يشكر المؤلفون فورسمان حنا لإنشاء أورجانوتيبيك 3D الميلانوما-كروي-الجلد-النموذج وتوفير بروتوكولات ممتازة. كما يشكر المؤلفون بوسكه سيلك لقيمة الدعم التقني. وأيده العمل ه الألمانية: برنامج Med 031A423A "سرطان الجلد حساسية".

تم إجراء جميع الأنسجة البشرية العمل باستخدام بروتوكولات المؤسسية المعتمدة.
1-الفصل بين الأدمة والبشرة من الجلد البشري (القلفة الأحداث من الختان)
<ol><li>ضع القلفة (عادة 1-2 سم2) في طبق ثقافة خلية معقمة غير لاصقة (Ø 10 سم) وتغطية ذلك مع 10-12 مل من المحلول الملحي مخزنة فوسفات+ (برنامج تلفزيوني، 0.5 مم مجكل2، كاكل 0.9 مم2، الرقم الهيدروجيني 7.2 = برنامج تلفزيوني+). قم بإزالة جميع الأنسجة (الدهنية) الزائدة باستخدام مشرط معقم والملقط.</li>
	<li>قص الجلد إلى قطع 3 مم × 5 مم وغسلها ببرنامج تلفزيوني، ونقلها إلى طبق ثقافة خلية معقمة غير لاصقة (Ø 6 سم). وتغطي قطع الأنسجة مع 5-7 مل ديسباسي الحل (2 U/mL في برنامج تلفزيوني). ختم الطبق ثقافة الخلية مع الفيلم البارافين واحتضانها ح 16 عند 4 درجة مئوية.</li>
	<li>سحب البشرة من الجزء الجلدي مع ملقط معقم اثنين. نقل قطع الأنسجة تشريح للفرد غير لاصقة خلية ثقافة الأطباق (Ø 6 سم) وتغطي كل منها مع برنامج تلفزيوني+.</li>
</ol>2-عزل الخلايا الكيراتينيه الأولية من البشرة
<ol><li>بعناية إزالة برنامج تلفزيوني+ من طبق ثقافة الخلية باستخدام ماصة باستور ويغسل قطع أنسجة البشرة (القسم 1.3) مع برنامج تلفزيوني. قطع البشرة إلى أجزاء أصغر (1 مم2) وجمعها في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. إضافة 10 مل 1 × التربسين-يدتا (يسخن إلى 37 درجة مئوية)، واحتضان لمدة 5 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. دوامة تعليق الأنسجة كل 2 دقيقة.</li>
	<li>وقف رد الفعل الأنزيمي بإضافة 1 مل مصل العجل الجنين (FCS). ريسوسبيند الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع 10 مل ماصة بلاستيكية لدقيقة 4 في محاولة لتجنب فقاعات ورغوة تشكيل.</li>
	<li>بيبيت تعليق خلية في خلية مصفاة (المسام حجم 100 ميكرومتر)، وضعت على رأس أنبوب مخروطي طازجة 50 مل، وشطف x 3 مع 5 مل برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في ز 200 x للحد الأدنى 5 ريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط الثقافة 2-6 مل المتضمن مع الجنتامايسين 1% (v/v). تحديد عدد الخلايا يدوياً بواسطة عد الخلايا في خلايا 6 × 105 هيموسيتوميتير والبذور في قارورة ثقافة الخليوي T75.</li>
</ol>3-زراعة الخلايا الكيراتينيه الأولية
<ol><li>احتضان الكيراتينيه الابتدائي معزول في الخطوة 2.3 في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO2 في المتوسط keratinocyte دون سفح المنحدر القاري، إلى 50-70% كونفلوينسي.</li>
	<li>لمرور الخلايا الكيراتينيه بعناية إزالة المتوسطة، وإضافة 5 مل برنامج تلفزيوني-يدتا، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق إذا كانت الخلايا قد بدأت فصل من قارورة الثقافة تحت مجهر خفيفة (4 X التكبير: الخلايا تظهر مستدير الزوايا بل هي لا تزال تعلق!). إذا لم يكن كذلك، استبدال القديم برنامج تلفزيوني-يدتا يدتا برنامج تلفزيوني جديد وإعادة احتضانها لآخر 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إضافة 5 مل 1 x التربسين-أدتا إلى خلايا دائرية لا تزال مغطاة 10 مل برنامج تلفزيوني-يدتا وإعادة احتضانها لهم لمدة 1-3 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وقف رد الفعل الأنزيمي بإضافة 1 مل FCS وجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي الخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند بيليه في المتوسط keratinocyte والبذور 6 × 105 خلايا في T75 خلية ثقافة قارورة جديدة. ملاحظة: لتوليد يعيد بناء البشرة أورجانوتيبيك، الكيراتينيه الأولية يجب استخدام لا بعد مرور 3-4.</li>
</ol>4-عزل الخلايا الليفية الأولية من الأدمة
<ol><li>قطع الأنسجة الجلدية (القسم 1.3) إلى قطع أصغر حجماً (1 مم2) وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل. إضافة 10 مل كولاجيناز-الحل (5 U/mL في برنامج تلفزيوني+) واحتضانها لمدة 45 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. الطرد المركزي الخليط من قطع الأنسجة والخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>أغسل بيليه خلية مرتين مع 10 مل دميم تحتوي على 4.5 غرام/لتر جلوكوز ولام الجلوتامين، ولكن دون بيروفات L. وأخيراً ريسوسبيند قطع الأنسجة في 2 مل دميم الذي يحتوي على 1% (v/v) مع الجنتامايسين والسفح 10%. تحويلها إلى قارورة ثقافة الخليوي T25 واحتضانها لهم في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO2 بين عشية وضحاها. ملاحظة: حجم صغير يسمح الليفية لترحيل من الأنسجة-تحت الأنقاض ويجبرهم على إرفاق قارورة الثقافة.</li>
	<li>في صباح اليوم التالي، إضافة آخر 6 مل دميم/مع الجنتامايسين/FCS واحتضان لمدة 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية حتى وصلت إلى الخلايا كونفلوينسي 80-90%.</li>
</ol>5-زراعة الخلايا الليفية الأولية
<ol><li>للمرور الخلايا الليفية وإزالة المتوسطة ويغسل خلايا ملتصقة مع برنامج تلفزيوني. إضافة مل 5 1 × يدتا التربسين واحتضان لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>وقف رد الفعل الأنزيمي بإضافة 5 مل دميم/FCS وجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي الخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند بيليه في المتوسط دميم، والبذور 6 × 105 خلايا في T75 خلية ثقافة قارورة جديدة. ملاحظة: لتوليد يعيد بناء البشرة أورجانوتيبيك، الخلايا الليفية الأولية يجب استخدام لا بعد مرور 4-6.</li>
</ol>6-جيل من سرطان الجلد 3D الماغنيسيوم عبر أسلوب قطره معلقة
<ol><li>الثقافة الميلانوما الخلايا (مثلاً، 451، لو، أو أي خط خلية سرطان الجلد من الفائدة) وفقا للبروتوكولات العامة، استخدام ربمي الذي يحتوي على 10% FCS15.<ol>
<li>لتوليد سرطان الجلد الماغنيسيوم من حجم ونوعية مماثلة، يغسل خلايا سرطان الجلد في برنامج تلفزيوني، إضافة 5 مل من 1 x يدتا التربسين في برنامج تلفزيوني للخلايا في T175 خلية قارورة الثقافة، واحتضان لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تحييد التربسين بإضافة 5 مل RPMI/10% FCS. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 200 x 5 كحد أدنى لإعادة تعليق بيليه الخلية في ربمي/FCS بتركيز نهائي من خلايا/مل 10,000 حسبما يقرره عد في هيموسيتوميتير.</li>
	</ol>
</li>
	<li>بقعة 40 × 25 ميليلتر (= خلايا 250) تعليق خلية على السطح الداخلي لغطاء صحن الثقافة معقمة غير لاصقة الخلية (Ø 10 سم) ماصة إلكترونية المتعددة باستخدام. بحركة سريعة ولكنها ناعمة، يستدير الغطاء ووضعه على الطبق الثقافة كل منهما الخلية التي تحتوي على 5 مل برنامج تلفزيوني.<ol>
<li>ثقافة "أطباق قطره معلقة" في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 10-14 يوما، تبعاً لنوع الخلية المستخدمة. ملاحظة: الخلايا مرحلة النمو ملم عادة تنمو بشكل أسرع وتشكل الماغنيسيوم أكثر صلابة في إسقاط معلقة بالمقارنة مع خلايا الميلانوما المستمدة من RGP أو VGP. للتقييم الفردي، ومراقبة النمو كروي تحت منظار أو تحت مجهر خفيفة (4 X التكبير). عادة، تصبح الماغنيسيوم يمكن اكتشافها بعد 48 ساعة تحت منظار أو تحت مجهر خفيفة (4 X التكبير). بعد 10-14 يوما، تكون مرئية دون أي جهاز التكبير.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 أيام بعد اكتشاف قطره الأولية، إضافة 10 ميليلتر من جديد RPMI/10% FCS المتوسطة لكل قطره. وفي وقت لاحق، تبادل 10 ميليلتر في المتوسط كل يوم. استخدام عبوة الإلكترونية مفيدة جداً في هذه الخطوة.</li>
	<li>اعتماداً على نوع الخلية، حصاد الماغنيسيوم (انظر المادة 10 للحصول على تفاصيل) بعد 10-15 يوما قبل الشطف بلطف لهم قبالة غطاء صحن ثقافة الخلية مع برنامج تلفزيوني. جمع لهم في طبق ثقافة جديدة غير لاصقة خلية. ملاحظة: فترة زراعة تعتمد على مرحلة نمو ورم خلايا سرطان الجلد عند أنها استمدت في البداية، مثلاً، الماغنيسيوم المستمدة من الخلايا 451-لو تنمو إلى حوالي 500 ميكرومتر في القطر في غضون 12 يوما لاستزراع في إسقاط معلقة15 .</li>
</ol>7-جيل المقصورة الجلد من الجلد كامل أورجانوتيبيك يعيد
<ol><li>إنشاء نماذج الجلد باستخدام خلية 24-بئر microporous غشاء إدراجات (المسام حجم 8 ميكرومتر) توضع في لوحات 24-جيدا. ملاحظة: تأكد من عدم استخدام معلقة ولكن الدائمة إدراج، نظراً لأنها سوف توضع في لوحة 6-جيدا لزراعة الهواء السائل في مرحلة لاحقة.</li>
	<li>إعداد الحل (GNL) تحييد جل15، فضلا عن وسائط الإعلام الثقافة المشار إليها ملم ونمو غشائي وسائط الإعلام (EGM)16،17. لمنع تخثر الدم، تخزين الكولاجين النوع الأول (عادة ما تكون من ذيل الفئران، 3.5-4 مغ/مل في حمض الخليك N 0.02) على الجليد حتى الاستخدام، لأنه يبدأ بهلام في الرايت</li>
	<li>إعادة تعليق 1 × 105 الليفية لإدراج في GNL ومزيج تعليق خلية بسرعة مع الكولاجين بنسبة 1:3 في وحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر/إدراج. إعمار المزيج بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً لتجنب تشكيل فقاعة فقاعات قد يؤثر على نوعية الجلد.</li>
	<li>السماح للهلام الجلد الفردية تسوية بإبقائها دون المتوسط في RT لمدة 30 دقيقة في غطاء عقيمة. بعد ذلك تغطي كل جل مع دميم المحتوية على الجلوكوز 4.5 غرام/لتر، 1% ل الجلوتامين، FCS 10%، ودون L-بيروفات، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.</li>
</ol>8-جيل حجرة البشرة من الجلد كامل أورجانوتيبيك يعيد
<ol><li>في اليوم التالي إزالة المتوسطة من المواد الهلامية الجلدي وحجته لهم مع وسائل الإعلام الغير عادية (FCS 10 ٪، 1 ٪ بينستريب، الجنتاميسين 10 ملغ/مل) ح 2 في 37 درجة مئوية. سحب المتوسطة والبذور 1 × 105 الكيراتينيه حراكه في 100 ميليلتر EGM على رأس جل الجلد بعناية.</li>
	<li>احتضان يعيد بناء ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية للسماح للخلايا الكيراتينيه على التمسك بحجرة عن طريق الجلد. ملاحظة: خلال هذه الفترة الحضانة، سوف تبدأ المواد الهلامية ليتقلص بسبب الانكماش الناجم عن تنتجها الخلايا الليفية، وهكذا، جزئيا على الأقل فصل من الجدران إدراج.</li>
	<li>تغطية مكافئات الجلد مع حوالي 800 ميليلتر EGM وعناية إزالة الجل المتبقي من الجدار إدراج مع تلميحه صغيرة ماصة (أبيض). الثقافة الجلد مكافئات غارقة في اجتماع فريق الخبراء لمدة 7 أيام في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، وتغيير في المتوسط كل يوم. ملاحظة: أثناء هذا الوقت مكافئات الجلد سوف تتقلص إلى حد كبير.</li>
</ol>9. يعيد زراعة الهواء السائل من الجلد كامل أورجانوتيبيك
<ol><li>في يوم 8، إدراج نقل كل بئر فردية من لوحة 6-جيدا. فقط إضافة 1.2-1.4 مل متوسطة مم لكل بئر، حيث أن إعادة البناء البشرة تم توفيره مع متوسطة من أسفل البئر ولكن لا يغطي مع المتوسطة. ملاحظة: زراعة في واجهة الهواء السائل يسمح التكوين الطبقي لجزء البشرة وإنشاء كامل طبقة كورنيفيد (الطبقة القرنية).</li>
	<li>خلال الأيام القادمة 10-17، تغيير في المتوسط كما ورد في القسم 9.1 كل يوم. وخلال هذه الفترة، إضافة المخدرات أو المنبهات الأخرى حسب الحاجة إلى المتوسط. بعناية إزالة إعادة البناء الجلد الكامل من إدراج غشاء microporous استخدام الملقط منحنى لمزيد من التحليل، مثلالتحليل المناعي (الشكل 1).</li>
</ol>10-توليد نماذج سرطان الجلد أورجانوتيبيك الجلد كروي
<ol><li>لدمج الماغنيسيوم الميلانوما في المقصورة عن طريق الجلد ليعيد بناء البشرة الكامل أورجانوتيبيك، بعناية شطف الماغنيسيوم (بعد الخطوة 6، 4) قبالة غطاء الشنق إسقاط خلية الثقافة الطبق مع برنامج تلفزيوني. جمع 10-20 الماغنيسيوم/إدراج في صحن ثقافة معقمة غير لاصقة خلية. بعناية إزالة برنامج تلفزيوني المفرطة مع ماصة باستور.</li>
	<li>نضح الماغنيسيوم في أصغر حجم ممكن لاجتماع فريق الخبراء. عند هذه النقطة مراعاة والعد الماغنيسيوم بالعين المجردة، دون أي مزيد من التكبير الجهاز. أن الماغنيسيوم 10-20 كل الجلد النموذجي/هلام، كما ورد في خطوة 10.1.</li>
	<li>نقلها إلى وحدة التخزين المطلوبة من GNL التي تحتوي على الخلايا الليفية (خلال الخطوة 7، 3)، وخلط مع نوع الكولاجين أنا. من هذه الخطوة على المضي قدما كما هو موضح في المقاطع 7.3-9.1. ملاحظة: الماغنيسيوم الورم تصبح مرئية في جل الجلدية كالبقع البيضاء (الشكل 2)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boulais, N., Misery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermis:+a+sensory+tissue.">The epidermis: a sensory tissue.</a> Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+homeostasis:+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin.">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).</li><li>Shain, A. H., Bastian, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+melanocytes+to+melanomas.">From melanocytes to melanomas.</a> Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).</li><li>Clark, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cutaneous+malignant+melanoma+as+a+model+for+cancer.">Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).</li><li>Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+development+and+progression:+a+conspiracy+between+tumor+and+host.">Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host.</a> Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).</li><li>Miller, A. J., Mihm, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma.">Melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).</li><li>Balch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Final+version+of+2009+AJCC+melanoma+staging+and+classification.">Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification.</a> J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).</li><li>Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palliative+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+a+systematic+review+of+41+randomised+clinical+trials.">Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials.</a> Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).</li><li>Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+targeted+therapy+and+immune+checkpoint+inhibitors+in+the+treatment+of+metastatic+melanoma.">Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma.</a> Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).</li><li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes.">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li><li>Flaherty, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mutated,+activated+BRAF+in+metastatic+melanoma.">Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).</li><li>Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+metastatic+melanoma.">Systemic therapy of metastatic melanoma.</a> J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+the+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+three-dimensional+organotypic+skin-melanoma+spheroid+model+for+in+vitro+drug+testing.">Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing.</a> Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).</li><li>Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+serum-free+epidermal+culture+model+to+show+deleterious+effects+of+epidermal+growth+factor+on+morphogenesis+and+differentiation.">Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation.</a> J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).</li><li>Sinnberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PI3K-AKT-mTOR+signaling+sensitizes+melanoma+cells+to+cisplatin+and+temozolomide.">Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide.</a> J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).</li><li>Niessner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+farnesyl+transferase+inhibitor+lonafarnib+inhibits+mTOR+signaling+and+enforces+sorafenib-induced+apoptosis+in+melanoma+cells.">The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).</li><li>Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

كروي سرطان الجلد أورجانوتيبيك الجلد نموذج عرض هنا أوامر رؤى جديدة لفهم أعمق لمداواة البينية والتفاعل المضيف الورم، وقد توفر منصة فحص متقدمة لدراسة الآليات الجزيئية للتنمية الورم و مقاومة العلاج في المستقبل.
لضمان الأفضل الفسيولوجي و في فيفو محاكاة ظروف الجلد يعيد، ونوعية الخلايا الأولية ذات أهمية قصوى. كما ذكر أعلاه، خلايا الجلد الأحداث أو قبل الولادة تظهر على أدنى درجة التمايز وهي بالتالي أفضل مناسبة لتوليد شبه كامل-سمك الجلد. مراقبة الجودة الممكنة الأولى هو مدى انكماش الجلد في اليوم الثاني بعد زرع الخلايا الكيراتينيه واكويليبراتينج الهلام ل EGM (أقسام 8.2 و 8.3 من البروتوكول). سوف يتقلص الهلام الجلد الأكثر مع أفضل نوعية من الخلايا الليفية. أيضا، قد تنال من دمج الخلايا الليفية كثيرة جداً أو قليلة جداً انكماش الجلد ومن ثم تمسك البشرة بحجرة عن طريق الجلد. وهذا بدوره سوف خرق تمايز البشرة، نظراً لأن هذه العملية تتطلب محادثة عبر واسعة النطاق بين خلايا الجلد والبشرة.
وتتوقف نوعية الخلايا الأولية أيضا حاسمة على كونفلوينسي الخلية، فضلا عن مرور الخلايا. إذا كانت الخلايا الكيراتينيه وتزرع على إيه إيت زيرو % كونفلوينسي فورا وقف تكاثر والبدء في التفريق. ولذلك من المهم للثقافة منها إلى 40-70% كونفلوينسي خلال باساجينج واستخدامها لا يتجاوز سن 3-4. الليفية أقل حساسية ولكن لا ينبغي أن تستخدم بعد مرور 4-6. يرجى أيضا ملاحظة أن جميع الخلايا الأولية وخطوط الخلايا المستخدمة لإنشاء نماذج الجلد كروي الميلانوما أورجانوتيبيك تستزرع خالية من المضادات الحيوية، وذلك خطر تلوث عالية. بيد أن إضافة المضادات الحيوية يتغير فسيولوجيا الخلايا الفردية وذلك يقلل من جودة مكافئات الجلد.
وبصفة عامة، ورم كروي تشكيل الممكن من تقريبا جميع أنواع خطوط الخلايا السرطانية وأيضا الخلايا السرطانية معزولة طازجة من المواد المريض. قد تختلف الوقت عدد و/أو زراعة الخلية الأولى للحصول على أحجام كروي الأمثل اعتماداً على نوع الخلية المستخدمة. تصل إلى حجم من 150-200 ميكرون، كافة الخلايا المدرجة في كروي يمكن لا يزال بما فيه الكفاية توفيره مع المواد الغذائية عن طريق نشر بسيطة. إظهار درجة عالية من التمايز الخلوي فقط الماغنيسيوم مع أحجام إيه فايف زيرو زيرو ميكرومتر وتمثل الميزات النموذجية ل أنسجة الورم غير فاسكولاريزيد22.
أورجانوتيبيك سرطان الجلد-كروي-الجلد-الطراز وضعت هنا مناسبة خاصة لدراسة التفاعلات المضيف الورم واختبار إطار في فيفوالمخدرات سرطان الجلد-مثل الظروف15. لا يزال، البيئة من سرطان الجلد في فيفو حتى أكثر تعقيداً، وإيواء مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا السرطانية المرتبطة، بما في ذلك الخلايا المناعية، وخلايا بطانية. منذ إضافة الخلايا المناعية الأولية المناسبة تواجه مشاكل مع هيستوكومباتيبيليتي، هذه النماذج غير قادرة على رصد النهج المناعة العلاجية على نحو كاف.
على الرغم من ذلك، الماغنيسيوم سرطان الجلد يمكن أن تتولد من المواد الطازجة معزولة المريض ومجرد إدراج إعادة البناء الجلد الكامل، قد يخدم كالمخدرات فرادى فحص منصات. حتى إدماج قطعة من ورم خبيث سرطان الجلد في الجلد يعيد بناء المتصور لاختبار تركيبات العقاقير في نهج علاجية مصممة خصيصا. بما في ذلك نموذج الميلانوما الجلد 3D أورجانوتيبيك في التجارب السريرية من المرجح أن تساعد على ضمان إلا رواية العلاجية الواعدة المفاهيم أخذ قدما في التجارب السريرية، مما يقلل من معدل الاستنزاف لعلاجات جديدة محتملة لهذا المرض وزيادة معدل نجاح العلاج في التجارب السريرية.

جلد الإنسان يتكون من اثنين من الأجزاء الأخرى المتميزة التي تؤدي وظائف مختلفة في حماية الجسم من الآثار الضارة بالبيئة1. حجرة الجلد السفلي يتكون من النسيج الضام الليفي مطاطا. وهو يتألف من ألياف الكولاجين والايلاستين فضفاضة متصلة توليفها من قبل الخلايا الليفية، تخدم وظيفة حاجز ميكانيكية. الأدمة مفصولة من البشرة العليا الصفيحة القاعدية التي تنتج كمصفوفة خارج الخلية بسبب اتصال مستمر بين المقصورات الجلد على حد سواء. وعلى النقيض من باطن الجلد، البشرة ظهارة الحرشفية الذي يتكون أساسا من الخلايا الكيراتينيه ويمكن أن تكون متباينة في أربع طبقات. باسل الطبقة يتكون من غير متمايزة الكيراتينيه القاعدية التي تنبثق باستمرار من خلايا الجلد السلف تساوت خلال مراحل أنواع الطبقة و الطبقة الحبيبية في الطبقة القرنية حماية الجسم من الجفاف والالتهابات2. الخلايا الصباغية هي الانحياز في الغشاء القاعدي، والتواصل من خلال ملحقات الجذعية مع الخلايا الكيراتينيه متعددة. وهي تنتج صبغة الميلانين لحماية أنسجة الجلد من الآثار الضارة للأشعة فوق البنفسجية، مثل شيخوخة الجلد والكبت المناعي والتهاب واستحثاث سرطان الجلد غير الميلانوما. الأشعة فوق البنفسجية الإشعاعات مساهمة لتحويل الخلايا الصباغية إلى الميلانوما الخبيثة، غير ما زال قيد المناقشة3.
تطوير الميلانوما متباينة في مراحل تطور الورم المختلفة، وتتميز ببعض التغيرات الوراثية والسمات النسجية4. أنها تنشأ أما حيثياته ، أو من وحمة الفطرية أو المكتسبة بسبب محلي زيادة انتشار الخلايا الصباغية تسبب نيوبلسا حميدة. تحويل هذه الآفة السلائف في الأنسجة ديسبلاستيك تم التعديل الهيكلي التي تحتوي على خلايا أتيبيك، التي قد تستمر إلى المرحلة الخبيثة الأولى، في مرحلة النمو شعاعي (RGP). وتتسم هذه المرحلة المبكرة من تطور الورم بالخلايا إشعاعيا تنتشر داخل البشرة، تظهر بعض الخلايا الغازية محلياً داخل الأدمة الحليمية. أثناء سرطان الجلد (VGP) المرحلة اللاحقة من النمو الرأسي إظهار الخلايا فعلا النمط الظاهري المنتشر والغازية باختراق الصفيحة القاعدية لاختراق أعمق أجزاء الأدمة، فضلا عن النسيج تحت الجلد5. وأخيراً، سرطان الجلد المنتشر (مم) يمثل المرحلة التقدم الأكثر عدوانية مع خلايا المنتشر عناصره ينتشر في جميع أنحاء نظام الدم والليمفاوية لغزو ديستالي أجهزة مثل الكبد والرئة والدماغ6.
حتى الآن، لا يزال التشخيص المبكر تليها الجراحة العلاج الأكثر فاعلية لسرطان الجلد الخبيث. غير أن يظل التشخيص للمرضى الذين يعانون من ورم خبيث البعيدة،7، لا سيما الفقيرة نظراً لنظم العلاج الكيميائي الكلاسيكي يضفي إلا القليل بقاء المنفعة8،9. ومع ذلك، بعد عقود من الركود، التقدم الذي أحرز مؤخرا في العلاجات المستهدفة قد تحسنا التشخيص لسرطان الجلد الخبيث.
التقلبات الكبرى mitogen تنشيط مسارين ورأس-سلاح الجو الملكي البريطاني--مجاهدي خلق-إيرك ومسارات الإشارات PI3K-عكة-فتن، يقدم الدوافع الرئيسية لتطور سرطان الجلد، خصوصا عند تنشيط مؤثرا الطفرات نقطة من BRAFV600 وبروتو و يتم تجاوزها الحالي10. وبناء على ذلك، وعدت اختراع المستهدفة kinase مثبطات فائدة علاجية للمرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. العديد من التجارب السريرية التي أجريت على هذه النقطة لم تحقق فائدة كبيرة للمرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. ما يقرب من جميع الردود جزئية، مع يتدنى مرضى تظهر المقاومة الأولية. وعلاوة على ذلك، لوحظ اقتناء الثانوي المقاومة مما أدى إلى انتكاسة في أغلبية المرضى11،12.
يصبح من الواضح أن تحليل حالة الطفرة وحدها ليست كافية لوضع استراتيجية علاجية أقوى. أدوات تشخيصية جديدة سريعة وموثوق بها ضرورية لتسجيل بشكل منهجي وتحليل مدى استجابة الخلايا السرطانية الفردية. قد تم الحصول على الغالبية العظمى من البيانات المتاحة حاليا بشأن سرطان الجلد البشري من الثقافات الخلية الميلانوما ثنائي الأبعاد (2D). الخلايا السرطانية، مع ذلك، نمت في 3D يسمح الحديث المتبادل بين الخلايا بين السرطان متمايزة الجمهرات الفرعية الخلية، وكذلك بين الخلايا السرطانية والأنسجة غير حولت المضيفة المحيطة. ولذلك، سيكون من الأفضل لإعادة بناء البيئة ثلاثية الأبعاد التي وضعت سرطان الجلد، لاستخدامها كفحص السريري النموذجي13،14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="625">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">fetal serum albumin (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td style="width:167px;">add 10 % to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300054</td>
			<td>1X dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870010</td>
			<td style="width:167px;">for cultivation of melanoma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">41965062</td>
			<td style="width:167px;">for cultivation of primary fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies&#160;</td>
			<td>17105041</td>
			<td>2U/ml, dissolve in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Collagen type I</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:167px;">usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">24-well inserts Nunclon&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Nunc</td>
			<td>140629</td>
			<td style="width:167px;">8 &#181;m pore size; use standing, not hanging inserts!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cell strainer</td>
			<td style="width:123px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td>yellow</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycine</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td>dissolve in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Keralife keratincyte medium</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">do not add FCS or antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase</td>
			<td style="width:123px;">SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>NB4 standard grade</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">juvenile human keratinocytes</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;">FC-0007</td>
			<td style="width:167px;">alternative to own preparation from juvenile foreskin</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">juvenile human fibroblasts</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;">FC-0001</td>
			<td style="width:167px;">alternative to own preparation from juvenile foreskin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">DMEM 
			[+] 4,5 g/l Glucose, 
			[+] L- Glutamine, 
			[-] L- Pyruvate</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">41965</td>
			<td style="width:167px;">mix 1:1 with Ham&#180;s F-12 for MM medium;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mix 3:1 with Ham&#180;s F-12 for EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ham&#180;s F-12 [+] L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">&#160;21765-029</td>
			<td style="width:167px;">add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EGF&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">&#160;13247-051</td>
			<td style="width:167px;">add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Merck Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">2381</td>
			<td style="width:167px;">add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Selenic acid</td>
			<td style="width:123px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">18851</td>
			<td style="width:167px;">add 53 nM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:123px;">Lilly</td>
			<td style="width:119px;">HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml</td>
			<td style="width:167px;">add 5 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">E-0135</td>
			<td style="width:167px;">add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">P-Ethanolamine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-0503</td>
			<td style="width:167px;">add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Holo-Transferrine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T-0665</td>
			<td style="width:167px;">add 5 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Triiodthyronine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-6397</td>
			<td style="width:167px;">add 20 pM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-088816</td>
			<td style="width:167px;">add 0.4 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8783</td>
			<td style="width:167px;">add 10 nM only for the generation of EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-3784</td>
			<td style="width:167px;">add 15 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Serine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-4311</td>
			<td style="width:167px;">add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cholinchloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-7017</td>
			<td style="width:167px;">add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">dFCS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F-0392 Lot 086K0361</td>
			<td style="width:167px;">add 2 % for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Adenine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-9795</td>
			<td style="width:167px;">add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-42209</td>
			<td style="width:167px;">add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Strontiumchloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">255521</td>
			<td style="width:167px;">add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti cytokeratin 10 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7002</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti cytokeratin 14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-53253</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;anti laminin 5 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-32794</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti filaggrin antibody</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-13440</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti involucrin antibody</td>
			<td style="width:123px;">Acris Antibodies</td>
			<td style="width:119px;">AM33368PU</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled</td>
			<td style="width:123px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-C153907</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled</td>
			<td style="width:123px;">Jackson Immuno Research</td>
			<td style="width:119px;">115-165-003</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10236276001</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d organotypic melanoma spheroid skin model

التحول الخبيث من الخلايا الصباغية، الخلايا الصبغية لجلد الإنسان، يسبب تشكيل لسرطان الجلد، سرطان عدوانية شديدة مع زيادة إمكانات المنتشر. في الآونة الأخيرة، مونو-تشيموثيرابيس مواصلة تحسين بسرطان الجلد تركيبة معينة العلاج بمثبطات كيناز المستهدفة. سرطان الجلد المنتشر لا يزال مرض يهدد الحياة نظراً لأن الأورام يحمل المقاومة الأولية أو تطوير المقاومة للعلاجات الرواية، وبالتالي استعادة القدرات الورمية. ضروري من أجل تحسين نجاح العلاج من سرطان الجلد الخبيث، تحديد الآليات الجزيئية التي تمنح المقاومة ضد نهج العلاج التقليدي؛ ومع ذلك، فإنه يتطلب نماذج مبتكرة الخلوية في المختبر . هنا، نحن نقدم في المختبر أورجانوتيبيك ثلاثية الأبعاد (3D) سرطان الجلد كروي نموذجا يمكن تصور البنية في فيفو الميلانوما الخبيثة وقد تضمن أفكاراً جديدة في داخل الأورام فضلا عن التفاعلات المضيف الورم. النموذج يتضمن أرقام محددة من الماغنيسيوم الميلانوما ناضجة والمتفاوتة في نموذج تعمير 3D جلد الإنسان كامل تتألف من خلايا الجلد الأولية. مركز التكوين والتمايز الخلوي الماغنيسيوم الميلانوما جزءا لا يتجزأ مشابهة للواحدة من الميلانوما الجلدية ورم خبيث في فيفو. استخدام نموذج كروي سرطان الجلد أورجانوتيبيك هذا دواء فحص منصة دعم تحديد المستجيبين لتحديد مجموعة من طرق العلاج، بينما تدخر عبء العلاج غير الضروري لغير المستجيبين، مما يؤدي إلى زيادة الاستفادة من التدخلات العلاجية.

Watch this Scientific Journal Video about A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model at JoVE.com

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء أورجانوتيبيك 3D الميلانوما جلد كروي نموذج الذي يلخص كل بنية وتعقيد متعددة الخلايا من الجهاز/ورم في الجسم الحي ولكن وفي الوقت نفسه يلائم المنهجية التجريبية التدخل.

نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

a-3d-organotypic-melanoma-spheroid-skin-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

15.6K Views.  TU-Dresden. هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء أورجانوتيبيك 3D الميلانوما جلد كروي نموذج الذي يلخص كل بنية وتعقيد متعددة الخلايا من الجهاز/ورم في الجسم الحي ولكن وفي الوقت نفسه يلائم المنهجية التجريبية التدخل.

Video: A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

اختبار في نموذج ثقافة خلية 3D على أساس كروي للرأس والرقبة الحرشفية خلية العلاج

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

مقايسة قتل كروي من خلايا تي السيارة

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture vessels versus in vivo in human patients. This is due to the bottleneck selection of clonal populations of melanoma cells that can robustly grow in vitro in the absence of physiological conditions. Further, responses to therapy in two-dimensional tissue cultures overall do not faithfully reflect responses to therapy in melanoma patients, with the majority of clinical trials failing to show the efficacy of therapeutic combinations shown to be effective in vitro. Although xenografting of melanoma cells into mice provides the physiological in vivo context absent from two-dimensional tissue culture assays, the melanoma cells used for engraftment have already undergone bottleneck selection for cells that could grow under two-dimensional conditions when the cell line was established. The irreversible alterations that occur as a consequence of the bottleneck include changes in growth and invasion properties, as well as the loss of specific subpopulations. Therefore, models that better recapitulate the human condition in vivo may better predict therapeutic strategies that effectively increase the overall survival of patients with metastatic melanoma. The patient-derived xenograft (PDX) technique involves the direct implantation of tumor cells from the human patient to a mouse recipient. In this manner, tumor cells are consistently grown under physiological stresses in vivo and never undergo the two-dimensional bottleneck, which preserves the molecular and biological properties present when the tumor was in the human patient. Notable, PDX models derived from organ sites of metastases (i.e., brain) display similar metastatic capacity, while PDX models derived from therapy naive patients and patients with acquired resistance to therapy (i.e., BRAF/MEK inhibitor therapy) display similar sensitivity to therapy.

Patient-derived xenograft (PDX) models more robustly recapitulate melanoma molecular and biological features and are more predictive of therapy response compared to traditional plastic tissue culture-based assays. Here we describe our standard operating protocol for the establishment of new PDX models and the characterization/experimentation of existing PDX models.

نموذج Xenograft مشتق من سرطان الجلد

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and invasive potential of cancer cells, and consequently the metastatic spread of disease, are being discovered and considered as complementary treatments in highly invasive cancers such as gliomas. Thus, generating data enabling the detailed analyses of cells in a 3D environment following the addition of a drug is required. The methodology described here, combining spheroid invasion assays with high-resolution image capture and data analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), enabled detailed characterization of the effects of the potential anti-migratory inhibitor MI-192 on glioma cells. Spheroids were generated from cell lines for invasion assays in low adherent 96-well plates and then prepared for CLSM analysis. The described workflow was preferred over other commonly used spheroid-generating techniques due to both ease and reproducibility. This, combined with the enhanced image resolution attained by confocal microscopy compared to conventional wide-field approaches, allowed the identification and analysis of distinct morphological changes in migratory cells in a 3D environment following treatment with the migrastatic drug MI-192.

The effects of migrastatic inhibitors on glioma cancer cell migration in three-dimensional (3D) invasion assays using a histone deacetylase (HDAC) inhibitor are characterized by high-resolution confocal microscopy.

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

رواية سترومال ليفيبليوم-تعديل 3D نموذج الورم كرويويد لدراسة الورم ستروما التفاعل واكتشاف المخدرات

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للورم الأرومي الدجلي

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...