Name: imaging serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the clarity/cubic technique
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique at JoVE.com

This work was supported by the Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), an NHMRC project grant (#1086643). Prof. George Paxinos is supported by a Senior Principal Research Fellow NHMRC grant (#1043626).

أخلاقيات الإعلان: جميع الإجراءات التي تجرى على الحيوانات يتبع المبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان والأخلاق (ACEC) في جامعة نيو ساوث ويلز (عدد ACEC وافق هو 14 / 94A). 1. إعداد شفاف الحبل الشوكي ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجليد الباردة هيدروجيل الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 16٪ من محلول بارافورمالدهيد (PFA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 16 غرام من مسحوق امتصاص العرق إلى 70 مل قبل تحسنت الماء المقطر (50-55 درجة مئوية) ويقلب على محرك مغناطيسي ساخنة حتى يذوب امتصاص العرق. ملاحظة: لا تسمح للحل للحرارة أكثر من 55 درجة مئوية، وتكون على علم بأن امتصاص العرق هي سامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل لامتصاص العرق على اسطوانة وإضافة الماء المقطر إلى 100 مل. تبريد حل لامتصاص العرق باستخدام 4 درجات مئوية الثلاجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 125 ملغ VA-044 البادئ في 26.25 مل من الماء المقطر وتبريد الحل في 4° C الثلاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بارد 5 مل من محلول مادة الأكريلاميد (40٪)، 1.25 مل مكرر حل (2٪) (تنبيه: مكرر والحلول الأكريلاميد سامة، قد تسبب تشوهات وراثية أو السرطان)، 5 مل 10X برنامج تلفزيوني، 12.5 مل 16٪ محلول PFA، و VA-044 حل البادئ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من الحلول السابقة على الجليد. ملاحظة: الحجم الكلي هو 50 مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح ومجموعة من الحبل الشوكي الماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (80 ملغ / كلغ) وxyzaline (5 ملغ / كلغ) المخفف في محلول ملحي 0.9٪. الجرعة فأرة الحاسوب يمكن أن يكون أقل من ذلك بالنسبة للفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سطح البلاستيك مناسب في غطاء الدخان، وتحديد أطرافه من الفأرة بعيدا عن الجسم (شريط لاصق غير فعال) مرة واحدة لا يستجيب الماوس لقرصة إلى جلدها القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجلد الماوس فوق الصدر ثم الصدر العظام لفضح القلب مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مضخة تحوي، مع إبرة 25 G المرفقة إلى thه نهاية الأنبوب، إدراج الإبرة في البطين الأيسر من القلب، قص الأذين الأيمن لإنشاء نقطة خروج الدم ثم تبدأ الغسيل مع محلول ملحي 40 مل 0.9٪ بمعدل ما يقرب من 10 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتماله، يروي الماوس مع 35 مل الجليد حل هيدروجيل البارد. ملاحظة: يروي بسرعة 10 مل / دقيقة لتجنب تورم في الأنسجة العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شق الجلد على الظهر مع شفرة ثم قم بإزالة العضلات بجانب الفقاريات. بعد قطع أقواس العمود الفقري على جانب واحد والتقليب منهم إلى الجانب الآخر، واتخاذ الحبل الشوكي من العمود الفقري مع مقص غرامة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الحبل الشوكي ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحبل الشوكي في 15 مل من محلول هيدروجيل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 مل من محلول هيدروجيل وتصب بقية الحل مع شرائح الحبل الشوكي إلى أنبوب 5 مل. ملء أنبوب 5 مل مع حل هيدروجيل حتى يكون كامل تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمتد قطعة صغيرة من بارافيلم على الجزء العلوي من أنبوب 5 مل ثم لف بارافيلم حول عنق الأنبوب. ملاحظة: تأكد من الاتصالات بارافيلم الحل هيدروجيل وعدم وجود فقاعات بين حل هيدروجيل وبارافيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب 5 مل في 37 &#160; ° C فرن بين عشية وضحاها. مراقبة الحل هيدروجيل حتى يصبح مادة هلامية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ أنبوب 5 مل من الفرن وإزالة هلام من أنبوب مع مفتاح البراغي (مثل جرف 1 مل ماصة). إزالة هلام من نسيج الحبل الشوكي عن طريق الالتزام الأنسجة الخشنة إلى هلام ثم أخذ الأنسجة الخشنة بعيدا (فإن جل التمسك الأنسجة، وبالتالي سوف يتم التوقف عن الأنسجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة هلام من نسيج الحبل الشوكي، وغسل النخاع الشوكي 4 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 24 ساعة على شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل المقاصة مكعب بحلول بحل 3.85 غرام اليوريا و3.85 ز ن، ن، ن &#39;، N&#39; tetrakis (2-هيدروكسي) ethylenediam<html> المعهد الوطني للإحصاء في 5.38 مل من الماء المقطر. ملاحظة: يتم استخدام النمام الساخن. إضافة 2.31 ز البولي ايثيلين جلايكول الأحادي ف isooctylphenyl الأثير / تريتون X-100 إلى الحل مرة واحدة فمن الواضح ويبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: 10 غرام من هذه المواد الكيميائية الثلاثة هم للماوس واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الحبل الشوكي الماوس coronally الى شرائح 2-3 ملم طويلة مع شفرة الحلاقة ووضعها في 5 مل من محلول تطهير CUBIC أعلاه. وضع على شاكر في الفرن على 37 &#160; ° مئوية لمدة 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة أيام، وتغيير الحل المقاصة إلى واحدة جديدة. ملاحظة: يتم تحضير المحلول المذكور أعلاه قبل استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق يومين إلى ثلاثة أيام بعد منعش الحل المقاصة مكعب، تحقق الشفافية في الأنسجة ضد ورقة مع الخط 8 حروف. إذا كانت شفافة، يمكن أن ينظر إلى الرسائل عبر النسيج مسح. إزالة حل المقاصة وإضافة 4 مل من PBST (0.1٪ تريتون-X100) لغسل الأنسجة 4 مرات يوميا (كل 6 ساعات). </li></ol></li></ol>معشوقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. المناعي تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شرائح الحبل الشوكي في حل الأجسام المضادة الأولية (مكافحة السيروتونين، التي أثيرت في الأرنب، المخفف 1: 100 في PBST) لمدة 3 أيام على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الأجسام المضادة وإضافة 4 مل من PBST (0.1٪ تريتون-X100) لغسل شرائح الحبل الشوكي 4 مرات يوميا (كل 6 ساعات) في 37 درجة مئوية الفرن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل PBST وإضافة محلول الأجسام المضادة الثانوية (594 الماعز مترافق المضادة للأرنب مفتش، المخفف 1: 100 في PBST) لاحتضان النسيج لمدة 3 أيام على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية وإضافة 4 مل من PBST لغسل شرائح الحبل الشوكي 4 مرات يوميا (كل 6 ساعات) على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن. في اليوم التالي الأنسجة جاهزة للتصوير. </li></ol> 3. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل PBST وإضافة 4 مل من 85٪ الجلسرين لجعل معامل الانكسار من الأنسجة حتى. </li><lط&gt; التحقق من وضوح الأنسجة. مرة واحدة هو واضح في ما يقرب من 1 ساعة، وضع النسيج على كبير، وشريحة زجاجية رقيقة الذي يناسب إطار عقد فلوري المجهر متعددة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بضع قطرات من الجلسرين 85٪ بجانب نسيج الحبل الشوكي وساترة مع ساترة زجاج 22 × 50 مم 2. ملاحظة: اتجاه الحبل الشوكي يقرر كيف تبدو صورة مثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريحة زجاجية على الإطار عقد المجهر الفلورسنت متعددة الفوتون ونقل الأنسجة في مسار الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار هيليوم نيون خط ليزر 594 نانومتر، وضبط شدة الليزر إلى المستوى الأمثل عن طريق التحقق من سطوع إشارة إيجابية في صورة حية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد منطقة المسح الضوئي للأنسجة الحبل الشوكي باستخدام الهدف 20X (في الماء، NA 0.7) والاستعداد لإنشاء ض المكدس، وعمق كل خطوة لتعيين 3 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الأنسجة من أعلى إلى أسفل ض المكدس تحت objec 20X(كان حجم الخطوة 1 ميكرون) TIVE ثم الهدف 63X (في مجال النفط، NA 1.4)، على التوالي. إعادة أشرطة الفيديو 3D باستخدام برنامج 3D 28. </li></ol>

<ol>
	<li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs:+partial+involvement+of+serotonergic+pathways.">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li><li>Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+brain+to+the+spinal+cord+in+the+mouse.">Projections from the brain to the spinal cord in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).</li><li>Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raphe+magnus+stimulation-induced+anti-nociception+in+the+cat+is+associated+with+release+of+amino+acids+as+well+as+serotonin+in+the+lumbar+dorsal+horn.">Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn.</a> Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).</li><li>Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+serotonin+metabolism+within+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+during+nucleus+raphe+magnus+stimulation,+as+revealed+by+in+vivo+electrochemical+detection.">Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection.</a> Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).</li><li>Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+patterns+of+serotonin+release+in+the+rat's+lumbar+spinal+cord+following+electrical+stimulation+of+the+nucleus+raphe+magnus.">Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus.</a> Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).</li><li>Bullitt, E., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+course+of+descending+serotoninergic+pathways+innervating+the+rodent+dorsal+horn+and+lamina+X.">Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X.</a> J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).</li><li>Jones, S. L., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Termination+patterns+of+serotoninergic+medullary+raphespinal+fibers+in+the+rat+lumbar+spinal+cord:+an+anterograde+immunohistochemical+study.">Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study.</a> J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).</li><li>Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonergic+innervation+of+the+dorsal+horn+of+rat+spinal+cord:+light+and+electron+microscopic+immunocytochemical+study.">Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study.</a> J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).</li><li>Morrison, S. F., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+branching+patterns+and+funicular+trajectories+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons.">Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons.</a> J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).</li><li>Barman, S. M., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axons+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons+branch+in+the+cervical+spinal+cord.">The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord.</a> Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).</li><li>Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raphespinal+projections+in+the+North+American+opossum:+evidence+for+connectional+heterogeneity.">Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity.</a> J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).</li><li>Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+serotonergic+projections+to+the+lumbar+spinal+cord+in+the+monkey+using+a+combined+retrograde+transport+and+immunocytochemical+technique.">Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique.</a> Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).</li><li>Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+somatotopic+organization+of+nuclei+projecting+via+the+dorsolateral+funiculus+in+rats:+a+retrograde+tracing+study+using+HRP+slow-release+gels.">Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels.</a> Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Ert&#252;rk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+(3DISCO).">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li><li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).</li><li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy.">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> NeuroImage. 101, 625-632 (2014).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+Alzheimer+brain+with+CLARITY:+senile+plaques,+neurofibrillary+tangles+and+axons+in+3-D.">Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).</li><li>Zhang, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain.">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 781 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OsiriX:+an+open-source+software+for+navigating+in+multidimensional+DICOM+images.">OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images.</a> J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وصف بروتوكول يبين كيفية الألياف صورة هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس مع وضوح جنبا إلى جنب وتقنيات مكعب. انه يقدم عملية المقاصة أسرع مقارنة مع بروتوكول المقاصة السلبي التي وضعتها تشيونغ وآخرون. 14 وتومر وآخرون. 15 ويسمح للأنسجة الحبل الشوكي لتكون معتمدة بشكل جيد من قبل هيدروجيل خلال المقاصة. خطوة هامة أثناء التثبيت من الحبل الشوكي الماوس، كما ذكرت من قبل تشيونغ وآخرون. 14 وتومر وآخرون. 15، هو الحفاظ على كل الحلول باردة على الجليد، والذي يمنع البلمرة من المواد الكيميائية. الخطوة الهامة الأخرى هي أن يروي الماوس ببطء مع حل هيدروجيل لتجنب تورم في الأنسجة العصبية. من أجل حل هيدروجيل لتصبح مادة هلامية، مطلوب التفريغ. وكبديل لذلك، كنا بارافيلم لتغطية الجزء العلوي من الأنبوب وترك أي فقاعات الهواء بين لمؤسسات احل روجيل وبارافيلم. عملت هذا بشكل جيد للغاية، وأصبح الحل هيدروجيل هلام بعد بضع ساعات. على الرغم من أن وجدت بعض الفقاعات في هلام، إلا أنها لم تتدخل في التجارب التالية، والتي يتضح من عدم وجود فقاعات في أنسجة الحبل الشوكي. المقاصة هو الخطوة الأكثر أهمية، ويتطلب مجموعة من الكواشف. الحل المقاصة، التي تحتوي على الأمينية للكحول، يزيل الدهون من الأنسجة الحبل الشوكي أسرع بكثير من / البوريك حمض أساس حل المقاصة SDS المستخدمة في بروتوكول ضوح الأصلي 16. ميزة الوضوح ومكعب خلال تقنيات المناعى التقليدية هي أن كتلة الأنسجة بأكمله ولا يمكن تصوير دون باجتزاء الأنسجة، ونتيجة لذلك، يتم الاحتفاظ استمرارية الألياف هرمون السيروتونين، وأنه من الممكن اتباع نفس الألياف لمسافات طويلة ضمن ض المكدس. مع هذه الميزة، الضمان الإضافي يمكن تحديدها بثقة مع الصور 3D، لالثانية استنتاجات جديدة وبالتالي، يمكن أن تكون حول طبيعة مسارات هرمون السيروتونين. بروتوكول صفها هو أداة مريحة للتحقيق في أنظمة الألياف، وكذلك نوى ببساطة عن طريق وصفها الأنسجة مع الأجسام المضادة المحددة. هذا الأسلوب هو أيضا خيارا مثاليا لاستجواب أنظمة مختلفة في نفس دماغ الفأر باستخدام الوسم ضعفين أو ثلاثة أضعاف. في وضع المختبر لدينا، كان متعدد الفوتون المجهر الفلورسنت المتاحة مع مسافة عمل ما يقرب من 300 ميكرون. هذا يحد من صورتنا إلى حد أقصى قدره 600 ميكرون إذا يتم تفحص كلا الجانبين من الأنسجة. ومع ذلك، خفيفة ورقة المجهر الفلورسنت، يمكن أن الصورة مخ الفأر كامل والحبل الشوكي من خلال من العرض الكامل والطول والعمق. ميزة أخرى من هذا الأسلوب هو أن الأجسام المضادة يمكن مزال ثم الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة آخر مختلف تطبيقها مرة أخرى لنفس النسيج. وهذا يقلل من استخدام الحيوانات بشكل كبير فضلا عن التكاليف المرتبطة إعداد أنسجة المخ جديدةلكل تجربة. لنفس السبب، ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى الأنسجة الأخرى. وقد تم بالفعل هناك دراسات أجريت على الرئتين والكلى والقلب والأمعاء، ونسيج الورم 26،27. وهناك أيضا قيود على هذا الأسلوب، على سبيل المثال، نواة الرفاء في الدماغ المؤخر الماوس يحتوي على العديد من أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية GABAergic. على الرغم من وضوح وCUBIC سيسمح لدراسة توزيع أنواع مختلفة من الألياف raphespinal في دماغ الفأر واحد والحبل الشوكي. هذه الخلايا العصبية، التي لم يتم تحديدها تحديدا من قبل الناقلات العصبية أو علامات البروتين، لا يمكن تحديدها في هذا الإعداد. وبديل ذلك هو لتسمية الخلايا العصبية محددة أو أنظمة الألياف مع تحقيقات الحمض النووي مثل التهجين في الموقع. وهذا هو، من ناحية أخرى، والتي يقيدها نظام وضع العلامات والفلاتر المتاحة للتصوير الفلورسنت. تصوير جميع الألياف raphespinal بالتالي لا يزال يشكل تحديا.إذا تم الجمع بين هذه التقنيات مع حقنة داخل الجمجمة من التتبع تقدمي (مثل فاصولياء شائعة leucoagglutinin - فا-L)، قد يكون من الممكن أن نرى الألياف هرمون السيروتونين، والألياف GABAergic، وغيرها.

Supraspinal projections are responsible for the modulation of diverse behaviors such as pain perception. One of the projections carrying nociceptive information contains serotoninergic fibers, which originate from the hindbrain raphe and adjacent reticular nuclei1,2. Physiological and pharmacological studies have demonstrated an increased release of serotonin in the dorsal horn of the spinal cord after electrical stimulation of the raphe nuclei in the hindbrain3-5. In the rat and opossum, serotonergic raphespinal fibers have dense terminals, not only in the dorsal horn6-8, but also in the intermediate zone7,9,10, the ventral horn7,11, and even lamina 1012,13. There are no similar studies in the mouse. The present study aimed to map the termination pattern of serotonergic fibers arising from the hindbrain raphe nuclei and their adjacent reticular nuclei in the mouse spinal cord using the recently published CLARITY14 method and its modification - CUBIC15. 
Conventional fluorescence or peroxidase immunohistochemistry of the spinal cord clearly shows the distribution of serotonergic fibers in the gray matter of the spinal cord in 30-40 &#181;m thick cross-sections. However, this approach does not show the continuity of the serotonergic fiber tracts in the white matter and their collaterals in the gray matter. Although the 3D reconstruction of histological sections has advanced our knowledge of fiber tracts, it remains a challenge for histologists and anatomists to follow a single tract due to small distortions in the tissue caused by cutting. To circumvent this obstacle a number of researchers have developed various protocols for making the whole tissue structure transparent, and collecting an image of unaltered tissue in a single video file17-21. So far, the clear, lipid-exchanged, acrylamide-hybridized rigid, imaging/ immunostaining compatible, tissue hydrogel (CLARITY) technique, developed by Deisseroth's group14,15, as well as CUBIC, developed by Susaki et al16 are the most successful. Since the publication of the protocols, many researchers have started using these techniques to investigate various aspects of biological tissues, including, not only the brain22-25, but also the heart, kidneys, intestine, and the lungs26,27. 
By fixing the mouse spinal cord with the hydrogel solution (CLARITY) and clearing with the CUBIC reagents (which is a much faster method than that described by the original CLARITY protocol14,15), a spinal cord tissue block of 2-3 mm long was cleared within two weeks and immunofluorescence staining for serotonin completed in eight days. With just a combination of chemical agents, conventional immunohistochemistry can be used to create an image of individual fiber tracts in a 3D video file in approximately one month.

<table><tbody><tr><td>Photoinitiator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>40% acrylamide solution</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>2% Bis Solution</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-&lt;br/&gt;879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&amp;amp;region=AU</td></tr><tr><td>urea</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N&#039;,N&#039;-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&amp;reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&amp;amp;region=AU</td></tr><tr><td>serotonin antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&amp;reg; 594 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>multi-photon microscope</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

imaging serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the clarity/cubic technique

الألياف الهابطة طويلة إلى الحبل الشوكي ضرورية للتحرك، الإحساس بالألم، وغيرها من السلوكيات. نمط إنهاء الألياف في الحبل الشوكي لغالبية أنظمة الألياف هذه لم يتم التحقيق بدقة في أي نوع من الأنواع. الألياف هرمون السيروتونين، التي المشروع إلى الحبل الشوكي، وقد درست في الفئران وopossums على أقسام النسيجية وتم الأهمية الوظيفية استنتاجها على أساس نمط إنهاء الألياف في الحبل الشوكي. مع تطور وضوح وتقنيات مكعب، فمن الممكن للتحقيق في هذا النظام الألياف وتوزيعه في الحبل الشوكي، والتي من المرجح أن تكشف عن ميزات لم تكن معروفة سابقا من مسارات فوق الشوك هرمون السيروتونين. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لتصوير الألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس باستخدام وضوح جنبا إلى جنب وتقنيات مكعب. الأسلوب ينطوي على نضح من الفأر مع حل هيدروجيل وتوضيح الأنسجة مع تنافسيةأوجه تطهير الكواشف. تم تطهير أنسجة الحبل الشوكي في أقل من أسبوعين، واكتمل تلوين مناعي لاحقا ضد السيروتونين في أقل من عشرة أيام. مع المجهر الفلورسنت متعددة الفوتون، وتفحص الأنسجة وإعادة بنائها صورة 3D باستخدام برنامج سيريكس.

يعرض هذا القسم النتائج من تلطيخ السيروتونين الأجسام المضادة في الحبل الشوكي الماوس شفافة باستخدام مزيج من وضوح والبروتوكولات مكعب. وتبين لنا أن الألياف هرمون السيروتونين موجودة في كل صفيحة من الحبل الشوكي مع غلبة في الجزء البطني من القرن البطني (الشكل 1، وانظر أيضا فيديو 1). لم الأنسجة السيطرة ليس لديهم انسجة إيجابية (لم تظهر نتيجة). في القرن البطني، والألياف هرمون السيروتونين المكتظ موجودة في جزء بطني إنسي من القرن البطني وأنها تمتد نحو الجزء الجانبي من القرن البطني (الشكل 2، وانظر أيضا فيديو 2). تمتد بعض الألياف immunopositive أيضا من القرن البطني نحو القرن الظهري أو القناة المركزية. الألياف Immunopositive موجودة في كل صفيحة من القرن الظهري ولكن هناك فجوة صغيرة بين الألياف إيجابية في الصفيحة 2 و 4، وخصوصا في الوحشيجزء من القرن الظهري. غالبية الألياف هرمون السيروتونين في القرن الظهري ذات القطر الصغير وفقط عدد قليل منهم من القطر الكبير (فيديو 1). في القسم الأفقي، لوحظت الألياف هرمون السيروتونين المزدحمة بالسكان في القرن البطني للسفر على طول المحور الطولي للحبل الشوكي وتشكيل حزمة من الألياف كبيرة. هذا الاكتشاف الأكثر إثارة للاهتمام هو أن هذه الألياف حزمة كبيرة تصدر فروع بانتظام على طول المحور الطولي، والتي هي عمودي على حزمة من الألياف. هذه الفروع برهن كذلك على طول مساراتها إلى الجزء الجانبي من القرن البطني. مقارنة مع هذه الفروع، ومنها تمتد نحو خط الوسط وعدم انتظام وأصغر (الشكل 2). في إطار الهدف 63X، لوحظت الألياف هرمون السيروتونين في القرن الظهري للسفر على طول محور من الحبل الشوكي وتنتهي في نقاط مختلفة على طول مسار القناة. يتم توزيع ألياف سميكة بشكل متقطع بين و رقيقة<html> ibers (الشكل 3، وانظر أيضا الفيديو 3). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53673/53673fig1.jpg" /> الشكل 1: الألياف هرمون السيروتونين في قسم الاكليلية من الحبل القطني في 200X التكبير اليسار هو القرن البطني، والحق هو القرن الظهري، الظهرية هو الجزء الأنسي من النخاع الشوكي، وبطني هو الجزء الجانبي من الحبل الشوكي. شريط المقياس هو 100 ميكرون. الألياف هرمون السيروتونين موجودة في كل صفيحة، وخصوصا في الجزء بطني إنسي من القرن البطني حيث كثافة ألياف عالية. هذه الألياف تمتد نحو كل من الجزء الجانبي من القرن البطني والقناة أو القرن الظهري المركزي. كثافة الألياف في صفيحة أخرى منخفضة. غالبية الألياف هرمون السيروتونين هي رقيقة. فقط عدد قليل من الألياف سميكة وينظر إليهم في كل من القرن الظهري والقرن البطني (&gt; انظر أيضا فيديو 1 (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل)). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53673/53673fig2.jpg" /> الشكل 2: الألياف هرمون السيروتونين في الجزء البطني من القرن البطني في 200X التكبير اليسار واليمين هي الاطراف الجانبية للنخاع الشوكي، الظهرية هو جزء منقاري من الحبل الشوكي، وبطني هو الجزء الذيلية من الحبل الشوكي. شريط المقياس هو 100 ميكرون. وتظهر الألياف هرمون السيروتونين السفر على طول المحور الطولي من الحبل الشوكي ومعبأة في الجزء الأنسي من القرن البطني حيث أنها تشكل حزمة من الألياف الكثيفة. من هذه الحزمة، يتم توسيع بعض الفروع على فترات منتظمة نحو الجزء الجانبي من القرن البطني، في حين أن البعض الآخر أن يمتد إلى خط الوسط وعدم انتظام وأقصر. هذه الألياف تنتهي في العديد من النقاط على طول مسار القناة ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53673/Video2.mp4">انظر أيضا فيديو 2</a>(انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل)). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53673/53673fig3.jpg" /> الشكل (3): ألياف هرمون السيروتونين في القرن الظهري تحت في 630X التكبير اليسار هو الجزء الجانبي للحبل الشوكي، هو حق الجزء الأنسي من النخاع الشوكي، ظهري وبطني الرجوع إلى ظهري وجزء بطني من القرن الظهري، على التوالي. . شريط المقياس هو 7 ميكرون. الألياف هرمون السيروتونين يسافرون على طول المحور الطولي للحبل الشوكي وإنهاء طول مسار القناة. هذه الألياف بشكل رئيسي بقطر صغير مع عدد قليل من الألياف الكثيفة المختلطة. هذه الألياف نادرا ما تتداخل مع بعضها البعض ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53673/Video3.mp4">انظر أيضا فيديو 3 (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل)</a> ).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique at JoVE.com

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

imaging-serotonergic-fibers-mouse-spinal-cord-using-claritycubic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K Views.  Neuroscience Research Australia. Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Video: Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

التصوير مسح النظم البيولوجية السليمة على المستوى الخلوي عن طريق 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من الحبل الشوكي ماوس

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

التصوير والتحديد الكمي للتشعبات العصبية السليمة عن طريق إزالة الأنسجة الوضوح

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

طريقة تطهير الأنسجة للتصوير العصبي من المقاييس المتوسطة إلى المجهرية

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Establishing a Mouse Contusion Spinal Cord Injury Model Based on a Minimally Invasive Technique

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, thereby improving the reproducibility of the experiments.
These methods need two requirements to be fulfilled: clarity of the surgical anatomical pathway and simplicity and convenience of the laboratory device. Crucially for the operator, a clear anatomical pathway provides minimally invasive exposure, which avoids additional damage to the experimental animal during the surgical procedures and allows the animal to maintain a consistent and stable anatomical morphology during the experiment.
In this study, the use of a novel integrated platform called the SCI coaxial platform for spinal cord injury in small animals to expose the T9 level spinal cord in a minimally invasive way and stabilize and immobilize the vertebra of mice using a vertebral stabilizer is researched, and, finally, a coaxial gravity impactor is used to contuse the spinal cord of mice to approach different degrees of T9 spinal cord injury. Finally, histological results are provided as a reference for the readers.

Minimally invasive techniques and a simple laboratory device improve the reproducibility of the spinal cord injury model by reducing operative damage to the experimental animals and allowing anatomical morphology maintenance. The method is worthwhile because the reliable results and reproducible procedure facilitate investigations of the mechanisms of disease reparation.

إنشاء نموذج إصابة الحبل الشوكي لكدمة الفأر بناء على تقنية طفيفة التوغل

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, ...

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>تصوير الأمعاء ب "الوضوح"

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

تصوير الأمعاء ب "الوضوح"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...