ونود أن نعترف بدعم من برنامج حكومة فيكتوريا التشغيلي دعم البنية التحتية، وخطة مشاريع الربط مجلس البحوث الأسترالي (مع اجيلنت تكنولوجيز)، والمركز الاسترالي مجلس البحوث الطبية، البنك الدماغ الفيكتوري، الصحة الوطنية والتعاونية لأبحاث الصحة النفسية وNeuroproteomics منشأة.

1. إعداد المخازن والعينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 مل من العازلة، 200 ملي نترات الأمونيوم درجة الحموضة 7،6-7،8 (تعديل درجة الحموضة مع هيدروكسيد الأمونيوم (NH 4 OH)) مع السيزيوم (جيم) والتناقض (بينالي الشارقة) إضافة إلى تركيز النهائي من 10 جزء في البليون. استخدام السيزيوم والتناقض عن المعايير الداخلية لمراقبة أي انحراف في رد ICP-MS. قبل عازلة مرشح لاستخدام من خلال مرشح 0.22 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير العينة حسب نوع العينة: السائل، نسيج أو خلية ثقافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للعينات التي تتطلب التجانس (على سبيل المثال، الأنسجة أو الخلايا)، تأكد من أنها لا تحتوي على مواد التنظيف. استخدام العازل تريس لإعداد العينات. بدلا من ذلك، استخدم مخازن الفوسفات ولكنها يمكن أن تؤثر سلبا على metalloproteome مع مرور الوقت أو مع دورات ذوبان التجميد 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الأنسجة أو ثقافة الخلية عينات من dounce اليدوي أو صوتنة لمدة 5 دقائق باستخدام تريس مخزنة المالحة (50 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم(كلوريد الصوديوم) + ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) مثبطات الأنزيم البروتيني الحرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضيح الخليط بواسطة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 5 دقائق. جمع طاف الناتجة عن ذلك. الاحتفاظ بعينات عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: يجب طرد جميع العينات قبل تحميل في اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) قارورة لمنع الجسيمات من حظر العمود حجم الإقصاء اللوني (SEC). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع المبلغ الإجمالي للبروتين تحميلها على العمود عبر العينات. تحديد تركيزات البروتين في 280 نانومتر باستخدام حجم الصغير للأشعة فوق البنفسجية طيفي 13. الحمل بين 20 و 150 ميكروغرام من البروتين. استخدام حقن كميات نموذجية تتراوح 2-80 ميكرولتر اعتمادا على تركيز العينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف ذراع عينة من الصغير معمل حجم الأشعة فوق البنفسجية مع الماء المقطر قبل تحميل عينة. الذراع العينة التي يتم فيها تحميل عينات البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فارغ الصك ضد 2 ميكرولتر من العينة العازلة ه. ثم، تحميل 2 ميكرولتر من كل عينة على الذراع وقياس الامتصاصية في 280 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد التركيزات. للحصول على عينات من البروتين الخام، استخدام معامل انقراض 1 عبس = 1 ملغ / مل. لتحديد تركيز البروتين في عينات، استخدام قانون بير لامبرت، A = ε xlxc، حيث A هو الامتصاصية، ε هو معامل الانقراض، ل هو طول المسار في سم و c التركيز. </li></ol></li></ol> 2. تحليل السائبة المعايير Metalloprotein طريق إلى جانب بالحث البلازما - الطيف الكتلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء وضبط أداة تستخدم بروتوكولات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد تحسنت أداة صعودا وضبطها، نفذ الجزء الأكبر ICP-MS. ملاحظة: الحلول المالية من metalloproteins النقاء عموما بحاجة إلى أن تضعف قبل القياس. ويمكن تقدير تركيز المعادن من مستوى من البروتين المعروف: stochiometries المعادن والبروتين concentra يقدرنشوئها. ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد التخفيف الذي سوف يكون من المناسب أن تقع ضمن نطاق المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المعايير metalloprotein، ثايروجلوبولين، الفيريتين، سيرولوبلازمين، والنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود وفيتامين ب 12، للتأكد من أنها تقع ضمن مجموعة من 0-500 ميكروغرام / لتر، وذلك باستخدام حمض النيتريك 1٪. لتحقيق المعايير ضمن هذا النطاق، لا تستخدم التخفيفات تتجاوز 1 في 20. تنفيذ التخفيفات المسلسل في الماء لتخفيف الأسهم قبل ذلك إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ترتيب الحقن. أولا، تحليل مستويات معايرة سبعة، بتركيزات تتراوح 0-500 ميكروغرام / لتر، تليها المعايير metalloprotein. مستويات معايرة السبعة هي 0، 1، 5، 10، 50، 100 و 500 ميكروغرام / لتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العناصر المثيرة للاهتمام. هنا، استخدم الحديد، النحاس، الزنك، شركة وأنا، لأنها هي العناصر التي المعايير بروتين ملزمة ل. حدد العناصر في طريقة الشراء عن طريق فتح علامة التبويب محدد عنصر وإضافة إيليمي<html> اليلة والجماهير نظير كل منهما التي سيتم تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل عينة مع الصك والبرمجيات أداة تلقائيا بإنشاء منحنيات المعايرة لكل من العناصر التي يجري تحليلها. يتم إنشاء منحنيات المعايرة من قبل البرنامج عن طريق التآمر التهم / ثانية من المعدن الكشف على كمية من المعدن أن المعيار هو المقصود لاحتواء، في ميكروغرام / لتر. استخدام منحنيات المعايرة لتحديد تركيز المعادن في عينات غير معروفة. ملاحظة: استخدام منحنى المعايرة، والبرنامج يحدد تركيز المعادن في كل من المعايير metalloprotein. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من نتائج تحليل بكميات كبيرة، وتوليد معايير metalloprotein التي تشمل العناصر النزرة الأكثر وفرة ثلاثة في أنسجة الثدييات باستخدام مزيج من النحاس والزنك الفائق (الاحمق) المخفف إلى 200 ميكروغرام / لتر من النحاس والزنك والفيريتين (FTN) في المباراة النهائية تركيز 2000 ميكروغرام / لتر من الحديد. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. إعداد نظام HPLC والحجم الاستبعاد اللوني العمود موازنة ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذا القسم بالتوازي مع السابق، لأنها على حد سواء المطلوبة عن 1-1،5 ساعة لإكمال. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضخات تطهير HPLC مع العازلة في الخطوة 1.1 و تطهير مضخات لمدة 5 دقائق في معدل التدفق من 5 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم إزالة النظام، تعيين معدل التدفق عند 0.1 مل / دقيقة، وربط العمود استبعاد حجم (4.6 س 300 ملم، 3 ميكرون، 150 أ). ملاحظة: اتصال الرطب بين الأنبوب والعمود يتجنب أي فقاعات الهواء التي حوصر أثناء الاتصال من العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتوصيل الطرف الآخر من العمود إلى كاشف للأشعة فوق البنفسجية المقرر أن قياس الامتصاصية في 280 نانومتر باستخدام أنابيب نظرة خاطفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة تدريجية في معدل تدفق العمود في الزيادات من 0،05 حتي 0،1 مل / دقيقة حتى معدل التدفق النهائي من 0.4 مل / يتم التوصل دقيقة. في حين أن هذا يحدث، والتحقق من وصلات الأنابيب إلى العمود لأي تسرب. مراقبة الضغطمن هذا النظام لضمان عدم تجاوز متطلبات العمود بملاحظة أثر الضغط على اللوني في البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك عمود للتوازن في معدل التدفق المطلوبة خلال 5-10 أحجام العمود. بعد معايرتها ذلك، ربط الصكوك للسماح للتحدث تحليل العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طريقة HPLC ما يصل الى ضخ العازلة وفوق العمود عند 0.4 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة. </li></ol> 4. إعداد وتشغيل الحجم الاستبعاد - إلى جانب بالحث البلازما - الطيف الكتلي ملاحظة: قد تختلف إجراءات التشغيل بين الصكوك والنماذج. اتصل فني متخصص أداة لمعرفة المزيد حول كيفية تكوين ICP-MS المستخدمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع برنامج المقارنات الدولية - MS في وضع الاستعداد قبل تغيير الإعداد الأجهزة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في وضع الاستعداد، وإيقاف الاتصالات لأخذ العينات السيارات وتغيير إدخال عينة إلى &quot;الآخر&quot;. ملاحظة: اعتمادا على البرمجيات والصعبوير التكوين اختيار &quot;HPLC&quot; كمصدر إدخال عينة يمكن استخدامها. اتصل فني متخصص أداة لمعرفة ما إذا كان هذا الخيار متاحا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نظرة خاطفة أنابيب (ID 0.13 مم) لربط تدفق خارج من كاشف الأشعة فوق البنفسجية مباشرة إلى البخاخات على ICP-MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قوة عمل نسخة احتياطية من برنامج المقارنات الدولية - MS وتسمح أداة في عملية الاحماء لمدة 10 - 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن أشعلت البلازما، قم بتوصيل كابل بعيد من ICP - MS إلى الجزء الخلفي من الاوتوماتيكى HPLC. هل هذا مرة واحدة وقد أشعلت البلازما. وإلا فإن النظام HPLC سوف تلقائيا اغلاق منذ ICP - MS ليست على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير أسلوب ICP-MS لجمع البيانات عن LC-ICP-MS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير طريقة الشراء من الطيف لاكتساب الوقت عزم (الهيئة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد العناصر التي يتعين تحليلها، الحديد، النحاس، الزنك، شركة، وكذلك أي عناصر أخرى من المصالح، وتعيين أوقات التكامل (عادة ما بين 0،05 حتي 0،3 ثانية). بعد عناصر الفائدةإعادة اختياره، وضبط اكتساب الوقت لتتناسب مع وقت التشغيل لاللوني (على سبيل المثال، 900 ثانية لاللوني المدى 15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدويا ضبط ICP - MS لالهليوم الحساسية والتصادم الخلية (هو) معدلات تدفق الغاز مع العازلة اللوني المتدفقة باستخدام جيم وبينالي الشارقة المدرجة في المخزن المؤقت. معدلات التدفق وعادة ما تكون ~ 1 مل / دقيقة أقل من تلك المستخدمة لتحليل الأكبر. وبمجرد أن التهم أيون المعدن قد استقرت والانحراف المعياري النسبي (RSD) القيم هم أقل من 5٪، والنظام جاهز للاستخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل عينة قوائم تشغيل في كل من البرامج ICP-MS HPLC و. تحتوي القائمة عينة المدى الترتيب فيها كل من العينات غير ليتم حقنه وكذلك الاسم الذي سيتم حفظ البيانات. تأكد من أن العدد الكلي للعينات في المباراة قائمة بين البرنامجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الدفعة عينة لICP-MS قبل HPLC، وحقن العينة من قبل HPLC سوف يؤدي ICP - MS للبدء في جمعالبيانات. إذا لم يتم ذلك في الترتيب الصحيح أنه سيؤدي إلى البيانات المفقودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد نقاط منحنى المعايرة عن طريق حقن كميات متفاوتة من الهيئة العامة للسدود وFTN معيار مختلط من 200 ميكروغرام / لتر إلى 6000 ميكروغرام / لتر حقن على عمود النحاس والزنك و2،000 ميكروغرام / لتر إلى 60000 ميكروغرام / لتر بالنسبة الحديد. وتتراوح أحجام حقن 1-30 ميكرولتر. ملاحظة: هذه النطاقات تركيز تشمل تركيزات الحديد والنحاس والزنك احظ عادة في الخليط المعقدة. للعينات التي تحتوي فقط على تنقية البروتينات ينبغي تعديل مداه الأقصى من منحنى وفقا لذلك. إذ أن كمية المعادن المرتبطة البروتين قد تتطلب مجموعة أصغر أو أكبر لأن هناك أقل تلوث في عينة من العوامل الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل كل من زراعة الأنسجة عينات غير معروفة، البلازما أو الخلية. </li></ol> 5. تحليل البيانات، التلاعب والتخيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين البيانات في قيمة مفصولة بفواصل (CSV) تنسيق ملف وتحميل طn لبرامج معالجة كما هو مطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل السيطرة على الانجراف الصك، تقسيم التهم في الثانية لكل عنصر من التهم في الثانية إما جيم أو بينالي الشارقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد منحنيات المعايرة لكل من العناصر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المنطقة الواقعة تحت ذروة المعدنية التي تتطابق مع metalloprotein التي كان من المحتم أن لكل من الحقن عن طريق أداء ذروة التكامل في برنامج تحليل البيانات المفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنطقة تحت ذروة المعدنية ضد المبلغ الإجمالي للمعدن الذي تم حقنه على العمود في كل شوط، 200 - 6000 ميكروغرام / لتر النحاس والزنك و2،000 - 60،000 ميكروغرام / لتر بالنسبة الحديد. إجراء تحليل الانحدار الخطي وفقا لبروتوكول البرمجيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام النتائج المنحدر من تحليل الانحدار الخطي كعامل لتحويل التهم في الثانية إلى جزء من الغرام / ثانية. تقسيم كل من التهم لكل نقطة البيانات الثاني عبر اللوني من التدرج من قيمة خط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرسم البياني للبيانات فيجزء من الغرام / ثانية ضد الوقت اللوني. تحديد المنطقة تحت قمم الفائدة. المنطقة تحت الذروة تمثل المبلغ الإجمالي من المعدن التي يرتبط بها بروتين ل، في ص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد المعايرة على أساس الوزن الجزيئي للmetalloproteins المعروف والوقت الذي أزل. استخدم هذا لتقدير حجم قمم البروتين في عينات معقدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Aspects+of+Metal+Sites+in+Biology.">Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology.</a> Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).</li><li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+ions+in+biological+catalysis:+from+enzyme+databases+to+general+principles.">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li><li>Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+metallobiology+and+amyloid-beta+peptides+in+Alzheimer's+disease.">The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).</li><li>Roberts, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Treatment+with+CuII+(atsm)+Increases+Mutant+SOD1+In+Vivo+but+Protects+Motor+Neurons+and+Improves+the+Phenotype+of+a+Transgenic+Mouse+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+plasma+iron+in+Alzheimer's+disease+is+due+to+transferrin+desaturation.">Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation.</a> ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).</li><li>Cvetkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metalloproteomes+are+largely+uncharacterized.">Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized.</a> Nature. 466, 779-782 (2010).</li><li>Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+fractionation+and+detection+for+metalloproteomics:+challenges+and+approaches.">Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).</li><li>Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+for+iodine+in+milk+by+size-exclusion+chromatography+with+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometric+detection(SEC-ICP+MS).">Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS).</a> J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).</li><li>Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Cu-,+Fe-,+and+Zn-specific+detection+of+metalloproteins+contained+in+rabbit+plasma+by+size-exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma+atomic+emission+spectroscopy.">Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy.</a> J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).</li><li>Richarz, A. N., Br&#228;tter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+of+trace+elements+in+the+brains+of+individuals+with+Alzheimer's+disease+with+special+emphasis+on+metallothioneins.">Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins.</a> Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+iron,+copper+and+zinc+content+in+primary+neuron+and+astrocyte+cultures+by+rapid+online+quantitative+size+exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry.">Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).</li><li>Balkhi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection.">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

ضمان الدولة الأم من البروتين يعني اهتماما خاصا للمخازن المستخدمة وهناك حاجة إلى تخزين العينة. ليس كل تقنيات اللوني أو تقنيات إعداد عينة يمكن استخدامها. من المهم أن المخازن المؤقتة المستخدمة في جميع أنحاء إعداد العينات واللوني خالية من chelators المعدنية ومخازن الاستخدام التي تحاكي درجة الحموضة والملح تركيزات الفسيولوجية. وتشمل الشروط الأخرى لتجنب التدفئة العينة أو إضافة denaturants البروتين (على سبيل المثال، اليوريا). فمن الأهمية بمكان أن تقليل عدد دورات ذوبان التجميد. قدرة المخزن المؤقت اختياره لربط المعادن ثنائي التكافؤ هو أيضا مهم وهو السبب في أن تريس أو الأمونيوم نترات مخازن يتم اختيار اكثر من مخازن الفوسفات. القرار وذروة انخفاض قدرة اللوني حجم استبعاد نسبة إلى أشكال أخرى من اللوني وجود قيود كبير من هذه التقنية. ومع ذلك، فإن طبيعة لطيفة من حجم الإقصاء chromatograفيز مهم للحفاظ على حالة الأم من البروتين، وبالتالي الحفاظ على الروابط المعدنية البروتين ضعيفة نسبيا. شرط للحفاظ على حالة الأم من البروتينات يتطلب اهتماما خاصا لمعالجة العينات بما في ذلك الحد من عدد دورات ذوبان التجميد، وتجنب chelators معدنية (على سبيل المثال، EDTA) أو أملاح chaotropic والمنظفات. هذا القرار منخفضة من هذه الآثار التقنية والقدرة على قياس كمية من المعدن يرتبط مع بروتين معين إذا كان في عينة معقدة مثل قمم ينظر سوف تحتوي على بروتين أكثر من واحد. ولذلك، فإن كمية من المعدن مصممة باستخدام ذروة التكامل يكون مؤشرا من المبلغ الإجمالي من المعادن المرتبطة مع كل من البروتينات ويبلغ حجمه في هذه المرحلة من الوقت وليس واحدا فقط بروتين معين. ومن أجل التغلب على هذا القيد البروتين من الفائدة سوف يتعين زيادة تنقيته تحت الظروف المحلية. وسيتيح ذلك لتقدير حجمالمعدن المرتبطة بهذا البروتين ورود أنباء عن بدرجة أعلى من certainity. أن الحد محتمل آخر لهذه التقنية أن فقدان البروتين بسبب عكسها غير ملزم إلى العمود. من أجل تحديد ما إذا كان هذا يحدث تجربة الانتعاش ينبغي الاضطلاع بها حيث يتم تحليل كمية البروتين يبلغ حجمه قبالة العمود لتحديد ما إذا كان هذا يطابق كمية حقن. ونفس الشيء يمكن أن يتم ذلك عن طريق قياس المحتوى المعدني للمواد شطف والمواد بدءا من الجزء الأكبر ICP-MS. انتعاش عمود يمكن أن تختلف تبعا للظروف استخدامها، ولكن ثبت أن الشفاء الكامل من البروتينات من عمود استبعاد حجم ممكن 9. وبالتالي فمن المهم أن تحقق ما إذا كان أو لم يكن هناك أي خسارة تحت ظروف التشغيل المستخدمة. تعديلات على بروتوكول يمكن أن تكون ذات صلة المعايير metalloprotein التي تستخدم فضلا عن عناصر تحليلها. نوع metalloprotein معيار لناسوف إد تختلف اعتمادا على العناصر التي تهم. لعناصر مثل النحاس، الحديد والبروتينات والزنك، ويعمل الهيئة العامة للسدود والفيريتين. ويمكن أيضا أن أي metalloprotein الأخرى التي لديها stoichometries المعروف أن تستخدم وثبت بضعة أمثلة منها هنا. واحد المضاعفات الرئيسية التي يمكن أن تنشأ عن استخدام هذا الأسلوب هو تراكم بلورات الملح في شعلة ICP-MS. لمنع تراكم بلورات الملح، ويتم غسلها الشعلة مع الماء المقطر بعد كل 500 - 1000 مل من العازلة التي تم تمريرها من خلال نظام أو عندما يتم تحديد ذلك عن طريق التفتيش البصري أن الشعلة يجب غسلها. مشكلة أخرى التي يمكن أن تنشأ هو تراجع أكثر سرعة في نظافة العينة واستخراج المخاريط. هذه تحتاج إلى تنظيفها بشكل منتظم التالية بروتوكولات الشركة المصنعة. إعداد العينة الأولي هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. إذا كانت هناك أية تغييرات على بروتين - مجمع المعدن المشعormation الوقود النووي الناتجة لن تكون صالحة. هذا هو واحد من أوجه القصور الرئيسية لهذه التقنية. بالإضافة إلى استخدام دقة منخفضة، العمود استبعاد حجم الغلة على عرض تفصيلي محدود من التعقيد الحقيقي للmetalloproteins في علم الأحياء. تقنية الموضحة هنا يسمح للتوسع المعرفة من metalloproteome للكائن الحي. تحليل السائبة فقط يعطي مؤشرا الخام من التغييرات لكمية من المعدن ضمن العينة. إلى جانب الاعتبارات العامة التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار، وتوفر هذه التقنية أداة التي يمكن استخدامها ل quantitate كمية من المعادن المرتبطة البروتينات وكذلك metalloproteins تحديد تختلف بمقارنة آثار التي تم الحصول عليها. يمكن استخدامها لاستخدام هذه التقنية لتحديد الاختلافات بين الحالات المرضية. وmetalloproteins تحديدها ويمكن بعد مزيد من التحري للمساعدة في تحديد الدور الذي تلعبه في عمليات المرض. تطبيق الواصلة ICP-MS لديه زراعةالمستقبل لتحديد دور الأدوية التي لها متجانسة مثل البلاتين واليود أو النحاس، حيث أن ICP-MS يمكن استخدامها لتحديد البروتينات التي تربط المخدرات.

المعادن الأساسية تلعب دورا حيويا في الوظائف البيولوجية الطبيعية، بما في ذلك مسارات رسول الثانوية، مسارات الأيض ووظائف عضية. ويعتقد 30٪ من البروتينات لتكون metalloproteins 1 و 50٪ من جميع الإنزيمات 2. Metalloenzymes استخدام هذه المعادن النزرة مثل العوامل المساعدة على تحفيز التفاعلات الكيميائية، وتحقيق الاستقرار في بنية البروتين، والأدوار التنظيمية مثل رسل الثانوية. بعض العناصر النزرة الأكثر دراسة في ما يخص التنكس العصبي هي النحاس والحديد والزنك 3. ويعتقد أنها تشارك في العديد من مسارات المرض حيث من dyshomeostasis يمكن أن تؤثر بطريقة سلبية. على سبيل المثال وضع معدن الفائق (الاحمق) يؤثر بشكل مباشر على مدى الحياة والنمط الظاهري من نماذج الفئران المعدلة وراثيا من نوع عائلي من مرض التصلب الجانبي الضموري (ALS) (4). في مرض الزهايمر، وقد استخدمت تقنيات metalloproteomics لاكتشاف انخفاض في وضع المعدن من ترانسفيرين في صlasma 5. وتبرز هذه الدراسات يمكن أن metalloproteins الدور الهام الذي تقوم به في المرض. دراسة metalloproteins مباشرة من الأنسجة البيولوجية هو حقل النامية. على الرغم من أن بعض metalloenzymes اتسمت، فإن الغالبية لا تزال uncharacterized أو غير معروف (6). أحد التحديات الرئيسية في metalloproteins قياس هو شرط للحفاظ على حالة الأم من البروتين 7. الكلاسيكية من أسفل إلى أعلى تقنيات البروتين تعتمد على هضم البروتينات إلى ببتيدات. يعطل هذه العملية تفاعل غير التساهمية من المعادن والبروتينات الخاصة بهم. وهكذا، واكتسبت أي معلومات عن حالة المعادن من البروتين. طريقة واحدة للتغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام اللوني حجم الإقصاء يقترن إضافة بالحث البلازما - الشامل 8،9 الطيف (SEC-ICP-MS). وهذا يولد المعلومات حول حجم تقريبي البروتين وكذلك أي المعادن التي ASSOCiated معها 10. وعلاوة على ذلك، حجم الإقصاء هو أسلوب الكروماتوغرافي لطيف التي يمكن أن الحفاظ على الدولة الأم إنزيم أو البروتين البروتين مجمع. ومن مزايا استخدام البلازما إضافة بالحث - الطيف الكتلي (ICP-MS) هو طابع كمي للتكنولوجيا. باستخدام مجموعة من المعايير metalloproteins فمن الممكن لتوفير الكميات المطلقة من metalloproteins من العينات البيولوجية 9،11. ويتحقق ذلك عن طريق توليد منحنى القياسية عن طريق حقن metalloproteins تعرف على مجموعة من تركيزات المعادن. ويظهر هذا البروتوكول مثال عن كيفية هذا لا يمكن أن يتحقق لمجموعة متنوعة من المعايير metalloprotein. في هذه الورقة ونحن نهدف إلى إنشاء منحنيات القياسية للمعادن التي يتم التحقيق فيها إلى حد كبير في المجالات البيولوجية بما في ذلك الحديد (الحديد) والنحاس (النحاس) والزنك (الزنك) واليود (I)، والكوبالت (المشارك).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1314E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7700 ICP-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3282A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium hydroxide trace metal basis&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium nitrate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>256064</td>
			<td>Make fresh 200mM solution on day of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Antinomy&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>10002-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ceruloplasmin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cesium&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>100011-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Complete, EDTA free protease inhibitors&#160;&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Conalbumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cu, Zn Superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ferritin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ICP-MS multielemental calibration standards&#160;</td>
			<td>AccuStandard</td>
			<td></td>
			<td>Made up to required concentrations in 1% nitric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microvolume UV spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;65% Nitric acid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100441</td>
			<td>Diluted to 1% for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Peek tubing&#160;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5042-6461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3&#956;m, 150&#197;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-2508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals inc.&#160;</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Thyroglobulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standards for quantitative metalloproteomic analysis using size exclusion icp-ms

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

استخدام المعايير metalloprotein يسمح لمعايرة العمود حجم الاستبعاد. ويبين الشكل 1A الشخصية شطف للمعايير ثايروجلوبولين، الفيريتين، سيرولوبلازمين، والنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود وفيتامين ب 12 على أساس المعدن أنهم لا بد أن (الحديد، شارك والنحاس والزنك وأنا). ويبين الشكل 1B منحنى المعايرة للعمود حجم الإقصاء على أساس الوزن الجزيئي للمعايير البروتين والوقت شطف التي قدمت في شكل حجم شطف (هاء) مقسوما على حجم الفراغ من عمود (فو). البروتينات المستخدمة لتوليد هذا المنحنى القياسي وكونكانافالين A، كونالبومين، سيرولوبلازمين، الفيريتين، الهيئة العامة للسدود وثايروجلوبولين. ويبين الشكل 2A شطف من الفيريتين على مجموعة من 2000 - 60000 خريج من الحديد حقن على عمود والشكل 2D هو تحليل الانحدار القيام بها باستخدام صمنطقة EAK. أرقام 2B و2C هي ملامح شطف للنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود لالنحاس والزنك و2E و2F ونتائج تحليل الإنحدار تم إنشاؤها باستخدام مناطق الذروة. وتستخدم نتائج تحليل الانحدار لتحويل البيانات الخام في التهم / ثانية إلى جزء من الغرام / ثانية حتى كمية من المعادن المرتبطة البروتين يمكن تحديد الكمية. ويتم التحويل عن طريق تقسيم التهم / ثانية من قبل المنحدر من الانحدار الخطي (على سبيل المثال، 334.6 (العدد / ثانية) س (ثانية / PG) من النحاس). وكما ذكر، هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد metalloproteins في العينات البيولوجية المعقدة. لقد تعرض الدماغ البشري والبلازما لهذه التقنية وأرقام 3 و 4 على التوالي، وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها. ويرد الدماغ البشري مفصولة SEC-ICP-MS في أرقام 3A-3C، كل واحدة منها تمثل مختلف المعادن من<html> الفائدة (النحاس والزنك أو الحديد). أرقام 4A-4C تظهر آثار التي تم الحصول عليها عندما يتعرض البلازما البشرية لهذه التقنية. سوف تعقد وفرة من العينة يؤثر على عدد من القمم التي ينظر إليها. كما يهيمن البلازما المتوقع من قبل عدد قليل من metalloproteins بما في ذلك سيرولوبلازمين وترانسفيرين. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> الشكل 1. معايرة الحجم الاستبعاد اللوني - إضافة بالحث البلازما - الطيف الكتلي عن طريق المعروفة الشخصي Metalloproteins (A) شطف للمعايير metalloprotein بناء على المعادن كل منها. (ب) الوزن الجزيئي معايرة منحنى لثايروجلوبولين معايير البروتين (ط)، الفيريتين (ب)، سيرولوبلازمين (ج)، كونالبومين (د)، والنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود (ت) وكونكانافالين ألف (السادس).<html> &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> الشكل 2. استخدام فيريتين والنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود كما معايير Metalloprotein لتحديد كمية النحاس، الحديد أو الزنك المصاحبة لMetalloproteins في عينة بيولوجية معقدة (A) لمحة شطف للالفيريتين على نطاق حقن 2000 - 60000 ميكروغرام / لتر من الحديد. (ب) و (ج) لمحة شطف عن الهيئة العامة للسدود النحاس / الزنك على نطاق حقن 200 - 6000 ميكروغرام / لتر من النحاس والزنك، على التوالي. (د) و (ه) و (F) تظهر نتائج تحليل الانحدار للمعادن الحديد والنحاس والزنك، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig3.jpg" /> الشكل 3. النحاس والحديد والزنك Metalloproteome من الإنسان الدماغ. (A) النحاس أثر (ب) أثر الحديد (C) الزنك أثر. يظهر شطف المعايير البروتين لكل معدن من أثر أسود مع الوزن الجزيئي بهم مبين في الرسم البياني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> الشكل 4. النحاس والحديد والزنك Metalloproteome البلازما البشرية. (A) النحاس أثر (ب) أثر الحديد (C) الزنك أثر. يظهر شطف المعايير البروتين لكل معدن من أثر أسود مع الوزن الجزيئي فيdicated تحت الرسم البياني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS at JoVE.com

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

معايير التحليل الكمي Metalloproteomic عن طريق الحجم استبعاد ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

standards-for-quantitative-metalloproteomic-analysis-using-size

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Atomic Spectroscopy

SCIENTISTS IN ACTION

15.0K Views.  The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health. Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins. 

Video: Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

البروتيوميات الكمي عن طريق انتقاصية Dimethylation لمستقر النظائر وصفها

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

فحص الكمية والنوعية من التفاعلات الجسيمات الجسيمات الغروية عن طريق مسبار Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

أو-تفاعل Slp1 البوليمرات واحد رقائق من<em&gt; Lysinibacillus كروي</em&gt; JG-B53 - QCM-D، ICP-MS وAFM كأدوات للدراسات جزيء حيوي المعادن

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

باستخدام شعري الكهربائي لقياس الأحماض العضوية من الأنسجة النباتية: حالة اختبار فحص<em&gt; كافيا ارابيكا</em&gt; بذور

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

قياس توزيع حجم الجسيمات في عكر حلول كتبها الإنارة الديناميكي التشتت المجهر

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

تصنيع واختبار الحرارة الضوئية

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Nanosponge Tunability in Size and Crosslinking Density

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with controlled dimensions. This approach begins with synthesis of a functionalized lactone which is key to the pendant functionalization of the resulting polymer. Valerolactone (VL) and allyl-valerolactone (AVL) are then copolymerized using ring-opening polymerization. Post-polymerization modification is then used to install an epoxide moiety on some or all of the pendant allyl groups. Epoxy-amine chemistry is employed to form nanoparticles in a dilute solution of both polymer and small molecule diamine crosslinker based on the desired nanosponge size and crosslinking density. Nanosponge sizes can be characterized by transmission electron microscopy (TEM) imaging to determine the dimension and distribution. This method provides a pathway by which highly tunable polyesters can create tunable nanoparticles, which can be used for small molecule drug encapsulation. Due to the nature of the backbone, these particles are hydrolytically and enzymatically degradable for a controlled release of a wide range of hydrophobic small molecules.

This article describes a process for tuning the size and crosslinking density of covalently crosslinked nanoparticles from linear polyesters containing pendant functionality. By tailoring synthesis parameters (polymer molecular weight, pendant functionality incorporation, and crosslinker equivalents), a desired nanoparticle size and crosslinking density can be achieved for drug delivery applications.

ألواح نانوسبونجي في حجم وكثافة كروسلينكينج

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

مقدر ألياف الاراميد كوبوليمر قوة عالية لتمكين تحديد خواصها الميكانيكية

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

تطبيق الجهد في الضوء الديناميكي التشتت تحليل حجم الجسيمات

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

إعداد الترافيسيرات الشعرية -البلازما المقترنة الاستقرائي الطيف الطيفي (CE-ICP-MS) لقياس كمية من أنواع الأكسدة الحمراء الحديد (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...