Name: generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis at JoVE.com

وكان هذا العمل supportedby الأمريكية سرطان جمعية أبحاث علماء جرانت (RSG-12-148-01-DDC) وجائزة البيولوجيا CIRM الأساسية (RB4-05779).

تم تنفيذ بروتوكول جلد الإنسان وفقا للمبادئ التوجيهية للجامعة كاليفورنيا، جنة أخلاقيات البحوث سان دييغو. ويمكن الحصول على جلد الإنسان من العينات الجراحية التخلص منها أو شراؤها من البنوك الجلد (يتم سرد بنك الجلد في جدول المواد / المعدات). الموقع حيث يتم اشتقاق الجلد من أو سن المتبرع ليست حرجة إلى التجربة طالما أن البروتينات منطقة الغشاء القاعدي (الكولاجين / laminin) في الأدمة ليست متدهورة. 1. إعداد ممات الأدمة الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند استلام جلد الإنسان، ووضع الأنسجة في نسيج الثقافة هود لذوبان الجليد (~ 3-5 دقيقة). اعتمادا على حجم الجلد، ووضع الأنسجة إذابة في التخلص منها 50 مل أنبوب مخروطي معقمة أو 125 مل زجاجة. حجم نموذجية من الجلد من البنك الجلد هو 0.75 قدم مربع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حاوية 75٪ كاملة مع البنسلين والستربتومايسين 4X (القلم / بكتيريا) في برنامج تلفزيوني 1X. هزة بقوة ل5 دقائق والتخلص من السائل. كرر هذه الخطوة 3 مرات أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الماضي، ونقل الأنسجة لأنبوب جديد / زجاجة وإضافة 4X جديد القلم / بكتيريا / PBS لملء 75٪ من الحاويات. احتضان هذا الخليط في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع للسماح للفصل الأدمة من البشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت ظروف معقمة، واستخدام ملقط لقشر بعيدا البشرة من الأدمة. الأدمة بيضاء تماما في حين أن البشرة سيكون التلوين اعتمادا على السباق من الجهة المانحة (الشكل 1A). تجاهل البشرة وفقا لبروتوكول المؤسسة للتعامل مع الأنسجة البشرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأدمة في أنبوب أو زجاجة، وأغسلها في 4x والقلم / بكتيريا مخففة في برنامج تلفزيوني 1X مع قوية تهز (5 دقائق يغسل لمدة 4 مرات). بعد غسل الماضي، ونقل الأدمة إلى أنبوب جديد / زجاجة في 4X القلم / بكتيريا مخففة في برنامج تلفزيوني 1X وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. ويمكن تخزين الأدمة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل الى عام. </li></رأ&gt; 2. وراثيا التعديل الابتدائية الخلايا الكيراتينية الإنسان ملاحظة: استخدام الخلايا طائر الفينيق amphotropic تزرع في كامل وسائل الاعلام DMEM [DMEM + 10٪ الجنين مصل بقري (FBS) + القلم / بكتيريا] لإنتاج فيروسات أن تصيب الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية. يتم دمج الجينات التعبئة والتغليف الفيروسية التي ترميز البروتينات مثل هفوة-POL والظرف مستقر في جينوم الخلية طائر الفينيق الذي يسمح لإنتاج فيروس عندما مع transfected متجه فيروسات. خلايا طائر الفينيق يمكن مع transfected كفاءة عالية تتيح لإنتاج عالية عيار الفيروسية. فيروس تنتج من هذا خط التعبئة والتغليف ويمكن أيضا أن تصيب مجموعة كبيرة ومتنوعة من خلايا الثدييات بما فيها الإنسان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 1: قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، وخلايا طائر الفينيق البذور في لوحة 6 جيدا في مناطق ذات كثافة من 800،000 الخلايا لكل بئر في كامل وسائل الاعلام DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2: يوم ترنسفكأيشن، استخدام 3 ميكروغرام من ناقلات فيروسات لكل بئر. قسامة 3 ميكروغرام من ناقلات فيروسات في أنبوب 1.5 مل. استخدام مزيج من 100 μ؛ ل DMEM زائد 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن لكل 3 ميكروغرام من ناقلات. مزيج 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مع 100 ميكرولتر DMEM في أنبوب 1.5 مل. (يتم سرد ناقلات فيروسات التي تستخدم في الجدول المعدات / المواد). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 5 دقائق ويضاف خليط 106 ميكرولتر في الأنبوب قبل aliquoted تحتوي على ميكروغرام 3 ناقلات فيروسات. خلط واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة. إضافة هذه قطرة قطرة الخليط كله إلى كل بئر من الخلايا طائر الفينيق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 3: بعد يوم واحد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائل الإعلام من الخلايا طائر الفينيق وإضافة 2 مل من اكتمال جديدة وسائل الاعلام DMEM. وفي اليوم نفسه، البذور الكيراتينية الإنسان الأساسية في 6 لوحات جيدة في كثافة 75،000 الخلايا لكل بئر. الحفاظ على الخلايا الكيراتينية في وسط مصل خلية كيراتينية مجانا (KCSFM) مع المضادات الحيوية (القلم / بكتيريا). ملاحظة: تم شراؤها الكيراتينية الإنسان الأساسية. الخلايا يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من البائعين (المدرجة في جدول المواد / المعدات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 4: هارسترة وسائل الإعلام من الخلايا transfected طائر الفينيق، الذي يحتوي الآن الجسيمات الفيروسية. تمر وسائل الإعلام من خلال 0.45 ميكرون التصفية باستخدام حقنة (لإزالة أي خلايا طائر الفينيق تلويث) وضعت 2 مل على الخلايا الكيراتينية (مطلي على 75000 خلية / جيدا في اليوم السابق: راجع الخطوة 2.3). إضافة بروميد hexadimethrine (5 ميكروغرام / مل) إلى وسائل الإعلام للمساعدة في التوسط في عملية العدوى. التتر الفيروسية ~ 1 × 10 7 TU / مل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور 6 لوحات جيدا في جهاز للطرد المركزي في 200 x ج لمدة 1 ساعة على RT. بعد زيادة ونقصان، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على فيروسات وغسل خلايا مرة واحدة مع 1X PBS قبل إضافة KCSFM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 5: تصيب نفس دفعة من الخلايا القرنية مرة أخرى كما في الخطوة 2.4. ملاحظة: حدد الخلايا القرنية باستخدام دواء إذا كان هناك علامة اختيار على ناقلات فيروسات وتوسيع لاستخدامها في تحليل المصب أو التطبيقات مثل الثقافات عضوي النمط. </li></ol> 3. إعداد الثقافات الجلد عضوي النمط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناءكاسيت عضوي النمط من المواد شيوعا وجدت في المختبر أو الأشرطة يمكن أن يكون العرف من خلال متجر تصنيع المعادن (الشكل 2A - F). لجعل هذه الأشرطة من 3.5 سم لوحة زراعة الأنسجة، استخدام الكي لإزالة 1.0 سم × 1.0 سم مربع من وسط غطاء من صحن 3.5 سم (الشكل 2A-B). القيام بذلك تحت ظروف معقمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق أوتاد مربع في الجزء السفلي من الكاسيت (غطاء 3،5 سم الطبق) باستخدام طلاء الأظافر واضحة (الشكل 2C). سماح 5 دقائق لطلاء الأظافر لتجف والوجه الكاسيت أكثر بحيث يوضع على أوتاد مربع (الشكل 2D). وضع الكاسيت في طبق 6 سم. ملاحظة: ساحة تربط يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من الفنون والحرف اليدوية المخازن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نمو الخلايا الكيراتينية المتوسطة (KGM) تتألف من 66٪ DMEM، و 22٪ F12 هام، و 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 10٪ FBS، 2.67 ميكروغرام / مل الأدنين، 40 نز / مل الهيدروكورتيزون، 10 نانوغرام / مل السم الكوليرا، 4.94 ميكروغرام / مل الأنسولين، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 1.36 نانوغرام / مل Triiodo-L-ثيرونين، 10 نانوغرام / مل EGF، و 10 ميكروغرام / مل هيدروكلوريد السيبروفلوكساسين. تصفية وسائل الإعلام من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الأدمة من 4X القلم / بكتيريا + حل PBS ويغسل 2 مرات في KGM ثم احتضان في KGM عند 37 درجة مئوية لمدة يومين قبل استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأدمة باستخدام مشرط إلى 1.5 سم × 1.5 سم قطعة الحجم ثم ضع على كاسيت عضوي النمط. وضع الأدمة مع الجزء العلوي من الأدمة مواجهة. والجزء العلوي من الأدمة يكون الجانب الذي يأتي في اتصال مع الخلايا القرنية (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قبل قطع الأدمة على حفرة مربعة من الكاسيت عضوي النمط مع الجانب العلوي من الأدمة مواجهة (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه الكاسيت عضوي النمط بأكمله تحتوي الأدمة على استخدام ملقط (الشكل 3B). ذوبان الجليد في حل المصفوفة خارج الخلية على الجليد. استخدام الإبر والمحاقن لاستخلاص 100 ميكرولتر من حل المصفوفة خارج الخلية في شريط كاسيت. إضافة 5 قطرات إلى أسفل الأدمة (الجانب اللامع) ويهز قليلا لضمان حتى التوزيع في جميع أنحاء الأدمة (الشكل 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح 5 دقائق للالتجاري اضافية حل مصفوفة الخلوية ليصلب تماما (الشكل 3C). بعد التصلب، استخدام ملقط لقلب كاسيت على ظهره. إضافة 4 مل من KGM إلى 6 سم الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 0،5-1٬000٬000 الكيراتينية المعدلة وراثيا على أشرطة عضوي النمط تحتوي الأدمة (الشكل 3D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الكيراتينية عن طريق وضع 4 مل من 0.05٪ التربسين على 10 سم لوحات لمدة 5 دقائق وإخماد مع 4 مل من وسائل الاعلام DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا القرنية باستخدام عدادة الكريات ثم تدور باستمرار في 200 x ج لمدة 5 دقائق. 0،5-1٬000٬000 الخلايا resuspend (اعتمادا على عدد من الخلايا المتاحة) في 90 μلتر من KGM ووضع جميع الخلايا على الأدمة. ملاحظة: من المهم أن تضع نفس العدد من الخلايا في الأدمة داخل نفس التجربة لضمان أن أي خلافات ينظر في سمك البشرة مجدد ليست بسبب الاختلافات في بدء عدد الخلايا. يمكن وضع أقل من 0.5 مليون خلية في الأدمة تؤدي إلى ضعف التكوين الطبقي والتمايز. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الإعلام KGM على الثقافات عضوي النمط كل يوم. حصاد الأنسجة 1-14 أيام بعد إيداع الخلايا الكيراتينية في الأدمة. التقسيم الكامل والتفريق بين البشرة وعادة ما يحدث بعد يوم 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Tadeu, A. M., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells+in+adult+skin.">Epithelial stem cells in adult skin.</a> Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).</li><li>Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+one's+identity:+the+epigenetic+basis+of+stem+cell+fate+decisions.">Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions.</a> FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).</li><li>Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+barrier+formation+and+recovery+in+skin+disorders.">Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders.</a> J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).</li><li>Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+function+in+epidermis.">Transglutaminase function in epidermis.</a> J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).</li><li>Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pathways+in+disorders+of+epidermal+differentiation.">Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation.</a> Trends Genet. 29, 31-40 (2013).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+differentiation:+the+bare+essentials.">Epidermal differentiation: the bare essentials.</a> J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).</li><li>Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+human+skin+tissue.">Modelling cancer in human skin tissue.</a> Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).</li><li>Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organotypic+culture+of+human+skin+keratinocytes+and+fibroblasts+to+achieve+form+and+function.">The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function.</a> Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).</li><li>Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+skin+culture.">Organotypic skin culture.</a> J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).</li><li>Sen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZNF750+Is+a+p63+Target+Gene+that+Induces+KLF4+to+Drive+Terminal+Epidermal+Differentiation.">ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation.</a> Dev Cell. 22, 669-677 (2012).</li><li>Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+differentiation+in+a+self-renewing+mammalian+tissue+by+the+histone+demethylase+JMJD3.">Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3.</a> Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).</li><li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAI2+controls+the+undifferentiated+state+of+human+epidermal+progenitor+cells.">SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells.</a> Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).</li><li>Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+regulates+proliferation+and+differentiation+of+developmentally+mature+keratinocytes.">p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes.</a> Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493, 231-235 (2013).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).</li><li>Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+function+in+self-renewing+human+epidermis+is+maintained+by+the+exosome.">Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome.</a> Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+progenitor+differentiation+requires+the+long+noncoding+RNA+ANCR.">Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR.</a> Genes Dev. 26, 338-343 (2012).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).</li><li>Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZNF750+interacts+with+KLF4+and+RCOR1,+KDM1A,+and+CTBP1/2+chromatin+regulators+to+repress+epidermal+progenitor+genes+and+induce+differentiation+genes.">ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes.</a> Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).</li><li>Jameson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IQGAP1+scaffold-kinase+interaction+blockade+selectively+targets+RAS-MAP+kinase-driven+tumors.">IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors.</a> Nat Med. 19, 626-630 (2013).</li><li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+SNAI2+regulated+genes+in+primary+human+keratinocytes.">Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes.</a> Genomics data. 4, 43-46 (2015).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Doebis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+epithelial+cells+and+keratinocytes+with+improved+adenoviral+gene+transfer+for+the+application+in+skin+tissue+engineering.">Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering.</a> Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).</li><li>Melo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+correction+of+junctional+epidermolysis+bullosa+by+a+highly+recombinogenic+AAV+variant.">Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant.</a> Mol Ther. 22, 725-733 (2014).</li><li>Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expansion+of+human+keratinocyte+stem/progenitor+cells+carrying+a+transgene+with+lentiviral+vector.">Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector.</a> Stem cell res ther. 4, 127 (2013).</li><li>Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+maintains+progenitor+function+in+self-renewing+somatic+tissue.">DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue.</a> Nature. 463, 563-567 (2010).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).</li><li>Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+skin:+fibroblasts+facilitate+keratinocyte+growth+and+differentiation+on+acellular+reticular+dermis.">In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis.</a> J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).</li><li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+skin+models+in+drug+development.">The use of skin models in drug development.</a> Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).</li></ol>

We have nothing to disclose.

التلاعب الجيني في جلد الإنسان الثقافات عضوي النمط توفر العديد من المزايا لدرس عادة 2D الخلايا المستزرعة وكذلك نماذج الماوس. ثقافات 2D تفتقر إلى خلية خلية وخلية الخلية التفاعلات مصفوفة ثلاثية الأبعاد الموجودة في الأنسجة والأعضاء السليمة. وقد وجدت الدراسات الحديثة أيض...

البشرة الإنسان هو ظهارة طبقية الذي يصل إلى الأدمة الكامنة من خلال المصفوفة خارج الخلية يعرف باسم الغشاء القاعدي البشرة zone.The يخدم ليس فقط بمثابة حاجز كتيمة لمنع فقدان الرطوبة ولكن أيضا باعتبارها خط الدفاع الأول لحماية الجسم من المواد الغريبة والسامة 1. الطبقة القاعدية، وهو أعمق طبقة من البشرة، ويحتوي على الخلايا الجذعية البشرة والسلف التي تؤدي إلى ذرية المتباينة التي تشكل بقية البشرة 2. كما الخلايا الاصلية البشرة تفرق تهاجر صعودا لتشكيل الطبقة الأولى من الخلايا المتمايزة المعروفة باسم طبقة الشائكة 3. في الطبقة الشائكة، والخلايا تتحول على التعبير عن keratins 1 و 10، والذي ثم توفير القوة لتحمل الإجهاد البدني للطبقات متباينة من البشرة. كما خلايا الطبقة الشائكة مزيد من التمييز، وأنها تتحرك صعودا في البشرة للم الطبقة الحبيبية التي تتميز تشكيل كيراتوهيالينية ورقائقي حبيبات وكذلك البروتينات الهيكلية التي يتم تجميعها تحت غشاء البلازما. كما الخلايا المضي قدما في عملية التمايز، والبروتينات تحت غشاء البلازما عبر ربطها بعضها البعض في حين تنبثق حبيبات رقائقي من الخلايا لتشكيل الدهون يسمى حاجز الغنية الطبقة القرنية 4. الأمراض التي تنطوي على تغييرات في نمو البشرة وأثر التمايز ~ 20٪ من السكان 5. وبالتالي، فهم آليات هذه العملية هو من أهمية كبيرة. منذ مظهر من مظاهر العديد من هذه الأمراض يتوقف على خلية خلية أو خلايا مصفوفة الاتصال والثقافات عضوي النمط حيث يتم إعادة تشكيل البشرة الإنسان في بيئة 3D تم إنشاء 10/06. هذه الطرق تشمل عادة استخدام الخلايا الكيراتينية الأولية أو تحويلها المصنف على المصفوفة خارج الخلية مثل الإنسان مماتالأدمة، Matrigel، أو الكولاجين. لفهم الآليات التنظيمية الجينات التي تعتبر مهمة في نمو البشرة والتمايز، الخلايا الكيراتينية يمكن التلاعب بها وراثيا من خلال ناقلات فيروسات لضربة قاضية أو بإفراط عن الجينات في الثقافة 2D ثم إعادة تشكيل في 3D. وقد استخدمت هذه الأساليب على نطاق واسع لوصف الجينات المسؤولة عن الجذعية البشرة والخلايا الاصلية تجديد الذات والتمايز، وكذلك التقدم إلى الأورام 11-21. هنا، يتم توفير بروتوكول معمقة حول كيفية تغيير التعبير الجيني في الثقافات عضوي النمط البشرة من خلال استخدام الفيروسات القهقرية.

<table><tbody><tr><td>Human skin</td><td>New York Firefighters Skin Bank</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&quot;&gt;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>amphotropic phoenix cell lines</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Media (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin Hydrochloride</td><td>Serologicals</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>cautery</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 1 antibody</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>square pegs</td><td>Arts and crafts stores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>Cell Applications</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV retroviral vector</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS retroviral vector</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro Retroviral vector</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis

الثقافات عضوي النمط تسمح إعادة تشكيل بيئة 3D الحرجة للاتصال خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات التي يحاكي وظيفة وظائف أعضاء في الجسم الحي نظرائهم الأنسجة. ويتمثل ذلك من خلال الجلد الثقافات عضوي النمط الذي يلخص بأمانة التمايز البشرة وبرنامج الطبقية. الكيراتينية البشرة الإنسان الأساسية هي للتلاعب وراثيا من خلال الفيروسات القهقرية حيث الجينات يمكن overexpressed بسهولة أو طرقت إلى أسفل. ويمكن بعد هذه الخلايا الكيراتينية المعدلة وراثيا يمكن استخدامها لتجديد البشرة الإنسان في الثقافات الجلد عضوي النمط تقديم نموذج قوي لدراسة مسارات الوراثية نمو الارتطام البشرة، والتمايز، وتطور المرض. البروتوكولات المعروضة هنا تصف أساليب لإعداد الأدمة البشرية الميتة فضلا عن التلاعب وراثيا الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية من أجل توليد الثقافات الجلد عضوي النمط. جلد الإنسان مجدد يمكن استخدامها في downstrتطبيقات زير الشئون الخارجية مثل التنميط التعبير الجيني، المناعية، وimmunoprecipitations لونين تليها عالية الإنتاجية التسلسل. وهكذا، فإن جيل من هذه الثقافات الجلد عضوي النمط المعدلة وراثيا تسمح تحديد الجينات التي تعتبر بالغة الأهمية للحفاظ على توازن البشرة.

الخطوة الأولى في توليد جلد الإنسان عضوي النمط لإزالة البشرة من الأدمة. حضانة لمدة أسبوعين من الجلد عند 37 درجة مئوية في 4X القلم / بكتيريا / PBS ينبغي أن يسمح للفصل الأدمة من البشرة (الشكل 1A). إذا فصل البشرة والأدمة من الصعب ثم ضع الأنسجة عند 37 درجة مئوية في 4x والقل?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis at JoVE.com

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K Views.  UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego. The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. 

Video: Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Cancer Research

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioengineering

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

تحسين 2D و 3D الجلد<em&gt; في المختبر</em&gt; نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

مراجعة شاملة لبروتوكولات زراعة الجلد الجنيني للطيور

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

تسليط الضوء على المؤلف: نظرة ثاقبة على منهجيات زراعة جلد الطيور التجريبية الحالية

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

استخدام نباتات جلد الطيور لدراسة أنماط الأنسجة وتكوين الأعضاء

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

زراعة بشرة بشرية ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها على نطاق واسع

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

جيل من مكافئات الجلد البشري الوعائية ذاتية التجميع

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

تحسين 2D و 3D الجلد

استخدام نباتات جلد الطيور لدراسة أنماط الأنسجة وتكوين الأعضاء

استخدام نباتات جلد الطيور لدراسة أنماط الأنسجة وتكوين الأعضاء

استخدام نباتات جلد الطيور لدراسة أنماط الأنسجة وتكوين الأعضاء

زراعة بشرة بشرية ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها على نطاق واسع

جيل من مكافئات الجلد البشري الوعائية ذاتية التجميع