وأيد هذا العمل عن طريق التصلب المتعدد في الجمعية الوطنية منح RG4595A1 / T لDD ومنح المعاهد الوطنية للصحة / NINDS NS051470 ، وNS052189 NS066361 إلى أرقام KA تكييفها والأفلام و / أو إعادة طبعها من دافالوس وآخرون ، J طرق Neurosci. 2008 مارس 30 ؛ 169 (1) :1 - 7 حقوق التأليف والنشر عام 2008 ، بإذن من السيفير.

1. بناء جهاز تثبيت العمود الفقري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النظام STS - A Narishige ضغط المشابك الحبل الشوكي وMA - 6N Narishige عقد رئيس المحول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العرف تصميم وصنع قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة لعقد جزأين Narishige في محاذاة بحيث يتم اعتماد رأس الحيوان في حين فرضت عموده الفقري والذيل. نضع في اعتبارنا أن الجهاز بأكمله وينبغي أن تندرج تحت عدسة المجهر عادة على مسرح المجهر خفضت. </li></ol> 2. جراحة الحيوان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل حرارة الغرفة المجهر مع الهواء جهاز التدفئة والحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الحيوان وجعل هذا المزيج باستخدام مخدر الكيتامين 100 ملغ ، 15 ملغ و 2.5 زيلازين آسيبرومازين ملغ لكل كيلوغرام من وزن الجسم ، ويخفف في محلول كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ في ظل ظروف معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير عن طريق حقن الحيوان المزيج مخدر (KXA) intraperitoneally. يجب أن يتم تنفيذ العادية معسر أخمص القدمين لضمان تخدير عميق في جميع أنحاءالتجربة. الملحق مع جرعة نصف ساعة الأصلي أو حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وسادة التدفئة الحيوانات الصغيرة لتقديم الدعم الحرارية أثناء تنفيذ العملية الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم الدموع الاصطناعية في العيون لمنع جفاف القرنية والاضرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق ظهر أول حيوان مع جهاز تقليم ثم بشفرة حادة لإزالة الشعر من المنطقة حول شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشعر وحلق تطهير سطح الجلد حلق مع منصة الكحول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ صغيرة (~ 1.5 سم) شق طولي من الجلد على مستوى العمود الفقري المطلوب (الفقرات الصدرية هو موضح هنا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض عضلات الظهر من خلال التراجع بعناية النسيج الضام تحت الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منفصلة بعناية عضلات مجاورة للفقرة من العمود الفقري على المستوى المطلوب. أداء أقل عدد ممكن شقوق لفصل العضلات من كلا الجانبين من كل عملية الشائكة ومن ثم كشط عضلات بمعزل عن العالمالطريق من سطح الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الصفيحة التي سيتم إزالتها وتحضير مواقع لدخول المشابك الشوكي على كل جانب من العمود الفقري ، والذيلية منقاري فورا إلى الثقب. تهجير بعناية النسيج العضلي لإعداد أربع جيوب حيث سيتم إدراج المشابك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع العمود الفقري مع ملقط مسنن اخبارية مباشرة للسماح الإدراج الآمن للفظة مقص معلومات سرية تحت الصفيحة المنحنية دون لمس الحبل الشوكي. نفذ الثقب عن طريق قطع العظام ببطء على جانب واحد ، ثم على الجانب الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مسحة القطن أو إدراج قبل القطع الصغيرة جلفوم امتصاص قطعة الاسفنج الجيلاتين بجوار الشقوق للحد من نزيف طفيفة. استخدام cauterizer سفينة صغيرة للسيطرة على النزيف مرة أخرى إذا لزم الأمر. استخدام مسخن عقيم السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) لغسل الأنسجة. </li></ol> 3. تحقيق الاستقرار في العمود الفقري ، والإعداد للتصوير في الجسم الحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PLAC<html> ه الحيوان على منصة الارتفاع على لوحة قاعدة الجهاز لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري والرأس في تأمين محول رئيس القابضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المشابك الشوكي للجهاز A - STS على طول المحور الأمامي الخلفي للحيوان في جيوب معدة سلفا المحيطين الثقب (الشكل 1). ينبغي وضع المشابك اثنين في زاوية من ~ 45 درجة بالنسبة للمحور rostro - الذيلية الحيوان للسماح مساحة كافية لخفض عدسة غمر الماء على الحبل الشوكي معرضة (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع المشبك الثالث للجهاز A - STS على قاعدة الذيل بحيث يمكن تعليق جسم الحيوان في الهواء بعد إزالة لوحة الارتفاع لمدة من تجارب التصوير (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء بئر صغيرة من Gelseal (أمرشام العلوم البيولوجية كورب) حول الحبل الشوكي معرضة لتسهيل الحفاظ على النخاع الشوكي في ACSF وغمر عدسة المجهر في هذا الحل لالمجراة في التصوير. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. التصوير في الجسم الحي من الحبل الشوكي الماوس مع اثنين الفوتون المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوانات على الجهاز الاستقرار في العمود الفقري داخل غرفة محمى تغطي المجهر وثبته على مسرح المجهر خفضت وضع الثقب مباشرة تحت العدسة (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض عدسة غمر المياه بعناية في حل ACSF التأكد من أنها لا تلمس المشابك الشوكي أو في Gelseal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام epifluorescence لتحديد مجال الاهتمام والتركيز على ذلك. التبديل إلى وضع وتنفيذ مسح بالليزر في مجال التصوير فيفو باستخدام الليزر المناسب إثارة اثنين فوتون الطول الموجي ، وممر الموجة dichroics المرشحات للfluorophores موجودة في الأنسجة المصورة. </li></ol> 5. تكرار التصوير والرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية التجارب والتصوير ، وإزالة الماوس من الجهاز لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري ويمسح بعناية Gelseal من المنطقة حول الثقب.تنظيف المنطقة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة وخياطة عضلات الظهر خلال الثقب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة وخياطة الجلد فوق الثقب ، مع مسحة betadine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 توفير حل مل قارعو الأجراس Lactated (باكستر للرعاية الصحية) كمكمل المغذيات والماء ، فضلا عن العلاج مسكن تحت الجلد (0.1 ملغ / كلغ البوبرينورفين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة مطهر intraperitoneally العلاج (0.03 مل في الماوس ، enrofloxacin حقن محلول مضاد للبكتيريا 2.27 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوان مكان على لوحة التسخين حتى الشفاء التام من التخدير وبيت لاحقا بشكل فردي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الادارة مطهر يوميا لمدة 3-5 أيام الأولى بعد الجراحة والعلاج مسكن كل 8-12 ساعة لمدة 2-3 أيام بعد العملية. مراقبة الحيوانات يوميا لضمان السلوك الطبيعي والشفاء التام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعادة التصوير من خلال الثقب نفسه ، فتح خياطة الجلد والعضلات وكرر الخطوات المذكورة في القسمين 2 -- 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تحديد موقع previتصوير ously المنطقة باستخدام الأوعية الدموية الدم كخريطة كما هو موضح سابقا 10. </li></ol> 6. ممثل النتائج تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية في إطار المبادئ التوجيهية التي وضعتها رعاية الحيوان واللجان المؤسسية استخدم في جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، ويتم وفقا للوائح الفيدرالية. ويظهر صورة لجهاز تثبيت العمود الفقري وتخطيطي يبين موضع ماوس على الجهاز تحت عدسة المجهر في الشكل 1. إتاحة المجال الكافي للحركات التنفس تحت جسم الحيوان يضمن استقرارا في التصوير المجراة في الحبل الشوكي. الشكل 2 يوضح العلاقة الوثيقة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والأوعية الدموية وكما كان تصويره في الجسم الحي في الحبل الشوكي من Cx3cr1 GFP / + الفئران المعدلة وراثيا 18 ، التي وصفت التطور الطبيعي مع الخلايا الدبقية الصغيرة GFP. ويبين الشكل 3 أمثلة متكررةفي مجال التصوير فيفو كما تم تنفيذ ذلك في مجالات الحبل الشوكي نفسه في الفئران التعبير عن بروتين فلوري في المحاور العصبية في العمود الفقري (YFP - H الخط 3) والخلايا الدبقية الصغيرة (في الفئران Cx3cr1 GFP + /). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" /> الشكل 1. تثبيت العمود الفقري للماوس في الجسم الحي التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري : (أ) استخدمت قاعدة فولاذية صنعت خصيصا لوحة لدعم ومواءمة STS - A المدمجة المشابك Narishige الحبل الشوكي وMA - 6N Narishige عقد رئيس محول كما هو موضح هنا. (B) لتحديد المواقع المناسبة من الفئران المعدلة وراثيا الكبار مع تخدير مخدر KXA على الجهاز الاستقرار في العمود الفقري. إدراج يبين موضع المشابك الشوكي فورا وrostrally caudally إلى استئصال الصفيحه ويتعرض النسيج في الحبل الشوكي. &lt;img وALT = &quot;الشكل 2&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. التصوير في الخلايا الحية دبقية صغيرة عالية الكثافة والأوعية الدموية في الحبل الشوكي للفئران تخدير. ولكن من المتوقع عدم الانحياز Z - أكوام من (أ) عالية الكثافة GFP إيجابية الخلايا الدبقية الصغيرة (الخضراء) في الحبل الشوكي لGFP CX3CR1 الماوس + / على مقربة مع الأوعية الدموية (أحمر ، وصفت مع حقن الرابع من ديكستران رودامين). (ب) صورة عالية التكبير وصفت بأنها في (أ) من خلية واحدة دبقية صغيرة تعلق على جدار الوعاء الدموي مع العمليات الموسعة حول سفينة ونحو لحمة الحبل الشوكي. أشرطة النطاق ، 10μm. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" /> الشكل 3. المتكرر في التصوير المجراة من شرائح محواري نفسها والخلايا الدبقية الصغيرة حيث تم نقلهم وreimaged في الحبل الشوكي للفئران تخدير في أيام مختلفة. (أ) YFP - LAB<html> إليد المحاوير في الأيام 0 و 5. (B). التقط نفس الهياكل الأوعية الدموية وخلايا دبقية صغيرة من حولهم في الجسم الحي في الحبل الشوكي من Cx3cr1 GFP / + على الفئران أيام 0 و 1. أشرطة النطاق ، 10μm. الفيلم الممثل timelapse 1. تسلسل المكتسبة في الجسم الحي من الحبل الشوكي الماوس. هذا التسلسل يظهر في التفاصيل الدقيقة ديناميات العملية دبقية (الخضراء) وتفاعلاتها مع الأوعية الدموية (أحمر ، وصفت مع حقن الرابع من ديكستران رودامين) بمرور الوقت داخل الأنسجة ذات الكثافة السكانية العالية مع الهياكل الفلورسنت. تم تصحيح الصور الخام فقط عن سطوع الخلفية ، الضجيج والتباين وشيد الفيلم timelapse بواسطة Z - إسقاط صورة مداخن المكتسبة بالتسلسل ، من دون محاذاة الصورة ، أو المتوسط ​​ض اختيار طائرات الفردية. الأوعية الدموية تذهب من خلال مجموعة مماثلة من طائرات ض كما صور الخلايا الدبقية الصغيرة. Z عمق الطائرة : 38 ميكرومتر.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة الفيلم. تسلسل الفيلم Timelapse 2. مما يدل على استقرار الخام للأسلوب التصوير على مستوى طائرة زي واحد. اقتناء سريع من نفس واحدة ض الطائرة في النخاع الشوكي للفئران GFP CX3CR1 / + وضعت على جهاز تثبيت العمود الفقري تحت التخدير KXA ، يوضح الحد الأدنى من التشرد بين الإطارات صورة متتالية بمعدل المسح من 1 ق / الإطار الذي هو أسرع من معدل التنفس من الفأرة. نزوح ثانوية المتبقية ربما يرجع الى ضربات القلب. <a alt="Movie 2" href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.</a>

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system.">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex.">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420, 812-816 (2002).</li><li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons.">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385, 161-165 (1997).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca2++signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo.">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li><li>Christie, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+arrest+of+individual+senile+plaques+in+a+model+of+Alzheimer's+disease+observed+by+in+vivo+multiphoton+microscopy.">Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy.</a> J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).</li><li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches.">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2++signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion.">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo.">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li><li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure.">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

الطريقة الموضحة هنا يسمح مستقرة ومتكررة في مجال التصوير فيفو الهياكل ذات الكثافة السكانية العالية الخلوية فلوري في النخاع الشوكي للفئران تخدير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. والاستقرار الذي تحقق هو نتيجة لجهاز صنعت خصيصا لتحقيق الاستقرار في العمود ا?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> رودامين B ديكستران </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 كيلو دالتون ، مخففة في ACSF (3 ٪ ث / ت) </td></tr><tr><td> الكيتامين حمض الهيدروكلوريك </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC رقم : 67457-001-10 </td><td> عن طريق الحقن ، 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> مختبرات لويد </td><td> ندى رقم : 139-236 </td><td> زيلازين عن طريق الحقن ، 20mg/ml </td></tr><tr><td> آسيبرومازين </td><td> Vedco </td><td> ندى رقم : 117-531 </td><td> عن طريق الحقن ، 10mg/ml </td></tr><tr><td> دموع اصطناعية مرهم </td><td> عنقاء الأدوية </td><td> NDC رقم : 57319-760 -- 25 </td><td> زيوت التشحيم </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> الصياد </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> مكفرسون - يستكوت مقص </td><td> العالم الدقة الصكوك </td><td> 555500S </td><td> منحني ، كليلة معلومات سرية مقص </td></tr><tr><td> مستقيم الملقط </td><td> العالم الدقة الصكوك </td><td> 555047FT </td><td> ملقط مسنن الحافة </td></tr><tr><td> سفينة صغيرة يكوي </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> جلفوم </td><td> فارماسيا ، فايزر </td><td> الخلاط مطحنة MM400 </td><td></td></tr><tr><td> ضغط الحبل الشوكي المشابك </td><td> Narishige </td><td> STS - A </td><td></td></tr><tr><td> عقد رئيس محول </td><td> Narishige </td><td> MA - 6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> أمرشام العلوم الحيوية كورب </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated قارعو الأجراس </td><td> باكستر للرعاية الصحية &lt;/ TD&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit بينكيزر شركة المستحضرات الصيدلانية </td><td> NDC رقم : 12496 -- 6757-1 </td><td> البوبرينورفين ، حقن </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> باير </td><td> ندى 140-913 </td><td> Enrofloxacin ، حقن مضادة للجراثيم 2.27 ٪ (20ml) </td></tr><tr><td> سادة التدفئة -- كبير </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy

في الجسم الحي التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري 1 في الفئران التي تمت هندستها وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية في أنواع الخلايا المحددة 2-3 اتسع بشكل ملحوظ معرفتنا العمليات الفسيولوجية والمرضية في أنسجة عديدة في الجسم الحي 4-7. في دراسات الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، كان هناك تطبيق واسع النطاق في مجال التصوير من المجراة في الدماغ ، الذي أنتج مجموعة كبيرة من النتائج غير المتوقعة والرواية كثيرا عن سلوك من الخلايا مثل الخلايا العصبية ، الخلايا النجمية ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، في إطار ظروف فيزيولوجية أو مرضية 17/08. ومع ذلك ، فقد التعقيدات التقنية محدودة معظمها في تنفيذ التصوير في الدراسات المجراة الذين يعيشون الحبل الشوكي الماوس. على وجه الخصوص ، على مقربة التشريحية من الحبل الشوكي إلى الرئتين والقلب الكبير يولد حركة القطع الأثرية التي تجعل من تصوير الحبل الشوكي المعيشة مهمة صعبة. </P&gt; طورنا أسلوب الرواية التي يتغلب على القيود المتأصلة في تصوير الحبل الشوكي عن طريق تثبيت العمود الفقري ، والحد من الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات وبالتالي تيسير استخدام ثنائي الفوتون المجهري لصورة الحبل الشوكي الماوس في الجسم الحي. ويتحقق ذلك من خلال الجمع بين جهاز مخصص لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري مع وسيلة لتخدير عميق ، مما أدى إلى انخفاض كبير في الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات. هذا البروتوكول فيديو يوضح كيفية كشف مساحة صغيرة من الحبل الشوكي الحية التي لا يمكن الحفاظ عليه في ظل الظروف الفسيولوجية مستقرة على مدى فترات طويلة من الزمن عن طريق الحفاظ على إصابة الأنسجة والنزيف إلى أدنى حد ممكن. الحصول على الصور الخام ممثل بالتفصيل المجراة في ارتفاع القرار على العلاقة الوثيقة بين الأوعية الدموية والخلايا الدبقية الصغيرة في. تسلسل timelapse يوضح السلوك الديناميكي للعمليات دبقية صغيرة تعيش في الحبل الشوكي الماوس. علاوة على ذلك ، تفحص المستمر من الإطار - Z إثبات نفسهق استقرار المعلقة أن هذا الأسلوب يمكن أن يحقق لتوليد اكوام من الصور و / أو الأفلام timelapse التي لا تتطلب محاذاة صورة ما بعد الاستحواذ. أخيرا ، وتبين لنا كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لإعادة النظر في وreimage نفس المنطقة من الحبل الشوكي في timepoints في وقت لاحق ، مما يسمح للدراسات طولية من العمليات الجارية فيزيولوجية أو مرضية في الجسم الحي.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy at JoVE.com

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

بروتوكول مينيملي لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري وأداء الماوس المتكررة<em&gt; في الجسم الحي</emيوصف&gt; تصوير الحبل الشوكي باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. هذا الأسلوب يجمع بين جهاز تثبيت العمود الفقري ونظام للحد من مخدر الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات وإنتاج بيانات التصوير الخام التي لا تحتاج إلى محاذاة أو غيرها في مرحلة ما بعد المعالجة.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

in-vivo-imaging-of-the-mouse-spinal-cord-using-two-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

23.7K Views.  University of California, San Francisco. بروتوكول مينيملي لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري وأداء الماوس المتكررة في الجسم الحي تصوير الحبل الشوكي باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. هذا الأسلوب يجمع بين جهاز تثبيت العمود الفقري ونظام للحد من مخدر الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات وإنتا...

Video: In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من الحبل الشوكي ماوس

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

تصور البروتين كيناز نشاط في الفئران يتصرف الرأس ثابتة باستخدام في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...