التفاصيل الواردة في هذا البروتوكول، ويتناول جيل الجلد البشري المكافئ، الذي غالبا ما يكون تحديا من الناحية الفنية. يتم تضمين عناصر بروتوكول مكافئ الجلد البشرية الجديدة ، مثل الأوعية الدموية والتصوير الحجمي. تمكن هذه التقنية من البناء المباشر لنموذج الجلد الذي يطابق بشكل وثيق الأنسجة في الجسم الحي لدراسة الأمراض والشيخوخة والطب الشخصي.
الجزء الأكثر تحديا من هذا البروتوكول هو الانتقال بين الغمر وواجهة الهواء السائل. من المرجح أن يستغرق الأمر بضع تجارب لتحسين التوقيت ومستويات الوسائط لتحقيق نتائج متسقة. للبدء، أضف 516 ميكرولتر من الوسائط إلى أنبوب بارد، وأضف على الفور 375 ميكرولتر من الكولاجين البارد باستخدام ماصة الإزاحة الإيجابية 1000 ميكرولتر.
إزالة تلميح ماصة فارغة والتحول إلى ماصة النزوح الإيجابية 250 ميكرولتر المعدة لخلط. تخلط بسرعة، ولكن بلطف لمنع تشكيل فقاعة الزائدة. الحفاظ على طرف في الحل، مزيج موحد من مواقف مختلفة من الأنبوب حتى الحل هو من لون متجانس، والذي يستغرق عادة حوالي خمس دورات ماصة أو 10 ثانية.
تفريق فورا 125 ميكرولتر من الكولاجين acellular على غشاء إدراج ثقافة 12 جيدا. لضمان تغطية موحدة، إمالة لوحة واستخدام طرف ماصة لطلاء الغشاء عن طريق نشر الكولاجين بلطف حولها. على الفور نقل لوحة 12 جيدا إلى حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية للسماح لها هلام لمدة 20 دقيقة على الأقل.
بعد فترة الهلام، أخرج طبق الكولاجين الخلوي البالغ 12 بئرا من الحاضنة. إزالة أنبوب 1.7 ملليلتر توج من الجليد الرطب، ثم إزالة الكولاجين الأسهم من التبريد ووضعه على الجليد الرطب مع غطاء مفتوح. أضف 516 ميكرولتر من تعليق الخلايا المبردة إلى الأنبوب البارد المغطى.
استخدام ماصة 1000 ميكرولتر على الفور ماصة 375 ميكرولتر من محلول الكولاجين البارد مباشرة في الحل داخل أنبوب توج. طرد كل الكولاجين من ماصة في الأنبوب والتخلص من تلميح ماصة النزوح الإيجابية. قم على الفور بالتحول إلى ماصة 250 ميكرولتر ومزج محلول الكولاجين بمجرد خلطه ، ونقل 250 ميكرولتر من محلول الكولاجين الخلوي إلى دعامات الكولاجين الخلوية في إدراج ثقافة 12 بئرا ، ثم نقل لوحة 12 جيدا إلى حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية.
بعد 30 دقيقة هلام الوقت، إمالة بلطف لوحة لتقييم هلام وتأكد من أن الكولاجين قد وطدت. إضافة 500 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر من مزيج وسائل الإعلام إلى الغرفة العليا والغرفة السفلى من إدراج، على التوالي. تأكد من أن جل الكولاجين مغمور، مع إضافة المزيد من الوسائط إذا لزم الأمر.
ضع لوحة البئر في حاضنة ثقافة الخلية للحضانة بين عشية وضحاها. في يوم الغمر السابع، استخدم ماصة يدوية لجمع الوسائط والتخلص منها من القاع والغرفة العلوية لكل بئر بناء. لجمع الوسائط العالقة مباشرة تحت الغشاء النفاذ ، ضع طرف ماصة تحت الغشاء ، وضرب إدراج خارج المكان مؤقتا.
إضافة ملليلتر واحد من الجلد البشري يعادل أو وسائل الإعلام HSE تكملها مع 5٪ FPS إلى الغرفة السفلى من كل بئر و 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الغرفة العليا من كل بئر. قم بزرع الخلايا القرنية مباشرة على سطح البناء الجلدي والسماح لها بالاستقرار لمدة ساعتين في الحاضنة. بعد ساعتين من بذر الخلايا القرنية ، أضف بعناية 300 ميكرولتر من وسائط HSE ، تكملها 5٪ FPS إلى الغرفة العلوية لكل بئر بناء.
بعد تحميل الوسائط، ضع البناء مرة أخرى في الحاضنة. باستخدام ماصة يدوية، ارفع كل بناء إلى واجهته السائلة الهواء، أو ALI، عن طريق إزالة نفايات الوسائط من الغرفة العليا فقط. في محاولة للحصول على أقرب إلى طبقة البشرة ممكن دون لمس أو إتلافه.
إمالة لوحات قليلا في زوايا مختلفة لجمع وسائل الإعلام، ثم إضافة ما يقرب من اثنين من ملليلتر من المياه العقيمة إلى الآبار المحيطة بها في لوحة للحفاظ على رطوبة متسقة. تحقق من لوحة بضع ساعات في وقت لاحق للتأكد من أن keratinocytes لا تزال في ALI. إزالة أي وسائط في الغرفة العليا، وتتبع مقدار الوسائط التي تتم إزالتها من كل بئر.
يجب أن تبدو طبقات البشرة رطبة ، وليست جافة ، ولكن لا ينبغي أن تكون هناك وسائط مجمعة فوق البناء. لإعداد بناء لتلطيخ immunofluorescent، بدوره إدراج رأسا على عقب ووضعه على بئر على لوحة البئر. تثبيت إدراج بيد واحدة أثناء استخدام ملقط تلميح غرامة أو سكين الدقة لقطع حوالي نصف محيط الغشاء.
قطع أقرب إلى السكن البلاستيكي ممكن. باستخدام ملقط طرف غرامة، والاستيلاء على حافة رفرف غشاء قطع وتقشير بلطف الغشاء المسامية قبالة إدراج فضلا عن بناء VHSE. إذا البناء على جانب الغرفة ، فاستخدم ملقط الطرف الناعم أو ملعقة صغيرة لنقله إلى البئر.
بمجرد أن يكون VHSE في البئر ، تجاهل أي قطع متبقية من غشاء الإدراج والحفاظ على إدراج الثقافة في كل بئر لعقد VHSEs في وضع مغمور أثناء التلطيخ. قبل يومين من التصوير، قم بإعداد البوليديميثيلسيلوكسيان أو PDMS. وضع أي وعاء خلط نظيفة على توازن الوزن وتاري المقياس.
إضافة الأساس، ثم إضافة وصلة عرضية. تحريك الحل بقوة لمدة أربع دقائق على الأقل، وخلق فقاعات صغيرة. بعد خلط كافية، صب PDMS في طبق بيتري 90 أو 100 ملليمتر.
ديغا PDMS في غرفة فراغ حتى تختفي جميع الفقاعات وPDMS واضحة. حرر الفراغ ببطء وأزل PDMS. ضع الطبق في فرن لعلاجه بين عشية وضحاها عند 50 إلى 60 درجة مئوية ، مع التأكد من أن الطبق يجلس مسطحا لعلاج PDMS بالتساوي.
قبل يوم واحد من التصوير، استخدم لكمة فولاذية أو سكين دقيقة محمولة باليد لكمة أو قطع بئر دائري من ورقة PDMS، بنفس حجم بناء VHSE تقريبا. قطع التصحيح مربع حول البئر الدائري لإنشاء نظام إدارة الأداء الموحد واحد جيدا. باستخدام زلة غطاء زجاجي من حجم مماثل كما PDMS إضافة جيدا الغراء cyanoacrylate إلى السطح السفلي من PDMS وتشويه بالتساوي مع طرف ماصة المتاح.
مركز الزجاج واضغط عليه على PDMS جيدا في حين ترك نافذة زجاجية واضحة داخل دائرة لكمة. السماح للغراء الجاف بين عشية وضحاها قبل استخدام. توصيف البشرة والأدمة تظهر علامات immunofluorescent المناسبة للبشرة البشرية في يبني VHSE.
Cytokeratin 10 هو علامة التمايز المبكر keratinocyte التي عادة ما علامات جميع طبقات فوقbasal في مكافئات الجلد. إنفولوكرين وفيلاغرين علامات التمايز في وقت متأخر في الخلايا القرنية ووضع علامة على الطبقات العليا فوق القاعدية في مكافئات الجلد. سمح مسح VHSE بالتصوير المباشر في إعداد واحد وقضى على الحاجة إلى إعادة توجيه البناء لتصوير الأدمة وال البشرة بشكل منفصل.
الصور الحجمية تجعل من الممكن توليد الاداءات 3D لرسم خريطة الأوعية الدموية في جميع أنحاء كل بناء. تم تحميل أكوام الصور في البرامج الحاسوبية واستخدمت خوارزمية مخصصة لتقديم 3D والتحديد الكمي. تحديد الهيكل العظمي المركز النهائي لكل وعاء الكولاجين الرابع ملحوظ واستخدمت البيانات الناتجة لحساب قطر السفينة، فضلا عن كسر الأوعية الدموية.
بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق التوصيف مثل تحليل الحاجز ، والمسح المجهري الإلكتروني ، وملامح الدهون ، وغيرها لفهم كيفية تأثير الأوعية الدموية على نضج البشرة واستقرارها على وجه التحديد. يتيح هذا البروتوكول إجراء دراسات متعلقة بالأنسجة ونوع الخلية في نموذج الجلد الوعائي. وهي مناسبة بشكل خاص للبحث في مجال الشيخوخة والطب الشخصي.
