We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors' work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).

<ol>
	<li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Situ Hybridization Methods. , (2015).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846 (2004).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization:+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules.">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).</li><li>Speel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robert+Feulgen+Prize+Lecture+1999.+Detection+and+amplification+systems+for+sensitive,+multiple-target+DNA+and+RNA+in+situ+hybridization:+looking+inside+cells+with+a+spectrum+of+colors.">Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors.</a> Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Hartmann, C., J&#228;ckle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+relationships+between+a+novel+Drosophila+stripe+expressing+gene+and+known+segmentation+genes+by+simultaneous+visualization+of+transcript+patterns.">Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns.</a> Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).</li><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+detection+of+mRNA+transcript+localizations+in+fish+and+fly+embryos+using+alkaline+phosphatase+and+beta-galactosidase+conjugated+antibodies.">Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies.</a> Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).</li><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-,+two-,+and+three-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos.">One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Methods. 23 (4), 359-372 (2001).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+vertebrate+and+Drosophila+embryos.">Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos.</a> Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolour+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos.">Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).</li><li>O'Neill, J. W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-label+in+situ+hybridization+using+biotin+and+digoxigenin-tagged+RNA+probes.">Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes.</a> Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).</li><li>S&#246;ll, I., Hauptmann, G., G, H. a. u. p. t. m. a. n. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolored+visualization+of+transcript+distributions+in+Drosophila+embryos.">Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).</li><li>Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzed+reporter+deposition,+a+novel+method+of+signal+amplification.+Application+to+immunoassays.">Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays.</a> J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+whole-mount+in+situ+hybridization.">Multicolor whole-mount in situ hybridization.</a> Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).</li><li>S&#246;ll, I., Hauptmann, G., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+and+automated+whole-mount+in+situ+hybridization+for+systematic+gene+expression+analysis+in+embryonic+zebrafish+forebrain.">Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).</li><li>Bergalet, J., et al., Hauptmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcript+localization+in+Drosophila+embryos+and+tissues+visualized+by+multiplex+FISH.">Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).</li><li>Walldorf, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empty+spiracles,+a+gap+gene+containing+a+homeobox+involved+in+Drosophila+head+development.">Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development.</a> Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).</li><li>Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+transcripts+from+the+segmentation+gene+fushi+tarazu+during+Drosophila+embryonic+development.">Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development.</a> Cell. 37 (3), 833-841 (1984).</li><li>Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+sloppy+paired+locus+encodes+two+proteins+involved+in+segmentation+that+show+homology+to+mammalian+transcription+factors.">The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors.</a> Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+gene+expression+patterns+reveal+transverse+and+longitudinal+subdivisions+of+the+embryonic+zebrafish+forebrain.">Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).</li><li>Long, S., Rebagliati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+two-color+whole-mount+in+situ+hybridizations+using+digoxygenin-+and+dinitrophenol-labeled+RNA+probes.">Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes.</a> Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+using+enhanced+tyramide+signal+amplification.">Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification.</a> Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).</li><li>Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-labeling+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+analysis+of+overlapping+gene+expression+in+brain+tissue+with+high+level+of+autofluorescence.">Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence.</a> J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).</li><li>Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase-fast+red,+a+new+fluorescent+label.+Application+in+double+labelling+for+cell+cycle+analysis.">Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis.</a> J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alkaline+phosphatase-mediated+azo+dye+staining+for+dual+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish.">Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في الموقع التهجين (ISH) مع المسمى بالإشعاع تحقيقات الحمض النووي غالبا ما يستخدم للكشف عن توطين RNA على أقسام الأنسجة. طريقة ISH المشع، ومع ذلك، هو مضيعة للوقت، أقل حساسية، ولا يسمح التقدير كاملة أنماط توزيع نص في يتصاعد كلها. في المقابل، يسمح الموصوفة هنا طريقة MC-WISH المقارنة المباشرة لعدة مجالات التعبير الجيني في الألوان المتناقضة داخل أجنة سليمة. MC-WISH لديه ميزة هذا السياق النسيجي واضح على الفور وتصور ببساطة عن طريق معيار brightfield المجهري. وهذا يوفر إمكانية لربط مجالات التعبير الجيني الطوبوغرافي لبعضها البعض بدقة عالية وتحديد المواقع التعبير فريدة ومتداخلة بطريقة سريعة وموثوق بها. من ناحية أخرى، ISH الفلورسنت المضاعفة (FISH) هو أقوى فيما يتعلق الحساسية والدقة، ويفضل أن تستخدم، إذا الخلوية أو حتى إعادة الفرعية الخلويةمطلوب حل من الكشف مرنا. طيف واسع من النصوص التي تم تعيينها من قبل MC-WISH تشير إلى أن تقريبا أي نص يمكن تحليل ليس فقط في الجنينية ولكن أيضا في الأنسجة اليرقات والكبار والأنواع الأخرى من ذبابة الفاكهة. وبالفعل، فإن الإجراء الموضح تفاصيلها هنا لذبابة الفاكهة، ويعمل بكفاءة بالمثل مع الأجنة الزرد 11،16،22. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف طريقة MC-WISH إلى مجموعة واسعة من اللافقاريات والفقاريات الأجنة وعينة الأنسجة. التسميات ناشبة وتركيزات التحقيق نحن نستخدم بشكل روتيني فلوريسئين، digoxigenin، والبيوتين كعناوين ناشبة تحقيقات RNA. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق تحقيقات المسمى نيتروفينول التي أدخلت في التجارب WISH الزرد 23-25. عرض تحقيقات المسمى فلوريسئين حساسية أقل بالمقارنة مع غيرها من العلامات ناشبة، لذلك يتم استخدام أفضل أن فلوريسئين وأو الكشف عن محاضر وفيرة. يتم اختبار كل مسبار كتب حديثا لأول مرة في تجربة WISH واحدة، حيث يتم تقييم أدائها إما باستخدام BCIP / NBT أو سريع الأحمر، والركيزة. ويعتبر تركيز التحقيق على النحو الأمثل عندما يتم التوصل إلى إشارة قوية بدون التنمية الخلفية داخل دقيقة لعدد قليل من ساعة. للتأكد من أن مجالات التعبير عن الاهتمام وقد تم الكشف في الكامل مدى كتبها MC-WISH، فمن الضروري أن تصور كل نمط النص التي كتبها وحيد تسمية التجارب WISH باستخدام مزيج الركيزة الأكثر حساسية، BCIP / NBT. هذا يضمن أن مجالات التعبير ضعيفة لا يغفل في التجربة متعدد الاهداف. للتعويض عن حساسية أقل من تركيبات الركيزة الأخرى لا بد من استخدام الضعف (لثلاث مرات) تركيزات التحقيق بالمقارنة مع معيار BCIP / NBT تلطيخ. انخفاض الرقم الهيدروجيني تعطيل الخطوة تعطيل انخفاض الرقم الهيدروجيني يمكن أن يؤدي إلىالتفكك الجزئي من العقاقير المسمى ناشبة الهجينة RNA التحقيق / الشعور مرنا مما أدى إلى انخفاض الكشف عن إشارة في جولات تلطيخ الثانية والثالثة. لتقليل الخسائر في الحساسية، والخطوات تعطيل قصيرة قدر الإمكان. مررنا بها أن فترة حضانة 10 دقيقة في انخفاض الرقم الهيدروجيني يكفي للقضاء على AP-النشاط. يغسل سريعة لاحقة في كميات كبيرة تضمن التخفيف السريع من غير منضم تقارن الضد-AP وتمنع إعادة ملزم للتحقيقات haptenized. وتشمل الإجراءات البديلة تثبيت امتصاص العرق وتعطيل الحرارة. ومع ذلك، فإن بعض رواسب اللون لا حرارة مستقرة وامتصاص العرق التثبيت قد لا تكون كافية لتعطيل كامل للAP. تعطيل ناقصة من الأول التطبيقية الضد-AP المترافقة يمكن أن يؤدي إلى إعادة تصور نمط مرنا في الكشف التالية تؤدي الجولة إلى التداخل ايجابية كاذبة في التعبير مع الأنواع مرنا الثانية التي يتم الكشف عنها. لذلك، في تجربة السيطرة عشريتم تقسيم الأجنة ه إلى تيارين بعد تعطيل أول التطبيقية الضد-AP المترافقة. تم حذف الثاني المترافقة الضد-AP من الكسر السيطرة، وينبغي ألا تنتج إشارة في رد فعل اللون الثاني. ومع ذلك، إذا كان رد فعل اللون الثاني يولد نمط توزيع إشارة المقابلة لأول واحد، ثم كان الإجراء تعطيل يست فعالة. في هذه الحالة، يجب أن تطول فترة حضانة في انخفاض الرقم الهيدروجيني الحل محطة للتجربة القادمة. أوامر AP تطبيق الركيزة منذ قطرات حساسية مع كل جولة لاحقة من الكشف، فإنه من المستحسن للكشف عن من mRNAs أقل وفرة قبل النصوص أكثر وفرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الأحمر السريع والسريع تركيبات الركيزة الزرقاء هي أقل بكثير حساسية من purpleblue BCIP / NBT وصمة عار، بحيث يتم تطبيق الأصباغ سريع ويفضل في الجولة الأولى تلطيخ للكشف عن نسخة أعرب أقوى. هذا أيضا حكما ميزة أن BCIP لاحق / NBT تلطيخ يمكن رصدها، وتوقفت في الوقت المناسب قبل يحصل على إشارة purpleblue مظلمة للغاية فيما يتعلق أخف الأصباغ سريعة. وهكذا في تجربة اثنين من الألوان القياسية، لأول مرة يتم الكشف عن أعربت مرنا أقوى من قبل سريع الأحمر والثانية الأضعف واحدا تلو BCIP / NBT. كبديل لالأصباغ سريعة يمكن تطبيق الصفراء تركيبات INT الركيزة، ولكن الذي ينتج رواسب أن تصبح نشر بعد مرور بعض الوقت. لذلك يتم تطبيق BCIP / INT حصرا في تلطيخ الجولة الأخيرة. ونتيجة لذلك في تجربة ثلاثة ألوان نحن غالبا ما تستخدم سريع أولا الأحمر، BCIP الثاني / NBT (أو الأزرق السريع) والثالث مزيجا الركيزة INT. لاحظ أنه من المستحسن لتصوير الأجنة الملون في أقرب وقت ممكن عند تطبيق INT. كشف الفلورسنت الأصباغ AZO قد يكون من الصعب في بعض الأحيان إلى التعرف على الأنماط التعبير المتداخلة عندما قتامة لون راسب والتظليل واحدة أخف وزنا. Fأو سبيل المثال، وضعت بقوة BCIP / NBT راسب يمكن أن تخفي أخف إشارات صبغ سريع. طريقة واحدة للحصول على حل هذه المشكلة لالتقاط الصور على الفور بعد كل تلطيخ وإزالة اللون راسب التطبيقية قبل الجولة كشف المقبلة. في هذه الحالة، يتم إزالتها من الكحول للذوبان الأصباغ صبغ (سريع الأحمر) وINT رواسب من يغسل الايثانول بعد جولات الكشف الأولى والثانية على التوالي، ويطبق BCIP / NBT تلطيخ باعتبارها مشاركة AP-الركيزة 26. والاحتمال الآخر هو للاستفادة من خصائص الفلورية أصباغ الأزو. سريع الأحمر يمكن تصور استخدام فلتر رودامين يحدد 27، في حين الأزرق سريع يمكن ملاحظتها مع مرشحات الحمراء حتى 28،29. المقارنة أو تراكب الصور اللونية والفلورسنت يمكن أن تكشف عن موقع هذا النهج distribution.Using التعاون والتنمية إشارة BCIP / NBT لابد من توقف في الوقت المناسب، بحيث لا تصبح كثيفة جدا وتطفئ إشارة الفلورسنت من صبغ AZO ناتج التفاعل.

في الموقع التهجين (ISH) هو الأسلوب القياسي للكشف وتوطين النصوص RNA في سياق الصرفي، داخل الخلايا والأنسجة والكائنات الحية 1. الإشارات التي تنتجها الإجراء ISH وتصور عادة من قبل أنظمة الكشف المشعة، فلوري واللونية. في السنوات الأخيرة التقدم التكنولوجي الكبير في ISH الفلورسنت (FISH) 2 أدى إلى تحسن كبير الحساسية والدقة، والسماح للكشف وتحديد الكميات التعبير الحمض النووي الريبي في الخلايا واحدة ومستويات شبه الخلوية والتصور RNA تصل إلى جزيئات واحدة. بينما 3،4 وتستخدم أساليب FISH احد جزيء المتطورة لتطبيقات أكثر تخصصا، ISH مولد اللون على نطاق واسع باعتباره RNA روتيني في طريقة الكشف الموقعي في مجال البحث والتشخيص السريري. للكشف عن مولد اللون تستخدم تفاعلات إنزيم هطول الأمطار، والتي تولد منتجات مرئية في الألوان المتناقضة في المواقعالتهجين 5. وهذا له ميزة أن التصور RNA يمكن دمجها مع البقع النسيجية الروتينية والسياق الصرفي واضحة على الفور من قبل معيار brightfield المجهري. وعلاوة على ذلك، العديد من ركائز اللون تطبق إنتاج الرواسب، التي هي مستقرة في وسائل الإعلام تصاعد العضوية و / أو مائي، بحيث الاستعدادات عينة دائمة ويمكن الحصول على 5. في ذبابة الفاكهة والبروتوكولات ISH الأولية طبقت تحقيقات المسمى النظائر المشعة للكشف عن نسخة على مواد مقطوع 6. في حين أنه من الصعب إعادة بناء من أقسام الأنسجة أنماط نسخة كاملة من الأجنة بأكملها أو أجهزة الجسم، وتطبيق إجراءات ISH اللونية مع تحقيقات المسمى غير بالإشعاع يجعل من الممكن عالميا لكشف توزيعات RNA في يتصاعد كلها 7. على الرغم من أن العديد من الاختلافات ISH مولد اللون موجودة، في نموذجية كله يشن الموقع التهجين (WISH) بروتوكولات HYB فيتم الكشف عن تحقيقات المسمى ناشبة ridized بواسطة أضداد ناشبة مترافق إلى إنزيم مراسل وتصور النصوص مرنا من قبل مولد اللون عجل. لوحة من رواسب ألوان مختلفة التي تنتجها مراسل إنزيمات الفوسفاتيز القلوية (AP)، الفجل البيروكسيداز (POD)، وبيتا غالاكتوزيداز (غال) يسمح للكشف المميزة لأهداف متعددة في واحدة ونفس العينة 8-14. ومع ذلك، يستمر POD النشاط الأنزيمي فقط لفترة زمنية محدودة ورد فعل اللونية غال نوعا ما أقل حساسية، بحيث دون إضافية (tyramide) إشارة التضخيم 15 الكشف عن محاضر أقل وفيرة يمكن أن يكون تحديا مع هذه الإنزيمات. في المقابل، فإن النشاط الدائم من AP يسمح طويلة الأمد دوران الركيزة وارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ولذلك، كشف متتابعة باستخدام AP مراسل الانزيم مع ركائز ألوان مختلفة وقد أثبتت نجاحا في فعالية وكشف المميز لمدة تصل إلى ثلاثة نصوص مختلفة في الأجنة واحدة 10-12،16. لهذا متعدد الاهداف WISH اللونية (MC-WISH) طريقة (الشكل 1) 14، يتم إنشاء المسمى تحقيقات RNA العقاقير عن طريق النسخ في المختبر ووضع علامة مع واحدة من العلامات المتاحة ناشبة. الأجنة الفورمالديهايد الثابتة وpermeabilized عن طريق العلاج الميثانول وبروتين K الهضم. يتم تهجين الأجنة في وقت واحد خارج مع ما يصل الى ثلاثة وصفت مختلف تحقيقات RNA العقاقير كل محددة لجينة مختلفة. بعد إزالة التحقيق غير منضم من يغسل التشدد هو تصور كل التسمية ناشبة في جولة منفصلة من الكشف. وتتكون الجولة الكشف عن واحدة من الحضانة الأجنة مع الأجسام المضادة لمكافحة الناشبة بالإضافة إلى AP والتصور RNA من خلال تطبيق وAP-الركيزة التي تنتج اللون مستقرة راسب المترجمة. بعد الكشف عن الأجسام المضادة وتلطيخ، وتطبيق الضد-AP conjuتتم إزالة البوابة غسل انخفاض الرقم الهيدروجيني. في تجارب متعددة الألوان، كل جولة من كشف توظف الأجسام المضادة التي تستهدف مختلفة ناشبة التسمية وتصور كل نمط النص من قبل الركيزة لون مختلفة (الجدول 1). هي التي شنت الأجنة في الجلسرين وتصوير تحت المجهر المركب عالية الدقة باستخدام تدخل الفرق النقيض (DIC) البصريات.

<table><tbody><tr><td>Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-free&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTP Set</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-12-UTP</td><td>Roche</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolute&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium citrate</td><td>Scharlau</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>deionized formamide</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>RNA type VI from torula yeast</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-biotin-AP Fab fragments&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody</td><td>Vector laboratories</td><td>MB-3100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Scharlau</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Applichem</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red tablet set</td><td>Sigma</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>Fast Blue BB salt</td><td>Sigma</td><td>F3378</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-MX-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N5000</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-GR-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N3625</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-BI-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N2250</td><td></td></tr><tr><td>Magenta-Phos</td><td>Biosynth</td><td>B7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>INT/BCIP solution</td><td>Roche</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 86-88%</td><td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>Universal incubator</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Grant</td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&amp;nbsp; inserts 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Netwell carrier kit 15 mm</td><td>Corning</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos

لتحليل الشبكات التنظيمية الجينات النشطة أثناء التطور الجنيني وتوالد فمن الضروري أن تحدد على وجه الدقة كيف يتم التعبير عن جينات مختلفة في العلاقة المكانية لبعضها البعض في الموقع. متعددة الهدف مولدات اللون كله يشن الموقع التهجين (MC-WISH) يسهل كثيرا من المقارنة الفورية من أنماط التعبير الجيني، كما أنه يسمح التصور مميزة من الأنواع مرنا مختلفة في الألوان المتناقضة في نفس العينة العينة في. وهذا يوفر إمكانية لربط مجالات التعبير الجيني الطوبوغرافي لبعضها البعض بدقة عالية وتحديد المواقع التعبير فريدة ومتداخلة. في بروتوكول المعروضة، وصفنا إجراء MC-WISH لمقارنة مرنا أنماط التعبير عن الجينات المختلفة في الأجنة ذبابة الفاكهة. ما يصل الى ثلاثة تحقيقات RNA، كل محددة لجين آخر وصفت من قبل ناشبة مختلفة، هي تهجين في الوقت نفسه إلى عينات الجنين والكشف في وقت لاحق من قبل القلويشمال شرق الفوسفاتيز المستندة المناعية اللونية. وترد تفاصيل الإجراء الموضح هنا لذبابة الفاكهة، ولكن يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع الأجنة الزرد.

بروتوكول صفها يسمح التصور في وقت واحد من أنماط نص متعددة في ألوان مختلفة. يوفر MC-WISH ميزة للمقارنة بشكل مباشر على أنماط التعبير عن جينات مختلفة في نفس الجنين. وكمثال على ذلك، وأنماط التعبير من الفتحات التنفسية فارغة (EMS) 19، فوشى tarazu (المنطقة الحرة برأس) 20 وقذرة تقرن 1 (slp1) 21 تتم مقارنة مباشرة في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأريمة الأجنة مرحلة وتصور في مجموعة متنوعة من ظلال اللون (الشكل 4) . تتوفر للحصول على لوحة المتناقضة رواسب اللون (الجدول 1) مختلفة توليفات الركيزة AP. يعجل اللون الأحمر التي تنتجها سريع الأحمر ويعجل الأرجواني التي تنتجها BCIP / NBT يمكن تمييزها بسهولة وبالتالي يتم استخدام الأكثر شيوعالاي في التجارب اللونين (الشكل 4A). ومع ذلك، يمكن وصمة عار BCIP / NBT سرعان ما تتحول إلى اللون الداكن بدلا من ذلك، بحيث تكون مستترة اللون الأحمر السريع في حالة جزئي شارك في توزيع النصوص. ولذلك، فإن تطبيق الأزرق السريع يمكن أن يكون ميزة، الذي يولد الزرقاء، والمنتجات الخضراء والبنفسجي في تركيبة مع NAMP، NAGP وNABP، على التوالي (الجدول 1). مزيج من الأزرق سريع مع NAMP يعطي اللون الأزرق الفاتح الذي هو مميز بسهولة من المنتج الأحمر السريع في مجالات التعبير المجاورة أو المتداخلة كما هو موضح هنا لنظم الإدارة البيئية والمواقع التعبير slp1 تصور باللون الأحمر والأزرق، على التوالي (الشكل 4B). يوفر الأزرق NAGP سريع مزيج تباين قوي مماثل لوصمة عار الحمراء سريع، بحيث هو واضح في مجال نظم الإدارة البيئية الخضراء مميزة من موقع التعبير slp1 الأحمر (الشكل 4C). ومع ذلك، إذا نظم الإدارة البيئية والمواقع التعبير slp1 يتم التوقفtected التي كتبها سريع الأزرق NABP وسريع الأحمر، على التوالي، مما أدى البنفسجي ورواسب اللون الأحمر أقل ملحوظ (الشكل 4D). كما ذكر أعلاه، الوجبات الأحمر والأزرق سريع NAGP من السهل التمييز كما هو موضح من قبل slp1 والتعبير في المنطقة الحرة برأس الأحمر والأخضر، على التوالي (الشكل 4D). MagentaPhos في تركيبة مع INT ينتج راسب أصفر، والذي يستخدم للكشف عن التعبير القطعي من المنطقة الحرة برأس (الشكل 4C، E). راسب أصفر اللون يولد النقيض جيدة لركائز باللون الأزرق كما يتضح من الكشف عن slp1 والمنطقة الحرة برأس مع سريع الأزرق NAMP وMAG / INT، على التوالي (الشكل 4E). ومع ذلك، فإن راسب أصفر هو ملحوظ أقل سهولة من المنتج أحمر سريع. الأصفر مجال التعبير الملون من EMS يمكن أن تكون بالكاد disti<html> nguished من التعبير منقاري من slp1 هو مبين في الحمراء (الشكل 4F). ولذلك، فإن الجمع بين ركائز لون له أن يتم اختياره بعناية لكل تجربة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط انسيابي لMC-WISH على سبيل التصور متعددة الالوان من ثلاثة أنماط نسخة فريدة من نوعها، اختيار بين مختلف تقارن الضد-AP وتركيبات الألوان الركيزة في كل دورة الكشف. الاختصارات: AP، الفوسفاتيز القلوية. BIO، البيوتين. DIG، digoxigenin. FLUO، فلوريسئين. لالاختصارات الأخرى ترى الأساطير إلى الشكل 4 والجدول 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> ق / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; تستخدم الرقم 2. إدراج الناقلين الجنين. (A) إدراجات تركيبها في الجزء السفلي مع أغشية البوليستر 15 مم و 74 ميكرون حجم شبكة الناقلين الجنين ذبابة الفاكهة. يتم تجميعها (B) يدرج في لوحات 12-جيدا، والتي تعمل بوصفها صواني خزان للحلول المختلفة. (C) ناقلات المتاحة ومقابض تسمح تجهيز (D) 12 إدراج / عينات الجنين في وقت واحد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> الشكل 3. تصاعد الأجنة الملون. الأجنة هي التي شنت في قطرة من 70٪ الجلسرين بين أكوام من coverslips، التي تعمل والفواصل. تتحرك لطيف من التطبيقكذب ساترة كبيرة تساعد على تدوير الأجنة التي شنت في الاتجاه المطلوب للمراقبة والتصوير الفوتوغرافي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> الرقم 4. وتظهر التصور متعدد الألوان من النصوص مرنا في أجنة ذبابة الفاكهة أمثلة من تجارب MC-WISH في أجنة ذبابة الفاكهة من وجهات النظر الجانبية. وتصور أنماط التعبير مرنا من الفتحات التنفسية فارغة (EMS)، فوشى tarazu (المنطقة الحرة برأس) وقذرة الموثوقة 1 (slp1) من قبل مختلف AP لون مجموعات الركيزة، التي أشارت في كل لوحة. تم الكشف عن النصوص التي كتبها (A) المنطقة الحرة برأس FLUO ونظم الإدارة البيئية DIG، ( <stroنانوغرام&gt; B) slp1 FLUO، نظم الإدارة البيئية BIO، وDIG المنطقة الحرة برأس، (C) نظم الإدارة البيئية BIO، slp1 FLUO، وDIG المنطقة الحرة برأس، (D) BIO المنطقة الحرة برأس، slp1 FLUO، ونظم الإدارة البيئية DIG، (E) slp1 FLUO، نظم الإدارة البيئية DIG، و المنطقة الحرة برأس BIO، (F) BIO المنطقة الحرة برأس، slp1 FLUO، وصفت نظم الإدارة البيئية DIG تحقيقات. كانت تحقيقات المسمى ناشبة الكشف عن immunohistochemically واحدا تلو الآخر في الأوامر المذكورة. الاختصارات: FB الأزرق السريع، FR، قرص أحمر سريع. لالاختصارات الأخرى ترى الأساطير إلى الشكل 1 والجدول 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مزيج الركيزة </td><td> أضف إلى 1 مل AP العازلة </td><td> Concentraنشوئها [ميكروغرام / مل] </td><td> عازلة AP </td><td> اللون </td><td> حساسية إشارة </td></tr><tr><td> BCIP NBT </td><td> 3.5 ميكرولتر 4.5 ميكرولتر </td><td> 175 337،5 </td><td> SB9.5 </td><td> بنفسجي </td><td> +++ </td></tr><tr><td> MAG INT </td><td> 5 ميكرولتر 5 ميكرولتر </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> أصفر </td><td> + </td></tr><tr><td> BCIP / INT حل الأوراق المالية </td><td> 7.5 ميكرولتر </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> أصفر </td><td> + </td></tr><tr><td> سريع الأزرق NAMP </td><td> 5 ميكرولتر 5 ميكرولتر </td><td> 250 250 </td><td> SB8.2 </td><td> أزرق </td><td> ++ </td></tr><tr><td> سريع الأزرق NABP </td><td> 20 ميكرولتر 10 ميكرولتر </td><td> 1000 500 </td><td> SB8.2 </td><td> البنفسجي </td><td> ++ </td></tr><tr><td> سريع الأزرق NAGP </td><td> 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر </td><td> 500 500 </td><td> TT8.2 </td><td> أخضر </td><td> + </td></tr><tr><td> سريع الأحمر NAMP </td><td> 1 قرص </td><td> 1000 400 </td><td> TT8.2 </td><td> أحمر </td><td> ++ </td></tr></tbody></table> الجدول 1. مجموعات الركيزة المختصرات: +++ وقوية؛ ++ والمتوسطة. +، وضعف NBT، كلوريد 4-نيترو-الأزرق-نتروبلو. BCIP، 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl فوسفات. INT، 2- (4-iodophenyl) -3- (4 nitrophenyl) -5-فينيل كلوريد نتروبلو. MAG، أرجواني-فوس، 5-برومو-6-كلورو-3-indolyl فوسفات، NAMP، نفثول-AS-MX-الفوسفات. NABP، نفثول-AS-BI-الفوسفات. NAGP، نفثول-AS-GR-الفوسفات. SB9.5، عازلة تلطيخ في درجة الحموضة 9.5. SB8.2، عازلة تلطيخ في درجة الحموضة 8.2. TT8.2، عازلة تريس، توين في درجة الحموضة 8.2.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

نحن تصف مولد اللون كله جبل في الموقع التهجين (MC-WISH) إجراء متعدد الاهداف في أجنة ذبابة الفاكهة سليمة مما يتيح كشف في وقت واحد ومحدد من ثلاثة أنماط توزيع مرنا مختلفة المتناقضة رواسب اللون.

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

multi-target-chromogenic-whole-mount-situ-hybridization-for-comparing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

11.4K Views.  Stockholm University.  نحن تصف مولد اللون كله جبل في الموقع التهجين (MC-WISH) إجراء متعدد الاهداف في أجنة ذبابة الفاكهة سليمة مما يتيح كشف في وقت واحد ومحدد من ثلاثة أنماط توزيع مرنا مختلفة المتناقضة رواسب اللون. 

Video: Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

تصور الاتجار المعتمد على الهيكل الخلوي للعضيات المحتوية على الدهون في أجنة ذبابة الفاكهة

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

الكمية مقارنة رابطة الدول المستقلة التنظيم العنصر (لجنة المساواة العرقية) في الأنشطة المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video