Name: multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos
Uploaded: 2016-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors' work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).

<ol>
	<li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Situ Hybridization Methods. , (2015).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846 (2004).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization:+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules.">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).</li><li>Speel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robert+Feulgen+Prize+Lecture+1999.+Detection+and+amplification+systems+for+sensitive,+multiple-target+DNA+and+RNA+in+situ+hybridization:+looking+inside+cells+with+a+spectrum+of+colors.">Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors.</a> Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Hartmann, C., J&#228;ckle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+relationships+between+a+novel+Drosophila+stripe+expressing+gene+and+known+segmentation+genes+by+simultaneous+visualization+of+transcript+patterns.">Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns.</a> Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).</li><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+detection+of+mRNA+transcript+localizations+in+fish+and+fly+embryos+using+alkaline+phosphatase+and+beta-galactosidase+conjugated+antibodies.">Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies.</a> Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).</li><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-,+two-,+and+three-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos.">One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Methods. 23 (4), 359-372 (2001).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+vertebrate+and+Drosophila+embryos.">Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos.</a> Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolour+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos.">Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).</li><li>O'Neill, J. W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-label+in+situ+hybridization+using+biotin+and+digoxigenin-tagged+RNA+probes.">Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes.</a> Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).</li><li>S&#246;ll, I., Hauptmann, G., G, H. a. u. p. t. m. a. n. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolored+visualization+of+transcript+distributions+in+Drosophila+embryos.">Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).</li><li>Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzed+reporter+deposition,+a+novel+method+of+signal+amplification.+Application+to+immunoassays.">Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays.</a> J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+whole-mount+in+situ+hybridization.">Multicolor whole-mount in situ hybridization.</a> Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).</li><li>S&#246;ll, I., Hauptmann, G., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+and+automated+whole-mount+in+situ+hybridization+for+systematic+gene+expression+analysis+in+embryonic+zebrafish+forebrain.">Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).</li><li>Bergalet, J., et al., Hauptmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcript+localization+in+Drosophila+embryos+and+tissues+visualized+by+multiplex+FISH.">Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).</li><li>Walldorf, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empty+spiracles,+a+gap+gene+containing+a+homeobox+involved+in+Drosophila+head+development.">Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development.</a> Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).</li><li>Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+transcripts+from+the+segmentation+gene+fushi+tarazu+during+Drosophila+embryonic+development.">Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development.</a> Cell. 37 (3), 833-841 (1984).</li><li>Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+sloppy+paired+locus+encodes+two+proteins+involved+in+segmentation+that+show+homology+to+mammalian+transcription+factors.">The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors.</a> Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+gene+expression+patterns+reveal+transverse+and+longitudinal+subdivisions+of+the+embryonic+zebrafish+forebrain.">Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).</li><li>Long, S., Rebagliati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+two-color+whole-mount+in+situ+hybridizations+using+digoxygenin-+and+dinitrophenol-labeled+RNA+probes.">Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes.</a> Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+using+enhanced+tyramide+signal+amplification.">Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification.</a> Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).</li><li>Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-labeling+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+analysis+of+overlapping+gene+expression+in+brain+tissue+with+high+level+of+autofluorescence.">Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence.</a> J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).</li><li>Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase-fast+red,+a+new+fluorescent+label.+Application+in+double+labelling+for+cell+cycle+analysis.">Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis.</a> J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alkaline+phosphatase-mediated+azo+dye+staining+for+dual+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish.">Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הכלאה באתר (איש) עם בדיקות חומצות גרעין שכותרתו רדיואקטיבית משמש לעתים קרובות כדי לזהות את הלוקליזציה של RNA על סעיפי רקמות. שיטת ISH רדיואקטיבי, לעומת זאת, היא לצרוך זמן, פחות רגיש, ואינה מאפשרת הערכה של דפוסי הפצת תמליל מלאים בכל-mounts. לעומת זאת, בשיטת MC-מאחלים המתוארים במסמך זה מאפשרת השוואה הישירה של תחומים ביטוי גנים רבים בצבעים מנוגדים בתוך עוברים ללא פגע. יש MC-מאחל ליתרון שההקשר היסטולוגית ניכר מייד ומדמיין פשוט על ידי מיקרוסקופ brightfield הסטנדרטי. זה מספק את האפשרות להתייחס תחומים ביטוי גנים טופוגרפיים זה לזה ברמת דיוק גבוהה ולהגדיר אתרי ביטוי ייחודיים וחופפים באופן מהיר ואמין. מצד השני, איש מרובב ניאון (דגים) הוא חזק יותר ביחס לרגישות ורזולוציה ומשמש רצוי, אם סלולארי או אפילו מחדש משנה הסלולרפתרון של גילוי mRNA נדרש. הספקטרום הרחב של תמלילים שמופה על ידי MC-מאחלים מצביע על כך שכמעט כל תמליל ניתן לנתח לא רק בעוברי, אלא גם ברקמות זחל ומבוגרים ובמינים אחרים מאשר דרוזופילה. ואכן, ההליך המתואר המפורט כאן לדרוזופילה, פועל באופן דומה יעיל עם עוברי דג הזברה 11,16,22. יתר על כן, שיטת MC-מאחלים ניתן להתאים למגוון רחב של עוברים חסרי חוליות ובעלי חוליות ודגימת רקמה. Hapten-תוויות וריכוזי בדיקה אנו משתמשים באופן שיגרתי והעמסת, digoxigenin, וביוטין כתוויות hapten של בדיקות RNA. יתר על כן, בדיקות שכותרת dinitrophenol ניתן להחיל, שכבר הציג בניסויי מאחלים דג הזברה 23-25. בדיקות שכותרת העמסה להציג רגישות פחותה בהשוואה לhapten-תוויות האחרות, כך ההעמסה המשמשת הטובה ביותר ואו זיהוי של תמלילי שפע. כל בדיקה עיבד חדש נבדקה ראשונה בניסוי משאלה אחת, שבו ביצועיה מוערכים או באמצעות BCIP / NBT או אדום מהיר כמצע. ריכוז בדיקה נחשב כאופטימלי כאשר איתות חזקה ללא פיתוח רקע מושגת בתוך דקות לכמה שעות. כדי לוודא שתחומי הביטוי של עניין זוהו על ידי MC-מאחלים מלוא היקפם, זה חיוני כדי לחזות כל דפוס תמליל על ידי ניסויי משאלה אחת-תווית באמצעות שילוב המצע רגיש ביותר, BCIP / NBT. הדבר מבטיח כי תחומים ביטוי חלשים לא התעלמו בניסוי רב-היעד. כדי לפצות על הרגישות פחותה של שילובי מצע האחרים זה חיוני להשתמש הוכפל (לשולש) ריכוזי בדיקה בהשוואה לBCIP הכתמה / NBT סטנדרטי. איון pH נמוך צעד איון pH הנמוך יכול להוביל להתפוררות חלקית של הכלאיים mRNA בדיקה / תחושת RNA antisense כותרת hapten וכתוצאה מכך גילוי אותות מופחתים בסיבובי הצביעה השניה והשלישי. כדי להקטין את איבוד ברגישות, צעדי איון הם קצרים ככל האפשר. אנחנו חווינו את זה זמן דגירה 10 דקות ב pH הנמוך מספיק עבור חיסול של AP-פעילות. שוטף מהיר לאחר מכן בכמויות גדולות להבטיח דילול מהיר של conjugates הנוגדן-AP מאוגד ולמנוע מחדש מחייב בדיקות haptenized. הליכים חלופיים כוללים קיבוע paraformaldehyde ואיון חום. עם זאת, חלק ממשקעי הצבע לא לחמם יציב וקיבעון paraformaldehyde עלול שלא להספיק לאיון של AP מלא. איון שלם של המצומד הנוגדן-AP הראשון שימושי יכול להוביל מחדש הדמיה של תבנית ה- mRNA בגילוי הבא סיבוב מוביל לחפיפה חיובית כוזבת בביטוי עם מיני mRNA השני כדי להתגלות. לכן, בניסוי שליטת העוברי דואר מחולקים לשני שברים לאחר איון של המצומד הנוגדן-AP הראשון השימושית. המצומד הנוגדן-AP השני מושמט מחלק השליטה ולא צריך לייצר אות בתגובת הצבע השנייה. עם זאת, אם תגובת הצבע השנייה יוצרת דפוס הפצת אות המתאים הראשון, ולאחר מכן את הליך איון לא היה יעיל. במקרה זה, זמן הדגירה בפתרון תחנת pH נמוך צריך להיות ממושך לניסוי הבא. הזמנות של יישום מצע AP מאז רגישות טיפות עם כל סיבוב של גילוי שלאחר מכן, רצוי לזהות mRNAs פחות בשפע לפני תמלילים שופעים יותר. בנוסף, האדום המהיר ושילובי מצע כחולים מהיר באופן משמעותי פחות רגישים מאשר BCIP purpleblue / כתם NBT, כך שצבעים מהיר מיושמים רצוי בסיבוב הראשון צביעה לגילוי של התמליל הביע החזק. גם שעות זהכיתרון שBCIP הכתמה / NBT שלאחר מכן יכולה להיות במעקב ועצרה בזמן לפני אות purpleblue מקבלת כהה מדי ביחס לצבעים הבהירים יותר המהיר. כך בניסוי שני צבעים סטנדרטיים, ראשון mRNA הביע החזק הוא זוהה על ידי אדום מהיר והשני החלש יותר אחד על ידי BCIP / NBT. כחלופה לצבעים המהיר שילובי מצע INT הצהובים עשויים להיות מיושמים, אשר עם זאת לייצר משקעים שהופכים לפזר אחרי כמה זמן. לכן BCIP / INT מיושם באופן בלעדי בסיבוב הצביעה האחרון. כתוצאה מכך בניסוי שלושה צבעים לעתים קרובות אנו משתמשים אדום הראשונים מהיר, BCIP השני / NBT (או כחול מהיר) ושלישית שילוב מצע INT. שים לב שרצוי לצלם עוברים מוכתמים בהקדם האפשרי בעת החלת INT. זיהוי ניאון של צבעי אזו זה יכול להיות קשה לפעמים לזהות דפוסי ביטוי חופפים כאשר משקע צבע כהה הוא הצללה אחד בהיר יותר. Fאו דוגמא, משקע BCIP / NBT מאוד מפותח יכול להסוות אותות צבע מהיר יותר. אחת דרכים לעקוף בעיה זו היא ללכוד תמונות באופן מיידי לאחר כל צביעה ולהסיר את משקע הצבע שימושי לפני הסיבוב הבא לאיתור. במקרה זה, צבע אזו אלכוהול מסיס במשקעים (אדום מהיר) וINT יוסרו על ידי שטיפות אתנול אחרי סיבובי הגילוי הראשונים והשני, בהתאמה, ומכתים BCIP / NBT מיושם כAP-המצע האחרון 26. אפשרות נוספת היא לנצל את תכונות ניאון של אזו צבעים. אדום מהיר ניתן דמיין באמצעות מסנן rhodamine קובע 27, בעוד כחול מהיר ניתן לצפות במסננים מרחיק אדומים 28,29. השוואה או כיסוי של תמונות chromogenic וניאון יכולה לחשוף את האתר של, פיתוח אות גישה זו distribution.Using-שיתוף BCIP / NBT יש ללהיפסק בזמן, כך שזה לא יהפוך לצפוף מדי ולהרוות את אות הניאון של צבע אזו מוצר תגובה.

הכלאה באתר (איש) היא השיטה סטנדרטית לגילוי ולוקליזציה של תעתיקי רנ&quot;א בהקשר מורפולוגיים, בתוך תאים, רקמות ואורגניזמים 1. האותות המיוצרים על ידי הליך ISH הם דמיינו בדרך כלל על ידי מערכות גילוי רדיואקטיבי, ניאון וchromogenic. בשנים האחרונות התקדמות טכנולוגית משמעותית בISH הניאון (דגים) 2 הביאו רגישות ורזולוציה השתפרה באופן דרמטי, המאפשרות איתור וכימות של ביטוי RNA בתא בודד ורמות תת-תאיות והדמיה RNA עד מולקולות בודדות 3,4 .While שיטות FISH מולקולה בודדת מתוחכמות המשמשות ליישומים מיוחדים נוסף, איש chromogenic נפוץ כRNA שגרתי בשיטת זיהוי אתר במחקר ואבחון קליני. לגילוי chromogenic תגובות ממטרים אנזים משמשות, אשר יוצרות מוצרים גלויים בצבעים מנוגדים באתריםשל הכלאה 5. זה היתרון שהדמית RNA יכולה להיות משולבת עם כתמים היסטולוגית שיגרתי והקשר מורפולוגיים ניכר מייד על ידי מיקרוסקופ brightfield הסטנדרטי. יתר על כן, רב של מצעי הצבע מיושמים לייצר משקעים, שהם יציבים בתקשורת הרכבה אורגנית ו / או מימית, כך שניתן להשיג הכנות מדגם קבועות 5. בדרוזופילה, פרוטוקולי ISH ראשוניים להחיל בדיקות שכותרתו רדיו-איזוטופי לגילוי תמליל על חומר מחולק 6. למרות שזה קשה לשחזר מסעיפי רקמות דפוסי תמליל מלאים של עוברים שלמים או מערכות איברים, יישום נהלי ISH chromogenic עם בדיקות שכותרת אינה רדיואקטיבית מאפשר לזהות באופן גלובלי הפצות RNA בכל-mounts 7. למרות וריאציות רבות של איש chromogenic קיימות, באופייני כל הר הכלאה באתר היב פרוטוקולים (רוצה)בדיקות שכותרת hapten ridized מזוהות על ידי נוגדנים נגד hapten מצומדת לאנזים כתב ותעתיקי mRNA הם דמיינו ידי אַב צֶבַע מזרז. לוח של משקעים בצבעים שונים המיוצרים על ידי כתב אנזימי phosphatase אלקליין (AP), peroxidase חזרת (POD), ובטא-galactosidase (GAL) מאפשר זיהוי הייחודי של מטרות מרובות ובעונה אחת המדגם 8-14. עם זאת, פעילות האנזימטית POD נמשכת רק לתקופת זמן מוגבלת ותגובת colorimetric הגל היא קצת פחות רגישה, כך שללא הגברה אות (tyramide) נוספת 15 הגילוי של תמלילים פחות בשפע יכולה להיות מאתגרת עם אנזימים אלה. לעומת זאת, הפעילות המתמשכת של AP מאפשרת למחזור מצע לטווח ארוך ויחס אות לרעש גבוה. ולכן, זיהוי רציף באמצעות אנזים כתב AP עם מצעים בצבע שונה הוכיח את יעילותו בתוקףזיהוי ייחודי של עד שלושה תעתיקים שונים בעוברים בודדים 10-12,16. למשאלה זו רב-יעד chromogenic (MC-תרצה) שיטה (איור 1) 14, בדיקות RNA antisense שכותרתו מופקות על ידי שעתוק במבחנה ומסומנת באחד מhapten-התוויות הזמינות. הם עוברים פורמלדהיד קבוע וpermeabilized על ידי טיפול מתנול ועיכול K proteinase. הכלאה של עוברים מתבצעת בו זמנית עם עד שלוש בדיקות RNA antisense שכותרתו שונה בכל ספציפית לגן אחר. לאחר הסרת הבדיקה מאוגד על ידי שטיפות החמרה כל hapten-תווית דמיין בסיבוב של גילוי נפרד. סיבוב זיהוי יחיד מורכב מדגירה של עוברים עם נוגדן אנטי hapten מצמידים את AP והדמיה RNA על ידי יישום של AP-מצע שמייצר משקע צבע יציב מקומי. לאחר זיהוי נוגדנים וצביעה, conju נוגדן-AP מיושםהשער הוסר על ידי שטיפת pH נמוכה. בניסויים ססגוניות, כל סיבוב של זיהוי מעסיק נוגדנים ממוקדים נגד hapten תווית שונה וכל דפוס תמליל היא דמיינה על ידי מצע שונה צבע (טבלת 1). עוברים הם רכובים בגליצרול וצלמו תחת מיקרוסקופ מתחם ברזולוציה גבוהה באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה.

<table><tbody><tr><td>Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-free&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTP Set</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-12-UTP</td><td>Roche</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolute&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium citrate</td><td>Scharlau</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>deionized formamide</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>RNA type VI from torula yeast</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-biotin-AP Fab fragments&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody</td><td>Vector laboratories</td><td>MB-3100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Scharlau</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Applichem</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red tablet set</td><td>Sigma</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>Fast Blue BB salt</td><td>Sigma</td><td>F3378</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-MX-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N5000</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-GR-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N3625</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-BI-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N2250</td><td></td></tr><tr><td>Magenta-Phos</td><td>Biosynth</td><td>B7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>INT/BCIP solution</td><td>Roche</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 86-88%</td><td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>Universal incubator</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Grant</td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&amp;nbsp; inserts 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Netwell carrier kit 15 mm</td><td>Corning</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos

כדי לנתח רשתות רגולציה גן פעילה בפיתוח וorganogenesis זה הכרחי להגדיר במדויק כיצד גנים השונים באים לידי ביטוי ביחס המרחבי לזה באתר עוברי. רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-ירצה) מאוד מקל ההשוואה מיידית של דפוסי ביטוי גנים, שכן היא מאפשרת הדמיה ייחודית של מיני mRNA שונים בצבעים מנוגדים באותו דגימת המדגם. זה מספק את האפשרות להתייחס תחומים ביטוי גנים טופוגרפיים זה לזה ברמת דיוק גבוהה ולהגדיר אתרי ביטוי ייחודיים וחופפים. בפרוטוקול שהוצג, אנו מתארים הליך MC-מאחלים להשוואת דפוסי ביטוי mRNA של גנים שונים בעוברי תסיסנית. עד שלוש בדיקות RNA, כל ספציפיות לגן אחר ושכותרתו על ידי hapten שונה, בו זמנית הם הכלאת דגימות העובר וזוהה לאחר מכן על ידי אלקליאימונוהיסטוכימיה colorimetric ne phosphatase מבוסס. ההליך המתואר מפורט כאן לדרוזופילה, אבל עובד באותה המידה גם עם עוברי דג הזברה.

הפרוטוקול המתואר מאפשר ההדמיה בו זמנית של דפוסי תמליל מרובים בצבעים שונים. MC-מאחלים מספק יתרון להשוות ישירות את דפוסי הביטוי של גנים שונים באותה העובר. כדוגמא, את דפוסי הביטוי של spiracles הריק (EMS) 19, Fushi tarazu (FTZ) 20 ומרושלים לזווג 1 (slp1) 21 בהשוואה ישירות בעוברים בblastoderm תסיסנית melanogaster ומדמיינים במגוון רחב של גווני צבע (איור 4) . שילובי מצע AP שונים זמינים כדי לקבל פנל של מנוגד משקעים צבע (טבלה 1). משקע הצבע האדום המיוצר על ידי אדום מהיר והמשקע הסגול המיוצר על ידי BCIP / NBT ניתן להבחין בקלות ולכן משמשים נפוץ ביותרly בניסויים בשני צבעים (איור 4 א). עם זאת, את כתם BCIP / NBT יכול להפוך במהירות לצבע ולא כהה, כך שהצבע האדום המהיר מוסווה במקרה של שיתוף הפצה החלקית של תמלילים. לכן, היישום של כחול מהיר יכול להיות יתרון, אשר מייצר מוצרים כחולים, ירוקים וסגולים בשילוב עם NAMP, NAGP וNABP, בהתאמה (לוח 1). השילוב של כחול מהיר עם NAMP נותן צבע תכלת שהוא בקלות להבחין מהמוצר האדום המהיר בתחומים ביטוי סמוכים או חופפים, כפי שמוצגים כאן לEMS ואתרי slp1 ביטוי דמיינו באדום וכחול, בהתאמה (איור 4). שילוב NAGP הכחול המהיר מספק ניגוד חזק דומה לכתם האדום המהיר, כך שתחום EMS הירוק הוא בבירור ייחודי מאתר הביטוי slp1 האדום (איור 4C). עם זאת, אם EMS ואתרי ביטוי slp1 הם דהtected ידי כחול NABP המהיר ואדום מהיר, בהתאמה, וכתוצאה מכך סגול ומשקעי צבע אדומים פחות ניכרים (איור 4D). כפי שצוין לעיל, אדום מהיר ומהיר הכחול NAGP קלים להבחין, כפי שמוצג על ידי slp1 וביטוי FTZ באדום וירוק, בהתאמה (איור 4D). MagentaPhos בשילוב עם INT מייצר משקע צהוב, המשמש כדי לחשוף את הביטוי המגזרי של FTZ (איור 4C, E). המשקע בצבע הצהוב יוצר ניגוד טוב למצעים בצבע הכחולים כפי שהודגם על ידי זיהוי של slp1 וFTZ עם כחול NAMP המהיר והפרקליט הצבאי הראשי / INT, בהתאמה (איור 4E). עם זאת, המשקע הצהוב ניכר פחות קל מהמוצר האדום המהיר. תחום הביטוי צבעוני הצהוב של EMS יכול להיות כמעט Disti<html> nguished מהביטוי מקורי של slp1 מוצג באדום (איור 4F). לכן, שילוב של מצעי צבע צריך להיות שנבחר בקפידה עבור כל ניסוי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של MC-תרצה. להדמיה צבעונית של שלושה דפוסי תמליל ייחודיים, לבחור בין conjugates שונה נוגדן-AP ושילובי מצע צבע בכל מחזור זיהוי. קיצורים: AP, phosphatase אלקליין; יו, ביוטין; DIG, digoxigenin; Fluo, והעמסת. לקיצורים אחרים לראות אגדות איור 4 וטבלה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> s / ftp_upload / 53,830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. הוספת כנישאי עובר. (א) הוספת מצוידת בתחתית עם ממברנות פוליאסטר של 15 מ&quot;מ קוטר ו -74 מיקרומטר גודל רשת משמשות כנישאי עובר דרוזופילה. (ב) מוסיף הם התאספו בלוחות 12-גם, שמתפקדים כמאגר למגשי הפתרונות השונים. (ג) ספקים וידיות זמינים מאפשרים עיבוד של (D) 12 מוסיף / דגימות עובר בו-זמנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> הרכבה איור 3. עוברים מוכתמים. עוברים הם רכובים בירידה של גליצרול 70% בין שתי ערימות של coverslips, אשר מתפקד כמפרידים. מרגש עדין של האפליקציהcoverslip הגדול שיקר עוזר לסובב את העוברים הרכובים לכיוון הרצוי לתצפית וצילום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> איור 4. הדמיה ססגוניות של תעתיקי mRNA בעוברי תסיסנית. דוגמאות לניסויי MC-מאחלים בעוברות תסיסנית מוצגות מנופים לרוחב. דפוסי ביטוי mRNA של spiracles הריק (EMS), Fushi tarazu (FTZ) ומרושל לזווג 1 (slp1) הם דמיינו ידי שילובים שונים AP צבע מצע, אשר הצביעו על כל לוח. תמלילים אותרו על ידי () Fluo FTZ וEMS DIG, ( <strong&gt; B) slp1 Fluo, EMS BIO, ולחפור FTZ, (ג) EMS BIO, slp1 Fluo, ולחפור FTZ, (ד) ביו FTZ, slp1 Fluo, וEMS DIG, (E) slp1 Fluo, EMS DIG, ו FTZ BIO, (F) ביו FTZ, slp1 Fluo, וEMS DIG שכותרתו בדיקות. בדיקות שכותרת hapten אותרו immunohistochemically אחד אחרי השני בהזמנות המפורטות. קיצורים: כחול מהיר FB; FR, לוח אדום מהיר. לקיצורים אחרים לראות אגדות איור 1 וטבלה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שילוב מצע </td><td> הוסף לחיץ 1 מיליליטר AP </td><td> Concentration [מיקרוגרם / מיליליטר] </td><td> מאגר AP </td><td> צֶבַע </td><td> רגישות אות </td></tr><tr><td> BCIP NBT </td><td> 3.5 μl 4.5 μl </td><td> 175 337.5 </td><td> SB9.5 </td><td> סָגוֹל </td><td> +++ </td></tr><tr><td> INT MAG </td><td> 5 μl 5 μl </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> צָהוֹב </td><td> + </td></tr><tr><td> פתרון מניות BCIP / INT </td><td> 7.5 μl </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> צָהוֹב </td><td> + </td></tr><tr><td> מהיר הכחול NAMP </td><td> 5 μl 5 μl </td><td> 250 250 </td><td> SB8.2 </td><td> כָּחוֹל </td><td> ++ </td></tr><tr><td> מהיר הכחול NABP </td><td> 20 μl 10 μl </td><td> 1,000 500 </td><td> SB8.2 </td><td> סָגוֹל </td><td> ++ </td></tr><tr><td> מהיר הכחול NAGP </td><td> 10 μl 10 μl </td><td> 500 500 </td><td> TT8.2 </td><td> יָרוֹק </td><td> + </td></tr><tr><td> מהיר האדום NAMP </td><td> לוח 1 </td><td> 1,000 400 </td><td> TT8.2 </td><td> אָדוֹם </td><td> ++ </td></tr></tbody></table> 1. שילובי שולחן מצע קיצורים: +++, חזק;. ++, בינוני; +, NBT החלש, כלוריד הכחול-4 ניטרו-tetrazolium; BCIP, 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-פוספט; INT, 2 (4 iodophenyl-) -3- (4-nitrophenyl) -5-פניל-tetrazolium כלוריד; MAG, מגנטה-Phos, 5-bromo-6-כלורו-3-indolyl-פוספט, NAMP, Naphthol-AS-MX-פוספט; NABP, Naphthol-AS-BI-פוספט; NAGP, Naphthol-AS-GR-פוספט; SB9.5, חיץ מכתים ב- pH 9.5; SB8.2, חיץ מכתים ב- pH 8.2; TT8.2, חיץ טריס-Tween ב- pH 8.2.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

multi-target-chromogenic-whole-mount-situ-hybridization-for-comparing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

11.4K Views.  Stockholm University.  אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע. 

Video: Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

רב-יעד Chromogenic כל הר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ'יק מוקדם

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

הר שלם

השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

הר כולו RNA פלורסנט

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization