi di metallo con dimensioni inferiori a 2 nm. 14-17 hanno attirato ampi interessi di ricerca a causa della loro struttura elettronica discreta e dimensione-dipendente, 18, 19 e molecolare come assorbimenti ed emissioni. 20-23 Tali proprietà materiali unici, in particolare una forte fluorescenza, hanno trovato diverse applicazioni come il rilevamento e l&#39;imaging in sistemi biologici. 24-32 Ultrasmall fluorescente Au NC può essere sintetizzato utilizzando proteine ​​funzionali, quali albumine siero, come modello. 33 In una tipica sintesi delle proteine-su modelli di<html> Au NC, una certa quantità di sali Au vengono prima incapsulati all&#39;interno della proteina e successivamente ridotta di proteina stessa. La capacità riducente della proteina è attribuita a costituente residui amminoacidici funzionali (ad esempio, tirosina) che possono essere attivati ​​aumentando il pH della soluzione ad alcalino. Dispiegarsi della struttura delle proteine ​​è considerato come un passo fondamentale per la formazione di Au NC. Questo perché in una proteina unfolded, più gruppi funzionali riducenti possono essere esposti ai sali Au incapsulati. Protein dispiegarsi può essere ottenuto mediante trattamento termico o esposizione ad agenti denaturanti. Introduzione di piccoli farmaci molecolari può anche interessare il processo di svolgimento, cioè modificando la temperatura di denaturazione punto medio e l&#39;entalpia di svolgimento. 34,35 L&#39;effetto di tutti questi fattori, a sua volta può essere riflessa dalla cinetica di formazione dei fluorescenti Au NC e si manifesta in l&#39;intensità di fluorescenza di risultanti Au NC. 36 e_content &quot;&gt; Questo video illustra il metodo di selezione della droga sintetizzando Au NC in proteine ​​albumina droga caricata ad una temperatura superiore (60 ° C) o in presenza di agenti denaturanti (ad esempio, urea). L&#39;intensità di fluorescenza della risultante Au CN è la lettura del segnale. Innanzitutto, Au NC sono sintetizzati nei modelli HSA e BSA trattati a 60 ° C o in presenza di urea per mostrare come proteina dispiegarsi (indotta mediante trattamento termico o denaturanti) influenza la cinetica di formazione di Au NC. In secondo luogo, Au NC sono sintetizzati nei modelli di proteine ​​precaricato con diversi farmaci, e l&#39;effetto della droga carico sui intensità di fluorescenza relativi dei risultante Au NC è studiato, che forniscono la misura della forza vincolante relativa. Infine, il protocollo di screening Au NC-farmaco viene modificato per misurazione quantitativa di farmaco-proteina legante costante (K D) variando il contenuto di farmaco precaricato nella proteina di una concentrazione fissa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484385</td>
			<td>Corrosive, irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin, 96%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin, 96%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibuprofen, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4883&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warfarin, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenytoin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulphanilamide, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RT5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL air displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL air displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL air displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5000 mL Eppendorf tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Eppendorf tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL Eppendorf tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vial with screw cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL glass vial with screw cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and quantitative fluorimetric method for protein-targeting small molecule drug screening

Si dimostra un nuovo metodo di screening di farmaci per determinare l&#39;affinità di legame di piccole molecole farmaceutiche per una proteina bersaglio formando nanocluster fluorescenti oro (Au NC) all&#39;interno della proteina-droga caricata, sulla base del segnale di fluorescenza emessa dal differenziale Au NC. Proteine ​​albumina come l&#39;albumina sierica umana (HSA) e albumina sierica bovina (BSA) sono selezionati come le proteine ​​modello. Quattro piccole farmaci molecolari (ad esempio, l&#39;ibuprofene, il warfarin, fenitoina, e sulfanilamide) di diverse affinità di legame alle proteine ​​albumina sono testati. Si è constatato che il tasso di formazione di fluorescenti Au CN all&#39;interno farmaco caricata albumina in condizioni denaturanti (cioè, 60 ° C o in presenza di urea) è più lenta di quella formata nella proteina intatta (senza farmaci). Inoltre, l&#39;intensità fluorescente del CN ​​come formata è risultato essere inversamente correlato alle affinità di legame di questi farmaci alle proteine ​​albumina. In particolare,maggiore è l&#39;affinità di legame farmaco-proteina, più lenta è la velocità di formazione Au NC, e quindi una minore intensità di fluorescenza della risultante Au NC viene osservata. L&#39;intensità di fluorescenza della risultante Au NC fornisce quindi una misura semplice della forza di legame relativa di diversi farmaci testati. Questo metodo è anche estensibile per misurare la costante legame specifico farmaco-proteina (K D) semplicemente variando il contenuto droga precaricato nella proteina ad una concentrazione proteica fissa. I risultati misurati corrispondono bene con i valori ottenuti con altri metodi di prestigio ma più complicati.

Protein dispiegarsi un importante metodo per la formazione di proteina-templated Au NC perché gruppi funzionali più reattivi (per esempio, residui di tirosina di una proteina) possono essere esposti per ridurre gli ioni Au incapsulati e accelerare il tasso di formazione di Au NC così. Agenti di riscaldamento e di denaturazione esterno sono due mezzi comuni per promuovere il processo di svolgimento delle proteine. La Figura 1 mostra l&#39;effetto di riscaldamento e l&#39;aggiunta di agenti di...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening at JoVE.com

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

a-rapid-quantitative-fluorimetric-method-for-protein-targeting-small

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Views.  Agency for Science, Technology and Research (A*STAR). A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine Targeting