Biz Victoria Hükümeti&#39;nin Operasyonel Altyapı Destek Programı (Agilent Technologies) ile Avustralya Araştırma Konseyi Bağlantı Projeleri Programı, Ruh Sağlığı ve Neuroproteomics Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Victoria beyin bankası, Kooperatif Araştırma Merkezi desteği kabul etmek istiyorum tesis.

Tamponlar ve Örneklerin hazırlanması 1. <ol><li> Tampon 500 mi, 200 mM amonyum nitrat pH 7.6 - hazırlayın sezyum (CS) ile karşıtlık (Sb) 7.8 (amonyum hidroksit (NH4OH) ile ayarlanabilir pH) 10 ppb nihai bir konsantrasyona kadar ilave edildi. ICP-MS yanıt herhangi bir sürüklenme izlemek için iç standartlar olarak sezyum ve karşıtlık kullanın. 0.22 mikron filtre ile kullanmak için Filtre tampon önce. </li><li> Sıvı, doku ya da hücre kültürü: Örnek tipine bağlı olarak örnek hazırlayın. <ol><li> Homojenizasyon (örneğin, doku ya da hücre) gerektiren numuneler için, bu deterjan içermeyen emin olun. Numune hazırlama için Tris tamponları kullanın. Alternatif olarak, fosfat tamponları kullanın ama olumsuz zamanla veya donma çözülme döngüleri 12 ile metalloproteome etkileyebilir. </li><li> Tris tuz (50 mM Tris pH 8.0 tampon kullanılarak 5 dakika, 150 mM sodyum klorür el Dounce veya sonikasyon ile doku ya da hücre kültür örnekleri homojenize(NaCl) + etilendiamintetraasetik asit (EDTA) serbest proteaz inhibitörleri). </li><li> 5 dakika boyunca 16.000 x g&#39;de santrifüjleme ile homojenatları açıklık getirmektedir. Elde edilen süpernatant toplayın. 4 ° C&#39;de örnekleri tutun. Not: Tüm numuneler önce, yüksek performanslı sıvı kromatografisi içine boyut dışlama kromatografisi (SEC), sütun bloke parçacıkların önlemek için (HPLC) şişeleri yükleme için santrifüj gerekir. </li></ol></li><li> numuneler üzerinde kolon üzerine yüklenir protein toplam tutarı normalleştirmek. Bir mikro ses UV spektrofotometresi 13 kullanılarak 280 nm&#39;de protein konsantrasyonlarını belirlemek. 20 ve 150 ug protein arasındaki yük. Örnek konsantrasyona bağlı olarak, 80 ul - 2 arasında değişen tipik enjeksiyon hacimlerini kullanın. <ol><li> Örnek yüklemeden önce distile su ile mikro hacim UV spektrofotometre örnek kolunu temizleyin. Protein örnekleri yüklenen nerede örnek koludur. </li><li> th 2 ul karşı boş enstrümane örnek tamponu. Daha sonra, yük 2 kolu üzerine her bir numunenin ul ve 280 nm&#39;de absorbans ölçümü. </li><li> konsantrasyonları belirler. Ham protein örnekleri için, 1 Abs = 1 mg / ml&#39;lik bir tükenme katsayısı kullanın. örneklerin protein konsantrasyonunu belirlemek için, ekstinksiyon katsayısı ε bir absorbansını Beer-Lambert kuralına, A = ε xlxc, kullanımı, l santimetre olarak yol uzunluğu ve Cı konsantrasyonudur. </li></ol></li></ol> Kütle Spektrometresi - İndüktif Coupled Plasma kullanma Metalloprotein Standartları 2. Toplu Analizi <ol><li> Isınma ve melodi üreticinin protokolleri kullanarak enstrüman. </li><li> enstrüman ısınmış ve ayarlı sonra, toplu ICP-MS gerçekleştirin. Not: Saflaştırılmış metalloprotein stok çözeltileri, genel olarak ölçümden önce seyreltilmesi gerekir. Metal stochiometries ve tahmini protein konsantrasyonları: standart metal konsantrasyonu bilinen proteinden tahmin edilebiliryon. Bu bilgiler, üretilen standart eğri aralığı içinde uygun olacaktır seyreltme belirlemek için kullanılabilir. <ol><li> % 1 nitrik asit kullanılarak, 500 mg / L - onlar 0 aralığındaki sağlamak için, metalloprotein standartları, tiroglobulin, ferritin, seruloplazmin, Cu / Zn SOD ve Vitamin B 12 sulandırmak. Bu aralıkta standartlarına ulaşmak için, gerekirse bunun öncesinde stoklarını seyreltmek için su içinde seri dilüsyonları gerçekleştirin 20&#39;de 1&#39;ini geçemeyecek dilüsyonları kullanmayın. </li><li> enjeksiyonlar sırasını ayarlayın. İlk olarak, yedi kalibrasyon seviyelerini analiz 0 arasında değişen konsantrasyon - 500 mg / L, metalloprotein standartlarına eklenmiştir. Yedi kalibrasyon düzeyleri 0, 1, 5, 10, 50, 100 ve 500 ug / L&#39;dir. </li><li> ilgi elemanları seçin. Onlar protein standartlarına bağlı olduğunu unsurlar olarak burada, Fe, Cu, Zn, Co ve ben kullanın. eleman seçme sekme açma ve Eleme ekleyerek satın alma yöntemine elemanları seçin<html> Hangi NTS ve ilgili izotop kütleleri analiz edilmesi. </li><li> alet ile örnek analizi yapın ve enstrüman yazılım otomatik elemanların her biri için kalibrasyon eğrileri analiz edilen oluşturur. Kalibrasyon eğrileri, standart ug / L olarak, ihtiva ettiği kastedilmektedir metal miktarına göre tespit metal sayım / saniye çizilmesi ile yazılım tarafından oluşturulur. bilinmeyen numunelerin metal konsantrasyonunu belirlemek için kalibrasyon eğrileri kullanın. Not: Kalibrasyon eğrisi kullanılarak, yazılım metalloprotein standartları, her metal konsantrasyonunu belirler. </li><li> kütle analizi sonuçlarından, Cu bir karışımı kullanılarak memeli dokularında üç en bol bulunan eser elementler içerir metalloprotein standartları üretmek Zn süperoksit dismutaz (SOD) nihai olarak bakır ve çinko ve ferritin (FTN) 200 ug / L&#39;ye seyreltilmiş demir 2.000 ug / L konsantrasyonu. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. HPLC Sistemi Ve boy hariç tutularak kromatografi, sütun dengeleme Not: her ikisi de yaklaşık 1 gereklidir, çünkü bu bölümde, bir önceki paralel yapılmalıdır - tamamlamak için 1.5 saat. <ol><li> Boşaltma HPLC adım 1.1 yapılan tamponu ile pompa ve / dakika, 5 ml bir akış hızında 5 dakika pompaları temizleyin. </li><li> Sistem temizlendi sonra, 0.1 mL / dakika akış hızı ayarlanır ve boyut çıkarma kolonu (4.6 x 300 mm, um 3, 150) bağlanır. Not: boru ve sütun arasındaki ıslak bağlantı herhangi bir hava kabarcıkları sütunun bağlantısı sırasında hapsolmak önler. </li><li> PEEK boru kullanılarak, 280 nm&#39;de absorbansı ölçmek için ayarlanmış, UV detektörü için sütunun zıt ucunu. </li><li> Yavaş yavaş 0.05 artışlarla sütunun akış oranını artırmak - 0.4 ml&#39;lik nihai bir akış oranı kadar 0.1 ml / dakika / dakika ulaşılır. Bu cereyan etmekte iken, herhangi bir sızıntı kolona boru bağlantılarını kontrol edin. basıncını izlemekSistemin yazılımın kromatogram&#39;ın basınç trasesini kolon gereksinimlerini aşmadığından emin olmak için. </li><li> 10 kolon hacmi 5 - fazla gerekli akış hızında dengelenmeye sütun bırakın. o dengelenmiş sonra, alet numune analizi meydana gelmesine izin bağlanın. </li><li> 15 dakika boyunca, 0.4 ml / dakika sütun üzerinde bir tampon, bir pompa HPLC yöntemini ayarlayın. </li></ol> 4. Kurma ve Boyut Dışlama Koşu - Kütle Spektrometresi - Endüktif Coupled Plasma Not: Çalışma prosedürleri araçlar ve modeller arasında değişebilir. ICP-MS kullanıldığını nasıl yapılandırılacağı hakkında daha fazla bilgi edinmek için enstrüman teknik uzmanıyla görüşün. <ol><li> ICP yerleştirin - bekleme moduna MS donanım ayarını değiştirmeden önce. <ol><li> Bir kez bekleme modunda, otomatik numune için iletişimi kapatmak ve örnek giriş için &quot;öteki&quot; olarak değiştirin. Not: Yazılımın ve sert bağlıBir örnek tanıtım kaynağı olarak ware yapılandırma seçerek &quot;HPLC&quot; kullanılabilir. Bu seçenek olup olmadığını öğrenmek için cihaz teknik uzmanıyla görüşün. </li></ol></li><li> doğrudan ICP-MS ile ilgili nebulizer UV dedektör dışarı akışını bağlamak için PEEK boru (ID 0.13 mm) kullanın. </li><li> Güç ICP yedeklemek - MS ve enstrüman 10 ısınmasını bekleyin - 20 dakika. </li><li> Plazma ateşledi sonra, ICP uzak kablo bağlamak - MS, HPLC otomatik numune arkasına. Plazma ateşledi sonra bunu; Aksi takdirde HPLC sistemi otomatik olarak ICP beri kapanacaktır - MS değil. </li><li> LC-ICP-MS için veri toplamak için ICP-MS yöntemi değiştirin. <ol><li> Zaman çözmek edinme (TRA) için spektrum elde etme yöntemi değiştirin. </li><li> (- 0.3 sn tipik 0.05) seçin elemanları, Fe, Cu, Zn, Co, ben yanı sıra ilgi herhangi bir diğer unsurları ve set entegrasyon süreleri analiz edilecek. Faiz a unsurları sonraseçilen yeniden, Kromatografi için çalışma süresi eşleşecek şekilde satın alma süresini ayarlamak (örneğin, bir 15 dakika kromatografi çalıştırmak için 900 sn). </li><li> Manuel olarak ayarlamak ICP - duyarlılık ve çarpışma hücre helyum MS (O) Cs ve Sb tamponunda bulunan kullanarak akan kromatografi tamponu ile gaz akış hızları. O akış oranları tipik olarak dökme analizi için kullanılan daha ~ 1 ml / dakika daha azdır. metal iyonu sayımları stabilize ve bağıl standart sapma (RSD) değerleri% 5&#39;in altında olduğunda, sistem kullanıma hazırdır. </li></ol></li><li> HPLC ve ICP-MS yazılım programları hem örnek çalıştırmak listeleri yapmak. Örnek çalışma listesi örneklerinin her veri kaydedilir hangi isim yanı sıra enjekte edilecek sırayı içerir. İki program arasında liste maçta numunelerin toplam sayısı kontrol edin. </li><li> toplamaya başlamak için MS - ICP tetikleyecek HPLC ile örnek enjeksiyonu gibi HPLC önce ICP-MS için örnek toplu, başlatmakveri. Bu doğru sırayla yapılmazsa o kayıp veri neden olur. </li><li> 6000 ug / L ila 200 g / L&#39;den SOD ve FTN karışık standart değişen miktarlar enjekte kalibrasyon eğrisi noktaları oluşturmak Fe için 60,000 ug / L Cu, Zn ve 2.000 ug / L up kolonu üzerinde enjekte edilmiştir. Enjeksiyon hacmi, 1 ila 30 ul arasında değişir. Not: Bu konsantrasyon aralıkları, tipik olarak karmaşık bir homojenatlarında gözlendi Fe, Cu ve Zn konsantrasyonları kapsar. Sadece saflaştırılmış protein içerir numuneler için eğrinin azami menzili buna göre ayarlanması gerekir. diğer faktörler arasından numune daha az kirlenme olduğundan daha küçük veya daha büyük bir aralığı gerektirir protein ile bağlantılı metal miktarı olarak gösterilir. </li><li> bilinmeyen örnekleri, doku, plazma veya hücre kültürünün her bir analiz edin. </li></ol> 5. Veri Analizi, Manipülasyon ve Görselleştirme <ol><li> virgülle ayrılmış değer verileri (CSV) dosya biçimini depolamak ve i yükNto işleme programları gerektiği gibi. </li><li> Gösterge sürüklenme kontrol etmek amacıyla, Cs veya Sb ya saniyede sayım tarafından her eleman için saniyede sayıları bölmek. </li><li> elemanların her biri için kalibrasyon eğrileri oluşturmak. <ol><li> o tercih veri analiz yazılımı zirve entegrasyonunu gerçekleştirerek enjeksiyonlar her biri için bağlı metalloprotein karşılık gelen metal tepe altındaki alanı belirleyin. </li><li> Fe için 60,000 ug / L - Cu ve Zn ve 2.000 6.000 ug / L - her çalışmadaki kolona enjekte edildi metalin toplam miktarı, 200 karşı metal tepe noktasının altındaki alan çizilir. Yazılım protokolüne göre lineer regresyon analizi yapın. </li><li> pg / sn saniyede sayılarını dönüştürmek için bir faktör olarak lineer regresyon analizinde elde edilen eğim sonuçlarını kullanın. hat değerinin degrade ile kromatogram genelinde ikinci veri noktalarının başına sayım her bölün. </li></ol></li><li> veri grafiğinikromatogram zamana karşı pg / sn. ilgi tepelerin altındaki alanların belirlenmesi. tepe noktasının altındaki alan proteini pg, bağlı metalin toplam miktarını temsil eder. </li><li> bilinen metalloprotein ve elüte edildiği zaman molekül ağırlığına dayalı olarak bir kalibrasyon oluşturur. Karmaşık örneklerinde protein zirveleri boyutunu tahmin için bunu kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Aspects+of+Metal+Sites+in+Biology.">Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology.</a> Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).</li><li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+ions+in+biological+catalysis:+from+enzyme+databases+to+general+principles.">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li><li>Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+metallobiology+and+amyloid-beta+peptides+in+Alzheimer's+disease.">The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).</li><li>Roberts, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Treatment+with+CuII+(atsm)+Increases+Mutant+SOD1+In+Vivo+but+Protects+Motor+Neurons+and+Improves+the+Phenotype+of+a+Transgenic+Mouse+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+plasma+iron+in+Alzheimer's+disease+is+due+to+transferrin+desaturation.">Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation.</a> ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).</li><li>Cvetkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metalloproteomes+are+largely+uncharacterized.">Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized.</a> Nature. 466, 779-782 (2010).</li><li>Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+fractionation+and+detection+for+metalloproteomics:+challenges+and+approaches.">Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).</li><li>Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+for+iodine+in+milk+by+size-exclusion+chromatography+with+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometric+detection(SEC-ICP+MS).">Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS).</a> J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).</li><li>Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Cu-,+Fe-,+and+Zn-specific+detection+of+metalloproteins+contained+in+rabbit+plasma+by+size-exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma+atomic+emission+spectroscopy.">Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy.</a> J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).</li><li>Richarz, A. N., Br&#228;tter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+of+trace+elements+in+the+brains+of+individuals+with+Alzheimer's+disease+with+special+emphasis+on+metallothioneins.">Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins.</a> Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+iron,+copper+and+zinc+content+in+primary+neuron+and+astrocyte+cultures+by+rapid+online+quantitative+size+exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry.">Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).</li><li>Balkhi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection.">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Proteinin doğal durumunu sağlanması kullanılan ve örnek depolama gerekli tamponlar özel önem anlamına gelir. Tüm kromatografi teknikleri veya örnek hazırlama teknikleri kullanılabilir değil. Numune hazırlama ve kromatografi boyunca kullanılan tamponlar metal şelatörleri ve fizyolojik pH ve tuz konsantrasyonlarına taklit kullanımı tampon yoksun olması önemlidir. Önlemek için diğer koşullar Isıtma örnek veya protein denatüre edici (örneğin, üre) ilave edilmesini içerir. Donma çözülme döngülerinin sayısını en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. çift ​​değerli metallerin tespit edilmesi için seçilen tampon kabiliyeti önemlidir ve Tris ya da amonyum nitrat tamponlar fosfat bazlı tamponlar içinde seçilen bir nedenidir. kromatografi diğer biçimlerine boyut dışlama kromatografisi göreceli düşük çözünürlüklü ve pik kapasitesi bu tekniğin önemli bir sınırlama olduğunu. boyut dışlama Kromatografi Bununla birlikte, nazik doğaPHY proteinin doğal durumunu korumak ve böylece görece zayıf metal-protein bağları korumak için önemlidir. Proteinlerin doğal durumunu korumak için gereksinim metal şelat (örneğin, EDTA) veya kaotropik tuzlar ve deterjanlar kaçınarak, donma çözülme döngüsü sayısını sınırlayarak da dahil olmak üzere örneklerin tedaviye özel dikkat gerektirir. Bu teknik, etkilerin bu düşük çözünürlük daha sonra bir protein içerir görülen tepe gibi kompleks bir örneğinde ise, özel bir protein ile bağlantılı metal miktarını ölçmek için yeteneği. Bu nedenle, en yüksek entegrasyonu kullanılarak saptanmıştır metal miktarı proteinlerinin hepsi sadece belirli bir protein, bu zaman noktasında elüsyon olup ilişkili metalin toplam miktarının bir göstergesi olacaktır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, ilgi konusu olan proteini ayrıca doğal koşullar altında, saflaştırılmış olmak zorunda olacaktır. Bu ölçümü için izinbu protein ile bağlantılı metaller kesinlik arasında daha yüksek bir derece ile raporlanır. Bu tekniğin bir başka potansiyel güçlüğü kolona olmayan geri bağlayıcı proteinin kaybı olur. sütunun elüt protein miktarı, bu enjekte edilen miktar, eşleşip eşleşmediğini belirlemek için analiz edilir ve böylece bu geri deney oluyor olup olmadığını belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Aynı elüsyon malzemenin metal içeriğine ve dökme ICP-MS ile başlangıç ​​malzemesinin ölçülerek yapılabilir. Sütun geri kullanılan koşullara bağlı olarak, ancak bir ebat eksklüzyon kolonu proteinlerin tam iyileşme 9 mümkün olduğu gösterilmiştir. Böylece kullanılan çalışma koşulları altında herhangi bir kayıp olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. protokole değişiklikler analiz elemanların yanı sıra, kullanılan metalloprotein standartları ile ilgili olabilir. metalloprotein standardının bize türüed ilgi unsurları bağlı olarak değişecektir. Cu, Fe ve Zn proteinler gibi elemanlar için, SOD ve ferritin istihdam edilmektedir. bilinen stoichometries herhangi bir başka metalloprotein de kullanılabilir ve bazı örnekler burada gösterilmiştir. Bu tekniği kullanarak ortaya çıkabilir Bir majör komplikasyon ICP-MS meşale tuz kristallerinin birikimi olduğunu. sistem geçirildi edilmiş ya da görsel kontrol altında belirlendiği zaman torç yıkanmalıdır bu tamponun 1,000 ml - tuz kristallerinin oluşumunu önlemek için, fener her 500 sonra damıtılmış su ile yıkanır. ortaya çıkabilir Başka bir problem örnek ve çıkarma koni temizliği daha hızlı bir düşüş olduğunu. Bu üreticinin protokolleri takip düzenli temizlenmesi gerekir. İlk örnek hazırlama protokolü en kritik adımdır. Metal kompleksi enf - proteine ​​herhangi bir değişiklik varsaormation geçerli olmayacaktır üretti. Bu tekniğin en önemli sınırlamaları biridir; Buna ek olarak düşük çözünürlüklü kullanımı ebat eksklüzyonlu kolon biyolojide metalloprotein gerçek karmaşıklığı sınırlı ayrıntılı bir görünümünü verir. Burada anlatılan teknik, organizmanın metalloproteome bilgisinin genişletilebilir. Toplu analizi sadece bir örnek içinde metal miktarına değişikliklerin ham gösterge verir. dikkate alınması gereken genel düşünceler Bunun yanı sıra, bu teknik, elde edilen izleri karşılaştırarak farklı protein olarak tanımlayan metalloprotein bağlantılı metal miktarını ölçmek için kullanılabilecek bir araç sağlar. Bu tekniğin kullanılması, hastalık durumlarında arasındaki farkları belirlemek için kullanılabilir. belirlenen metalloproteinlerdir daha sonra da hastalık sürecinde oynadıkları rol belirlemeye yardımcı olmak için araştırılabilir. Hecelenmiş ICP-MS uygulama büyüyen vardırgelecek ilaç bağlayan proteinleri tespit için kullanılabilecek bu tür ICP-MS gibi platin, iyot veya bakır gibi bir hetero sahip ilaçların rolünü belirlemek için.

Temel metaller ikincil haberci yollar, metabolizma yolları ve organel fonksiyonları dahil normal biyolojik fonksiyonlar, hayati bir rol oynamaktadır. Tüm proteinlerin% 30 metalloproteinlerdir 1 ve enzimlerin 2% 50 olduğu tahmin edilmektedir. Metalloenzimler, kimyasal reaksiyonları katalize protein yapısını stabilize etmek kofaktör olarak ve ikincil haberciler gibi düzenleyici rolleri için bu iz metalleri kullanın. Nörodejenerasyon getirmedi en çok çalışılan eser elementlerin bazıları bakır, demir ve çinko 3 vardır. Onlar yan etkiler içebileceğiniz dyshomeostasis birçok hastalık yollarıyla ilgili olduğu düşünülmektedir. Örneğin, süperoksit dismutaz (SOD) doğrudan etkiler ömrü ve amiyotrofik lateral sikleroz (ALS) 4 ailesel Çeşidi transgenik fare modellerinde fenotipinin metal durumu. Alzheimer hastalığında, metalloproteomics teknikleri p transferrin metal durumunda bir azalma keşfetmek için kullanılmıştırlasma 5. Bu çalışmalar önemli bir rol metalloproteinlerdir hastalığa oynayabileceği vurgulayın. doğrudan biyolojik dokulardan Metaloproteinlerde çalışma gelişen bir alandır. Bazı Metalloenzimler, özelliği olmasına rağmen, çoğu hala karakterize edilmemiş ya da 6 bilinmemektedir. Ölçüm Metaloproteinlerde önemli zorluklardan biri proteinin 7 yerli durumunu korumak için bir gerekliliktir. Klasik aşağıdan yukarıya proteomik teknikler peptidler içine proteinlerin sindirimi güveniyor. Bu işlem, metal ve proteinlerin kovalent olmayan etkileşimi bozar. Böylece, bir protein metal durumu hakkında herhangi bir bilgi elde edilir. Kütle spektrometresi 8,9 (SEC-ICP-MS) - Bu sorunu aşmak için bir yolu ICP ile eşleştirilmiş boyut dışlama kromatografisi kullanılarak gereğidir. Bu proteinin yaklaşık boyutu hakkında bilgilerin yanı sıra doç hiçbir metaller üretir10 ile iated. Bundan başka, boyut dışlama, bir enzim ya da protein-protein kompleksinin yerli durumunu korumak için hafif bir kromatografik bir tekniktir. indüktif olarak birleştirilmiş plasma kullanmanın bir avantajı, - kütle spektrometrisi (ICP-MS) teknolojisi kantitatif doğasıdır. Metalloproteinlerdir bir dizi standardı kullanarak biyolojik örneklerin 9,11 den Metaloproteinlerde mutlak kantitatif sağlamak mümkündür. Bu, metal bir konsantrasyon aralığı üzerinde bilinen metalloproteinleri enjekte standart bir eğri üretilmesiyle sağlanır. Bu protokol, bu metalloprotein çeşitli standartlara için elde edilebilir bir örnek göstermektedir. Bu yazıda demir (Fe), bakır (Cu), çinko (Zn), iyot (I) ve kobalt (Co) da dahil olmak üzere, büyük ölçüde biyolojik alanlarda incelenmiştir metaller için standart eğrileri yaratmayı amaçlıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1314E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7700 ICP-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3282A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium hydroxide trace metal basis&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium nitrate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>256064</td>
			<td>Make fresh 200mM solution on day of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Antinomy&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>10002-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ceruloplasmin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cesium&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>100011-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Complete, EDTA free protease inhibitors&#160;&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Conalbumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cu, Zn Superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ferritin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ICP-MS multielemental calibration standards&#160;</td>
			<td>AccuStandard</td>
			<td></td>
			<td>Made up to required concentrations in 1% nitric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microvolume UV spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;65% Nitric acid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100441</td>
			<td>Diluted to 1% for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Peek tubing&#160;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5042-6461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3&#956;m, 150&#197;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-2508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals inc.&#160;</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Thyroglobulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standards for quantitative metalloproteomic analysis using size exclusion icp-ms

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Metalloprotein standartlarının kullanımı boyut dışlama sütun kalibrasyonu için izin verir. Şekil 1A için sağım profilini gösterir standartları tiroglobülin, ferritin, seruloplazmin, Cu / Zn SOD ve bağlı olan metal bazlı Vitamin B 12 (Fe, Co, Cu, Zn ve I) &#39;in. Şekil 1B boşluk hacmine bölünen (ve elüsyon hacmi biçiminde sunulmaktadır molekül protein standartlarının ve ağırlıkça elüsyon süresi göre ebat eksklüzyon kolonu için kalibrasyon eğrisi) görülmektedir kolonu (Vo). Bu standart eğri oluşturmak için kullanılan proteinler, A, konalbümin, seruloplazmin, ferritin, SOD ve tiroglobülin Concanavalin vardır. Sütun üzerine enjekte Fe 60,000 ug Şekil 2B regresyon analizi s kullanılarak gerçekleştirilir - Şekil 2A, 2.000 aralığında ferritin elüsyon gösterireak alanı. 2B ve 2C pik alanları kullanılarak oluşturulan analizleri regresyon Cu ve Zn ve 2E ve 2F için Cu / Zn SOD için yıkama profilleri are Rakamlar. Regresyon analizi sonuçları protein ile bağlantılı metal miktarı kantitatif tespit edilebilir, böylece ug / sn sayım / saniye ham verileri dönüştürmek için kullanılır. Dönüşüm lineer regresyon (bakır ör 334,6 (sayım / saniye) x (san / PG)) eğimi tarafından sayım / saniye bölünmesi ile yapılır. Belirtildiği gibi, bu tekniğin karmaşık biyolojik örneklerinde metalloproteinleri tespit etmek için kullanılabilir. İnsan beyni ve plazma Bu teknik tabi tutulmuş ve 3 ve 4, sırası ile, elde edilen sonuçları gösterir Şekil edilmiştir. SEC-ICP-MS ile ayrılmış insan beyni, her biri farklı bir metali temsil ettiği, Şekil 3A-3C&#39;de gösterilen<html> İlgi alanına (Cu, Zn veya Fe). insan plazma Bu teknik maruz kaldığında 4A-4C elde izleri de gösterir. Numunenin karmaşıklığı ve bolluğu görülür zirveleri sayısını etkileyecektir. beklenen plazma seruloplazmin ve transferrin dahil olmak üzere birkaç Metaloproteinlerde hakim gibi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Boyut Dışlama Kromatografisi Şekil 1. Kalibrasyon -. Kendi metallere dayalı metalloprotein standartları için bilinen Metaloproteinlerde (A) Elüsyon profilinin kullanılması Kütle Spektrometresi - Endüktif Coupled Plasma. (B) protein standartları tiroglobulin (I) &#39;in, ferritin için moleküler ağırlık, kalibrasyon eğrisi, (ii), seruloplazmin, (iii), konalbumin (IV), Cu / Zn SOD (V) ve (VI)&#39; ya concanavalin.&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Ferritin ve Metalloprotein Standartları olarak Cu / Zn SOD Şekil 2. Kompleks Biyolojik örnek olarak Metalloproteinler ile Cu, Fe ya da Zn Eşlik miktarını belirlemek için (A) Elüsyon profili ferritin enjeksiyon aralığı 2000&#39;den fazla -. 60.000 mg / L demir. (B) ve 200 enjeksiyonu aralığında Cu / Zn SOD (c) Elüsyon profili -, sırasıyla bakır ve çinko, 6.000 ug / L&#39;dir. (D), (E) ve (F) metaller demir, bakır ve çinko için regresyon analizi sonuçlarını gösterir, sırasıyla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3. Cu, Fe ve (C) Çinko iz İnsan Beyin. (A) Bakır iz (B) Demir iz Zn Metalloproteome. Her metal için protein standartlarının elüsyon grafiğinin altında belirtilen moleküler ağırlığı ile siyah iz ile gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> İnsan Plazma Şekil 4. Cu, Fe ve Zn Metalloproteome. (A) Bakır iz (B) Demir iz (C) Çinko iz. her metal için Protein standartlarının elüsyon molekül ağırlığına sahip siyah izleme ile gösterilmiştirGrafiğin altında dicated. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS at JoVE.com

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Boyut Dışlama ICP-MS kullanarak Nicel Metalloproteomic Analiz Standartları

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

standards-for-quantitative-metalloproteomic-analysis-using-size

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Atomic Spectroscopy

SCIENTISTS IN ACTION

15.1K Görüntüleme.  The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health. Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins. 

Video: Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Kimya

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Kolloidal Probe Nanoscopy kullanarak parçacık-parçacık Etkileşimleri Nicel ve Nitel Sınav

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

Slp1 Polimerler ve Monolayer Au-etkileşimden<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, biyomoleküler metal Çalışmaları Araçlar olarak ICP-MS ve AFM

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Bitki Doku Organik Asit belirlememize Kılcal Elektroforez kullanma: Bir Test Case incelenmesi<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Tohumlar

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

Dinamik ışık saçılımı Mikroskopi Bulanık Çözümleri Tane Büyüklüğü Dağılımının Ölçümü

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

İmalat ve fotonik termometreler test

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Dinamik Işık Saçılma Parçacık Boyut Analizinde Gerilim Uygulaması

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

Demir Redoks Türlerinin Nicelleştirilmesi İçin Kapiller Elektroforez-Endüktif Birleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresi (CE-ICP-MS) Kurulumu (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

Hedeflenen İlaç Teslimatı için Doxorubicin Yüklü Aptamer-PEI-g-PEG Modifiye Altın Nanopartiküllerinin Sentezi

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, chemistry, and their potential to enable advanced materials. To effectively understand and regulate the physico-chemical properties and potential adverse effects of nanoparticles, validated measurement procedures for the various properties of nanoparticles need to be developed. While procedures for measuring nanoparticle size and size distribution are already established, standardized methods for analysis of their surface chemistry are not yet in place, although the influence of the surface chemistry on nanoparticle properties is undisputed. In particular, storage and preparation of nanoparticles for surface analysis strongly influences the analytical results from various methods, and in order to obtain consistent results, sample preparation must be both optimized and standardized. In this contribution, we present, in detail, some standard procedures for preparing nanoparticles for surface analytics. In principle, nanoparticles can be deposited on a suitable substrate from suspension or as a powder. Silicon (Si) wafers are commonly used as substrate, however, their cleaning is critical to the process. For sample preparation from suspension, we will discuss drop-casting and spin-coating, where not only the cleanliness of the substrate and purity of the suspension but also its concentration play important roles for the success of the preparation methodology. For nanoparticles with sensitive ligand shells or coatings, deposition as powders is more suitable, although this method requires particular care in fixing the sample.

A number of different procedures for preparing nanoparticles for surface analysis are presented (drop casting, spin coating, deposition from powders, and cryofixation). We discuss the challenges, opportunities, and possible applications of each method, particularly regarding the changes in the surface properties caused by the different preparation methods.

ToF-SIMS ve XPS Analizi için Nanopartiküllerin Hazırlanması

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...