Name: multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos
Uploaded: 2016-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors' work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).

1. Markierung von RNA-Sonden durch in vitro Transkription <ol><li> Zusammenbau in vitro-Transkriptionsreaktion in einem 1,5 ml Mikroröhrchen unter RNase-freien Bedingungen: 10,5 &amp; mgr; l DEPC-behandeltem H 2 O, 4,0 &amp; mgr; l 5x Transkriptionspuffer, 1,0 ul (1 ug) linearisiert, gereinigtes DNA-Matrize in DEPC-behandeltem H 2 O, 1,3 ul NTP-Mix, 0,7 &amp; mgr; Hapten-markiertes UTP, 0,5 ul RiboLock RNA-Inhibitor, 2,0 ul RNA-Polymerase. Hinweis: Das endgültige Reaktionsvolumen beträgt 20 ul. </li><li> Je Promotorsequenz T7 Verwendung der Schablone, T3 oder SP6-RNA-Polymerase für die in vitro-Transkription (siehe Referenz 17). </li><li> Wählen Digoxigenin-11-UTP, Biotin-16-UTP oder Fluorescein-12-UTP als Label für die RNA-Sonde. Für weitere Einzelheiten siehe die Diskussion der Hapten-Etiketten und Sondenkonzentrationen in der Diskussion. </li><li> Mischen Sie Transkriptionsreaktion und Spin-down kurz. </li><li> Lassen Sie transkribieren3 h bei 37 ° C. </li><li> 1 &amp; mgr; l RNase-freier DNase I auf die Transkriptionsreaktion zur Entfernung der Template-DNA, gut mischen, und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Passen Sie mit DEPC-behandeltem H 2 O das Probenvolumen zu 200 ul. </li><li> 100 l (0,5 Vol) 7,5 M Ammoniumacetat und 600 &amp; mgr; l (3 vol) Ethanol, um markierte RNA-Sonde auszufällen. Inkubation für 30 min bei RT. <ol><li> Verwenden Sie keine eiskaltem Ethanol, da dies zu unerwünschten Ausfällung von unincorporated Nukleotide führen. </li></ol></li><li> Zentrifugieren Sie das transkribierte RNA in einer temperaturgeregelten Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit (20,800 · g) für 30 min bei +20 ° C. Sorgfältig absaugen Überstand. </li><li> Waschen des resultierenden Pellets mit 70% Ethanol bei RT und Zentrifuge bei 20.800 × g für 10 min bei +20 ° C. </li><li> Überstand entfernen und darauf achten, nicht versehentlich saugen Sie den losen Pellets. Lassen Pellet an der Luft trocknen in der Mikroröhrchen mit geöffneten Deckel für ein paar Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Dislöse das erhaltene Pellet in 100 ul DEPC-behandeltem H 2 O. </li><li> Fügen Sie 300 ul vorgeHybridisierungsPuffer (50% Vol / Vol deionisiertem Formamid, 5 × SSC, 50 ug / ml Heparin-Natriumsalz, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA) und bei -20 ° C . Sonden können langfristig bei -20 ° C gelagert werden. Hinweis: Für einen ersten Test der neu transkribiert Sonde verdünnter 3 ul Hapten-markierten RNA-Sonde in 100 ul Hybridisierungspuffer, um die Endkonzentration für den WISH Experiment erhalten. </li></ol> 2. Verarbeitung der Embryo Proben unter Verwendung von Inserts Hinweis: Mit Mikroröhrchen oder Multi-Well-Platten für die Verarbeitung von Embryonen durch die verschiedenen Inkubationsschritte trägt das Risiko des Verlustes signifikante Mengen von Embryonen, die durch während der Austausch von Lösungen versehentlich Absaugen von ihnen. Um diesen Verlust zu vermeiden, kann es hilfreich sein, Körbe (wie Netwell Einsätze) zur Durchführung Embryo Proben durch das Verfahren zu verwenden. Dies sind Polystyrol inInserts mit einem Polyestergitter am Boden (2A), an dem die Embryonen während der Bearbeitung ruhen. <ol><li> Für die Verarbeitung von Embryonen in der WISH Verfahren, montieren Sie die Einsätze in einer 12-Well-Platte (2B) und 2 ml der entsprechenden Lösung in jede Vertiefung. </li><li> Pipettieren Sie die Embryonen in die Einsätze mit einer blauen Spitze. Stellen Sie sicher, dass alle Embryonen werden in Flüssigkeit eingetaucht. </li><li> Wenn Inkubationszeit Bereich sich der Embryo-Inserts enthalten, die in einem anderen 12-Well-Platte, die mit der Lösung für die nächste Stufe gefüllt ist. <ol><li> Verwenden Sie Carrier und Griffe (2C), um von einer Lösung zu übertragen bis zu 12 Proben in einer Zeit, in eine andere (2D). Hinweis: Um die erforderlichen Mengen zu reduzieren, verwenden Sie 2,0 ml Mikroröhrchen für die Vor-Hybridisierung / Hybridisierungsschritte (siehe Schritt 4.1) und 24-Well-Platten für die Färbung Reaktionen (STEP 6.2). Die Hybridisierung und Färbung Reaktionen werden in Mengen von 100 durchgeführt1; l und 400 &amp; mgr; l auf. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Embryonen für die Hybridisierung <ol><li> Sammeln, dechorionate, zu beheben, und devitellinize Embryonen Verwendung von Standardverfahren 14,18. Die hergestellten Embryonen werden routinemäßig in Methanol bei -20 ° C gelagert. </li><li> Transfer-Embryonen für die in situ Hybridisierung an RT verwendet werden, und in die Einsätze aus einem 12-Well-Platte mit 2 ml Methanol pro Vertiefung gefüllt zu verteilen. </li><li> Rehydrieren Embryonen durch eine abnehmende Methanol-Serie bei RT. Inkubieren Embryonen jeweils für 3 min in: (i) 75% Methanol in 1x PBS (ii) 50% Methanol in 1 × PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% Methanol in 1 × PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% Tween-20. </li><li> Pre-fix die Embryonen in 4% Paraformaldehyd in PBS 1x 20 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Fixiermittel von 4 Waschungen für 3 min in 1x PBS, 0,1% Tween-20 bei RT. Unterdessen tauen und bereiten Proteinase K und Glycin Arbeitslösungen. </li><li&gt; Permeabilisieren Embryonen in frisches Proteinase K (10 ug / ml bis 50 ug / ml) in 1 × PBS, 0,1% Tween-20 für 3 min bei RT. Anmerkung: Die Proteinase-K-Behandlung ausgeglichen zu der Stärke des Embryos Fixierung. Zum Beispiel, wenn die Pre-Fixierungsschritt (3.4) nicht angegeben wird, weicher Proteinase K-Behandlung angewendet werden kann. </li><li> Die Reaktion durch zwei 1 min Spülungen in 2 mg / ml Glycin in 1x PBS, 0,1% Tween-20 bei RT. </li><li> Post-fix die Embryonen in 4% Paraformaldehyd in PBS 1x 20 min bei RT. </li><li> Anschließend entfernen Para Fixiermittel durch viermaliges Waschen für 3 Minuten in 1X PBS, 0,1% Tween-20 bei Raumtemperatur. </li><li> Transfer nachfixiert Embryonen vor, eine Hybridisierungspuffer. Shop Embryonen in Pre-Hybridisierungspuffer bei -20 ° C oder direkt weiter mit Hybridisierung von Sonden. </li></ol> 4. Hybridisierung von Sonden <ol><li> Transfer-Embryonen bei -20 ° C in der Vor-Hybridisierungspuffer auf RT gelagert. Verteilen Embryonen in Pre-Hybridisierungspuffer in 2,0 ml microtubes. </li><li> Für 30 min bei einem Minimum, pre-hybridisiert Embryo Proben bei 65 ° C in vorgeHybridisierungsPuffer. Hinweis: Für die Vorhybridisierung und Hybridisierung Schritte a Wasserbad verwendet. Während Vorhybridisierung es Zeit ist, die Sondenmischung aus bis zu drei Antisense-RNA-Sonden, die jeweils spezifisch für ein unterschiedliches Gen-Transkript und mit einem anderen Hapten markierte vorzubereiten. </li><li> Um die Sondenmischung vollständig zu schneiden, zusammenpassenden Mengen (gewöhnlich zwischen 1 &amp; mgr; l 6 &amp; mgr; l) von jeder gewünschten Original Hapten-markierte Antisense-RNA-Sonde in 100 ul Hybridisierungspuffer (50% vol / vol entionisiertes Formamid, 5x SSC, 50 ug / ml Heparin-Natrium-Salz, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA, 5% Gewicht / Volumen Dextransulfat). Anmerkung: Die Zugabe von Dextransulfat ist optional. </li><li> Denaturierung der Antisense-RNA Sonden-Mix in einem Heizblock bei 80 ° C für 5 min. Des denaturierten Sondengemisch anschließend direkt übertragen auf 65 ° C. </li><li> Die meisten der Vorhybridisierung entfernenPuffer aus dem Embryo Proben und fügen Sie die denaturierte Sonde Mix. </li><li> Lassen Embryo Proben hybridisieren Mix O / N-Sonde bei 65 ° C. Anmerkung: Temperaturen zwischen 55 ° C und 65 ° C werden routinemäßig für die Hybridisierung, Pre- und Post-Hybridisierungsschritte verwendet. Hybridisierung bei 65 ° C liefert die meisten stringenten Bedingungen und wird im Fall von Hintergrundprobleme empfohlen, wenn niedrigere Temperaturen. Wenn es keine Hintergrundprobleme, die Hybridisierung bei 55 ° C empfohlen wird, was den Vorteil einer verbesserten Signalstärke und verbesserte Embryointegrität. </li><li> Am nächsten Morgen, zuerst die Stringenz Waschlösungen zu übertragen bis 65 ° C, um sicherzustellen, dass sie auf die richtige Temperatur in der Zeit erwärmt werden. </li><li> Transfer Hybridisierungssonde Mix mit Embryonen von den 2,0 ml Mikroröhrchen in die Einsätze aus einem 12-Well-Platte mit 2 ml vorgewärmten Hybridisierungswaschpuffer (50% Formamid in 2 × SSC, 0,1% Tween-20). Legen Sie die 12-Well-Platte mit dem embryo Proben in einem Ofen und Inkubation für 20 min bei 65 ° C. </li><li> Transfer-Embryo Proben 2 ml neuen Hybridisierungswaschpuffer und Inkubation für 20 min bei 65 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. </li><li> Entfernen der überschüssigen Sonde durch 20 minütiges Waschen bei 65 ° C, einmal in 2 × SSC, 0,1% Tween-20 und dreimal in 0,2 × SSC, 0,1% Tween-20. </li><li> Übertragen Sie die Embryo Proben auf PBS, 0,1% Tween-20 bei RT 1x. </li><li> Inkubieren der Embryonen in Blocking-Puffer (8% Schafserum in 1x PBS, 0,1% Tween-20) für mindestens 30 min bei RT. </li></ol> 5. Antikörper-Nachweis von Hapten-markierten Sonden Anmerkung: Im Gegensatz zu der gleichzeitigen Hybridisierung aller drei unterschiedlich markierten Sonden wird jede Sonde detektiert nacheinander in separaten Runden der Antikörper-Inkubation und Färbung. Daher wird in jedem Erfassungsrunde nur ein Antikörper verwendet wird (entweder anti-Digoxigenin-AP oder Anti-Fluorescein-AP oder Anti-Biotin-AP). <ol><li> Wählen Sie zwischen STEP5.1.1 bis 5.1.3 und fahren Sie mit der Vorbereitung der entsprechenden Antikörperverdünnung nach dem Hapten-Label, das nachgewiesen werden soll. Anmerkung: Für sequentielle Detektion der verschieden markierten Sonden wird eine weitere Anti-Hapten-Antikörper, der in jedem Erfassungszyklus aufgetragen. <ol><li> Zur Erfassung eines Fluorescein-markierten Sonde verdünnter Anti-Fluorescein-AP-Konjugate 1: 4000 in Blockierungspuffer. </li><li> Zum Nachweis einer mit Digoxigenin markierten Sonde verdünnter Anti-Digoxigenin-AP-Konjugate 1: 4000 in Blockierungspuffer. </li><li> Zum Nachweis von Biotin-markierten Sonde herzustellen einen Anti-Biotin-AP-Konjugat-Lösung bei einer 1: 4000 Verdünnung in Blockierungspuffer. </li></ol></li><li> Inkubieren Embryonen in der gewählten anti-Hapten-AP-Lösung für 3 bis 4 h bei RT. Alternativ inkubieren O / N bei 4 ° C. Nicht alle drei Antikörper gleichzeitig anzuwenden. </li><li> Um ungebundene Antikörper zu entfernen Waschen der Embryos mit 1x PBS, 0,1% Tween-20 für 4-mal 15 min bei RT. </li><li> Um Puffersysteme zu ändern war,h zweimal 15 min bei RT in TNT (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Tween-20). </li></ol> 6. Alkalische Phosphatase Chromogenic Färbung <ol><li> Im Anschluss an den Antikörpernachweis wählen zwischen STEP 6.1.1 bis 6.1.4 und fahren Sie mit einer der alkalische Phosphatase chromogene Färbung Reaktionen auf die gewünschte Farbsignal zu erhalten (siehe Tabelle 1). Für jede Runde des Detektions eine andere chromogene Substrat-Reaktion angewandt wird, um jedes Transkript-Muster in einer anderen Farbe zu markieren. <ol><li> Fast Red-Färbung <ol><li> Zweimal für 15 min in TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% Tween-20), waschen Embryonen. </li><li> Beim Waschen Embryonen, bereiten Sie die Fast Red Färbelösung von der Fast Red TR / NAMP Alkaline Phosphatase Substrattabletten Set. </li><li> Löse eine Puffertablette aus der Tablette in 1 ml destilliertem Wasser eingestellt und vortexen bis 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 erhalten. </li><li> Werfen Sie einen Fast Red TR / NAMP Tablette in die vorbereitete Tris Puffer und lösen sich durch Vortexen, um die Fast Red-Färbung Lösung zu erhalten. </li><li> Klare Fast Red Färbelösung von nichtgelösten Partikeln durch einen 0,2 &amp; mgr; m Spritzenfilter filtriert. </li></ol></li><li> Schnell-Blau-Färbung <ol><li> Waschen Embryos zweimal für 15 Minuten in frischem SB8.2 Färbepuffer (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl 2, 0,1% Tween-20). </li><li> Beim Waschen Embryonen, bereiten Sie die Fast Blue Färbelösung von 50 mg / ml Fast Blue BB (in DMF) und 50 mg / ml Naphtholphosphat (in DMSO) Stammlösungen. </li><li> Frisch bereiten Fast Blue BB-Lösung bei 0,5 mg / ml in SB8.2. </li><li> Frisch bereiten Sie eine separate naphthol Phosphatlösung bei 0,5 mg / ml in SB8.2. </li><li> Tropfenweise hinzufügen, die vorbereitete naphthol Phosphatlösung in die Fast Blue BB-Lösung unter ständiger Durchmischung mit einem Wirbel. Die resultierende endgültige Arbeitskonzentration von 0,25 mg / ml für die beiden Substratkomponenten. Hinweis: Verschiedene Fast Blue / naphthol phospHass Kombinationen zu verschiedenen Farbtönen (siehe Tabelle 1). </li></ol></li><li> BCIP / NBT-Färbung <ol><li> Waschen Embryos zweimal für 15 Minuten in frischem SB9.5 Färbepuffer (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl 2, 0,1% Tween-20). </li><li> Für eine purpleblue chromogenen Signals, frisch vorbereiten BCIP / NBT-Färbung Lösung durch Zugabe von 1 ul Levamisol, 3,5 ul BCIP und 4,5 ul NBT pro ml SB9.5 Färbepuffer und gut mischen. </li></ol></li><li> INT Färbung <ol><li> Zweimal für 15 Minuten in frischem SB9.5 Färbepuffer Waschen Sie die Embryonen. </li><li> Für eine gelbbraun chromogenen Signals, frisch vorbereiten INT Färbungslösung durch Zugabe von 1 &amp; mgr; l Levamisol, 5 ul Magenta-Phos und 5 ul INT pro ml SB9.5 Färbepuffer und gut mischen. Hinweis: Alternativ können Sie 7,5 ul / ml BCIP / INT ready-to-use-Färbelösung. </li></ol></li></ol></li><li> Für die Farbreaktion Transfer-Embryo Probenauf eine 24-Well-Platte. Inkubieren jeder Probe in 400 ul des ausgewählten Färbungslösung im Dunkeln. </li><li> Überwachen Sie gelegentlich Signalentwicklung unter einem Stereomikroskop. Stoppen Sie die Farbreaktion, wenn die gewünschte Signalstärke erreicht ist und bevor eine signifikante Hintergrundsignal beobachtet wird. </li><li> Um die Farbreaktion zu stoppen, zu übertragen gefärbten Embryonen in Einsätzen aus einem 12-Well-Platte mit 2 ml TNT pro Vertiefung. Zweimal spülen Sie den gefärbten Embryonen in TNT. </li><li> Zweimal Waschen Sie die Embryonen für 10 Minuten in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bei RT an Restsubstrat zu entfernen. </li></ol> 7. Antikörperentfernung / Alkalische Phosphatase-Inaktivierung <ol><li> Entfernen Antikörper und Inaktivierung der alkalischen Phosphatase durch Inkubation in 2 ml niedrigen pH-Stopplösung (0,1 M Glycin-HCl pH 2,2, 0,1% Tween-20) für 10 min bei RT. </li><li> Spülen für 1 Minute mit 2 ml 1 × PBS, 0,1% Tween-20 bei Raumtemperatur. </li><li> 3x waschen für 3 Minuten in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bei Raumtemperatur. </li></ol> 8. zweiten Erfassungs Runde <ol><li> Um das Verteilungsmuster eines zweiten Transkripts erkennen füllen Antikörper-Nachweis von Hapten-markierten Sonden (Schritt 5.1 bis 5.4) unter Verwendung von Antikörper-AP-Konjugate gegen das zweite Hapten Zeichens ausgerichtet. </li><li> Zuführen chromogenen alkalische Phosphatase-Färbung (SCHRITT 6.1 bis 6.5) Aufbringen einer Substrat-Kombination, die eine Kontrastfarbe zu der in dem ersten Erfassungsrunde verwendet wird, erzeugt (Farbauswahl siehe Tabelle 1). </li><li> Entfernen zweiten Antikörper-AP-Konjugat, wie in STEP 7.1 bis 7.3 beschrieben. </li></ol> 9. dritte Erfassungs Runde <ol><li> Um das Verteilungsmuster eines dritten Transkripts erkennt, gehen mit Antikörper-Nachweis von Hapten-markierten Sonden (Schritt 5.1 bis 5.4) unter Verwendung von Antikörper-AP-Konjugate, die für das dritte Hapten-Markierung. </li><li> Zuführen chromogenen alkalische Phosphatase-Färbung (SCHRITT 6.1 bis 6.5) Aufbringen einer Substrat-Kombination, die keine AP warin den vorherigen Runden Erkennung versorgt. Wählen Sie eine Farbreaktion, die eine Farbe zu fällen leicht von denen der vorangegangenen zwei Detektionsrunden unterscheiden produziert (für Farbenwahl siehe Tabelle 1). </li></ol> 10. Montage und Imaging <ol><li> Übertragung richtig gefärbten Embryonen bis 30% Glycerin in PBS und Inkubation bis Embryonen sind vollständig in die Glycerinlösung eingetaucht. Sie sind gut ins Gleichgewicht gebracht, wenn sie auf den Boden sinken. </li><li> Transferembryos bis 70% Glycerin in H 2 O und equilibrieren lassen bei RT. Die gefärbten Embryonen können in 70% Glyzerin bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Für die Befestigung, Pipetten gefärbten Embryonen in einer 70% Glycerin Tröpfchens auf einem Objektträger und ohne Berührung der Abstandshalter mit dem Schlitten (3) aufgeklebt. Wenden Sie das Deckglas. </li><li> Montiert anzeigen Embryonen unter einem Binokular. Bewegen Sie das Deckglas aufgebracht, so dass die Embryonen zu drehen, um die gewünschte Ausrichtung. </li><li> Richtig beobachtenorientierte Embryonen bei hoher Auflösung (20X, 40X Ziele) im Rahmen eines zusammengesetzten Mikroskop mit Differentieller Interferenzkontrast-Optik. </li><li> Machen Sie Bilder mit einer digitalen Farbkamera und sparen Sie die digitale Speichereinheit. </li></ol>

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J., Johnson, G. D., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase-fast+red,+a+new+fluorescent+label.+Application+in+double+labelling+for+cell+cycle+analysis.">Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis.</a> J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alkaline+phosphatase-mediated+azo+dye+staining+for+dual+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish.">Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In situ-Hybridisierung (ISH) mit radioaktiv markierten Nukleinsäuresonden wird oft verwendet, um die Lokalisierung von RNA an Gewebeschnitten zu detektieren. Die radioaktiven ISH-Verfahren ist jedoch zeitaufwendig, weniger empfindlich, und nicht Aufwertung komplette Transkript Verteilungsmuster ganz-Halterungen ermöglichen. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier beschriebene MC-WISH Verfahren den direkten Vergleich der multiplen Genexpression Domänen in kontrastierenden Farben in intakten Embryonen. MC-WISH hat den Vorteil, dass die histologische Kontext sofort ersichtlich und einfach durch Standard-Hellfeldmikroskopie visualisiert. Dies bietet die Möglichkeit, die Genexpression Domänen topographisch zueinander mit hoher Genauigkeit zu beziehen und festlegen einzigartige und überlappenden Expressionsstellen in einer schnellen und zuverlässigen Art und Weise. Auf der anderen Seite, ist Multiplex-Fluoreszenz ISH (FISH) leistungsfähiger in Bezug auf Empfindlichkeit und Auflösung und wird bevorzugt verwendet, wenn zelluläre oder subzelluläre WiederLösung von mRNA-Nachweis erforderlich ist. Das breite Spektrum von Transkripten, die durch MC-WISH kartiert wurde legt nahe, dass praktisch jedes Transkript kann nicht nur in der embryonalen als auch in Larven und erwachsene Gewebe und in anderen als Drosophila-Arten analysiert werden. Tatsächlich ist die beschriebene Vorgehensweise für Drosophila hier detailliert, funktioniert ähnlich effizient mit Zebrafischembryonen 11,16,22. Darüber hinaus kann der MC-WISH Methode, um eine Vielzahl von Wirbellosen und Wirbeltierembryonen und Gewebeprobe angepasst werden. Hapten-Etiketten und Sondenkonzentrationen Wir verwenden routinemäßig Fluorescein, Digoxigenin und Biotin als Hapten-Markierungen von RNA-Sonden. Außerdem Dinitrophenol-markierte Sonden können verwendet werden, die im Zebrafisch WISH Experimente 23-25 ​​eingeführt wurden. Fluorescein-markierten Sonden zeigen eine geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu den anderen Hapten-Etiketten, so dass Fluorescein wird am besten verwendet foder den Nachweis von reichlich vorhandenen Transkripte. Jeder neu transkribierten Sonde wird zunächst in einem einzigen WISH Versuchs, in dem seine Leistung wird entweder unter Verwendung von BCIP / NBT oder Fast Red als Substrat bewertet getestet. Eine Sonde Konzentration wird als optimal betrachtet werden, wenn ein starkes Signal, ohne Hintergrundentwicklung wird im Minuten bis wenigen Stunden erreicht. Um sicherzustellen, dass die Expressionsdomänen von Interesse haben, in vollem Umfang von MC-WISH erfasst wurde, ist es wichtig, jedes Transkript Muster von einzelnen Bezeichnung WISH Experimente unter Verwendung der empfindlichsten Substrat-Kombination, BCIP / NBT zu visualisieren. Dies stellt sicher, dass eine schwache Expression Domänen sind nicht in der Multi-Target-Experiment übersehen. Um sich für die geringere Empfindlichkeit der anderen Substrat-Kombinationen zu kompensieren ist es wichtig, verdoppelt Gebrauch (bis zu verdreifacht) Sondenkonzentrationen im Vergleich zu Standard-BCIP / NBT-Färbung. Niedrigen pH-Inaktivierung Der niedrige pH Inaktivierungsschritt kann dazu führen,partielle Auflösung der Antisense haptenmarkierte RNA Sonde / Sense-mRNA-Hybride, was zu reduzierten Signalerfassung in dem zweiten und dritten Färbung Runden. Zu einem Verlust der Empfindlichkeit zu minimieren, sind die Inaktivierungsschritte so kurz wie möglich. Wir erlebten, dass ein 10 Minuten Inkubationszeit bei niedrigem pH-Wert reicht für Beseitigung der AP-Aktivität. Die anschließenden schnellen Waschungen in großen Stückzahlen sorgen für eine schnelle Verdünnung der ungebundenen Antikörper-AP-Konjugate und re-Bindung an die haptenisierte Sonden zu verhindern. Alternative Verfahren umfassen Para Fixierung und Hitze-Inaktivierung. Allerdings sind einige der Farb Niederschläge sind nicht hitzestabil und Paraformaldehyd Fixierung kann nicht ausreichend für die vollständige Inaktivierung der AP ist. Unvollständigen Inaktivierung der ersten aufgebrachten Antikörper-AP-Konjugat kann neu Visualisierung der mRNA-Muster in der folgenden Erkennungsrunde zu falsch positiven Überdeckung führt im Ausdruck mit der zweiten mRNA-Spezies zu erfassende führen. Daher wird in einem Kontrollexperiment the Embryonen nach der Inaktivierung der ersten aufgebrachten Antikörper-AP-Konjugat in zwei Fraktionen aufgeteilt. Der zweite Antikörper-AP-Konjugat wird von dem Kontrollfraktion weggelassen und sollte ein Signal in dem zweiten Farbreaktion nicht zu erzeugen. Wenn die zweite Farbreaktion erzeugt eine Signalverteilungsmuster entsprechend dem ersten, dann war jedoch die Inaktivierungsverfahren nicht effizient. In diesem Fall sollte die Inkubationszeit in niedrigen pH-Stop-Lösung für den nächsten Versuch verlängert werden. Bestellungen von AP-Substrat-Anwendung Da die Empfindlichkeit sinkt mit jeder weiteren Runde der Erkennung, ist es ratsam, weniger reichlich mRNAs vor reichlicher Transkripte nachzuweisen. Darüber hinaus ist die Fast Red und Fast Blue Substratkombinationen wesentlich weniger empfindlich als die purpleblue BCIP / NBT-Färbung, so dass schnelle Farbstoffe werden vorzugsweise in der ersten Runde Färbung zum Nachweis der stärker exprimiert Transkript aufgetragen. Dies auch hals Vorteil, dass anschließende BCIP / NBT-Färbung überwacht und gestoppt rechtzeitig vor purpleblue Signal wird zu dunkel im Hinblick auf die leichtere schnelle Farbstoffe werden. So ist in einer Standard-Zweifarbenexperiment erste desto stärker exprimierten mRNA wird von Fast Red erkannt und zweiten der Schwächere von BCIP / NBT. Als Alternative, um die schnelle Farbstoffe die gelben INT Substrat-Kombinationen angewendet werden können, die jedoch Präzipitate werden, nachdem einige Zeit diffundieren zu erzeugen. Daher BCIP / INT wird ausschließlich in der letzten Runde Färbung aufgetragen. Somit in einer Drei-Farben-Experiment, das wir verwenden oft ersten Fast Red, zweiten BCIP / NBT (oder Fast Blue) und der dritte ein INT-Substrat-Kombination. Man beachte, dass es ratsam ist, um Bunt Embryonen so schnell wie möglich zu fotografieren beim Aufbringen INT. Fluoreszenzdetektion von Azofarbstoffen Es kann manchmal schwierig sein, sich überlappenden Expressionsmuster zu erkennen, wenn eine dunklere Farbe Niederschlag wird Spiegeln einer leichteren. Foder kann beispielsweise ein stark entwickelt BCIP / NBT Niederschlag leichter Schnelle Farbsignale zu maskieren. Eine Möglichkeit, um dieses Problem zu erhalten ist, Bilder nach jeder Färbung sofort erfassen und entfernen Sie das angewandte Farbniederschlag vor der nächsten Erkennung Runde. In diesem Fall sind alkohollösliche Azofarbstoff (Fast Red) und INT Niederschläge mit Ethanol wäscht, nachdem die ersten und zweiten Erfassungs Runden entfernt sind und BCIP / NBT-Färbung wird als letzter AP-Substrat 26 aufgebracht. Eine andere Möglichkeit ist, den Vorteil der Fluoreszenz-Eigenschaften von Azofarbstoffen zu nehmen. Fast Red kann mit Rhodamin-Filter visualisiert setzt 27 werden, während Fast Blue kann mit weit Rotfilter 28,29 beobachtet werden. Vergleichs- bzw. Überlagerung von chromogenen und Fluoreszenzbilder kann die Seite des Zusammen distribution.Using dieses Ansatzes BCIP / NBT Signalentwicklungs offenbaren muss rechtzeitig gestoppt werden kann, so dass es nicht zu dicht werden und Quench des Fluoreszenzsignals des Azofarbstoffes Reaktionsprodukt.

In situ-Hybridisierung (ISH) ist das Standardverfahren zur Detektion und Lokalisierung von RNA-Transkripten in morphologischer Zusammenhang innerhalb von Zellen, Geweben und Organismen. 1 Die von der ISH Verfahren erzeugten Signale werden häufig von radioaktiven, fluoreszierenden und chromogenen Detektionssysteme visualisiert. In den letzten Jahren erhebliche technologische Fortschritte in Fluoreszenz ISH (FISH) 2 führte dramatisch verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung, was den Nachweis und die Quantifizierung von RNA-Expression auf Einzelzell und subzellulären Ebenen und RNA Visualisierung bis zu einzelnen Molekülen 3,4 .While anspruchsvolle Einzelmolekül FISH Methoden für mehr spezialisierte Anwendungen verwendet werden, ist chromogenen ISH verbreitet als eine Routine-RNA in situ Nachweisverfahren in der Forschung und der klinischen Diagnostik. Für chromogenen Nachweisenzym Fällungsreaktionen verwendet werden, die sichtbare Produkte in kontrastierenden Farben an den Standorten zu generierenHybridisierungs 5. Dies hat den Vorteil, dass RNA Visualisierung kann mit Routine histologischen Färbungen und morphologischer Zusammenhang kombinierbar ist durch Standardhellfeldmikroskopie unmittelbar ersichtlich. Darüber hinaus sind zahlreiche der aufgetragenen Farbsubstraten Ausscheidungen, die in der organischen und / oder wässrigen Medien stabil sind Montage, so dass eine permanente Probenzubereitungen erhalten werden 5. Bei Drosophila angewendet Anfangs ISH Protokolle Radioisotop markierten Sonden für Transkript Erkennung auf geschnittene Material 6. Während es schwierig ist, aus Gewebeschnitten rekonstruieren vollständige Transkript Muster der gesamten Embryos oder Organsysteme, das die Anwendung von chromogenen ISH Verfahren mit nicht-radioaktiv markierte Sonden ermöglicht es, global zu erfassen RNA Verteilungen in Voll Halterungen 7. Obwohl viele Variationen von chromogenen ISH vorhanden sind, in typischer ganze-mount in situ Hybridisierung (WISH) Protokolle hybridized haptenmarkierte Sonden durch Anti-Hapten-Antikörper mit einem Reporterenzym konjugiert ist und der mRNA-Transkripte werden durch ein Fällungs Chromogen visualisiert detektiert. Die Palette von unterschiedlich gefärbten Niederschläge durch das Reportergen produzierten Enzyme alkalische Phosphatase (AP), Meerrettich-Peroxidase (POD) und beta-Galactosidase (GAL) ermöglicht die Unterscheidungs ​​Nachweis mehrerer Ziele in ein und derselben Probe 8-14. Dauert jedoch POD enzymatische Aktivität nur für eine begrenzte Zeitdauer und die GAL kolorimetrischen Reaktion ist etwas weniger empfindlich ist, so dass ohne zusätzliche (Tyramid) Signalverstärkung 15 die Detektion von weniger häufigen Transkripte kann schwierig mit diesen Enzymen können. Im Gegensatz dazu die dauerhafte Aktivität von AP ermöglicht dauerhafte Substratumsatz und hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Daher Sequenzerkennung mit AP Reporter-Enzym mit unterschiedlich gefärbten Substrate in der effektiven bewährt undunverwechselbare Detektion von bis zu drei verschiedene Transkripte in einzelnen Embryonen 10-12,16. Aus diesem Multi-Target-chromogenen WISH (MC-WISH) Methode (Abbildung 1) 14, werden markierte Antisense-RNA-Sonden durch in vitro Transkription erzeugt und mit einer der verfügbaren Hapten-Etiketten gekennzeichnet. Embryos sind Formaldehyd fixiert und durch Methanolbehandlung und Proteinase K Verdau permeabilisiert. Hybridisierung von Embryonen wird gleichzeitig mit bis zu drei unterschiedlich markierten Antisense-RNA-Sonden jeweils spezifisch für ein unterschiedliches Gen durchgeführt. Nach dem Entfernen der ungebundenen Sonde durch Stringenz Wäschen jeweils Hapten-Etikett wird in einem separaten Runde der Detektion visualisiert. Eine einzelne Erfassungs Runde besteht aus der Inkubation von Embryonen mit einem Anti-Hapten-Antikörpers an AP und RNA Visualisierung durch Anlegen eines AP-Substrat, das eine lokalisierte stabile Farb Präzipitat produziert gekoppelt. Nach der Antikörpererkennung und Färbung, die aufgetragene Antikörper-AP conjuGate wird durch einen niedrigen pH-Wäsche entfernt. Beim Mehrfarben Experimenten verwendet jede Runde der Detektion eines Antikörpers gegen ein anderes Hapten-Etikett gezielt und jedes Transkript Muster durch eine unterschiedliche Farbe Substrat (Tabelle 1) visualisiert. Die Embryonen werden in Glycerin montiert und unter einem hochauflösenden Mikroskop Verbindung mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) Optik abgebildet.

<table><tbody><tr><td>Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-free&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTP Set</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-12-UTP</td><td>Roche</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolute&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium citrate</td><td>Scharlau</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>deionized formamide</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>RNA type VI from torula yeast</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-biotin-AP Fab fragments&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody</td><td>Vector laboratories</td><td>MB-3100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Scharlau</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Applichem</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red tablet set</td><td>Sigma</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>Fast Blue BB salt</td><td>Sigma</td><td>F3378</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-MX-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N5000</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-GR-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N3625</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-BI-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N2250</td><td></td></tr><tr><td>Magenta-Phos</td><td>Biosynth</td><td>B7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>INT/BCIP solution</td><td>Roche</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 86-88%</td><td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>Universal incubator</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Grant</td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&amp;nbsp; inserts 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Netwell carrier kit 15 mm</td><td>Corning</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos

Zu analysieren Genregulationsnetzwerken während der embryonalen Entwicklung und der Organogenese ist es wichtig, genau zu bestimmen, wie die verschiedenen Gene werden in räumlicher Beziehung zueinander in situ exprimiert aktiv. Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) erleichtert die sofortige Vergleich der Genexpressionsmuster, da es markante Darstellung der verschiedenen mRNA-Spezies in kontrastierenden Farben in der gleichen Probe Probe. Dies bietet die Möglichkeit, die Genexpression Domänen topographisch zueinander mit hoher Genauigkeit zu beziehen und um einzigartige und überlappenden Expressionsstellen definieren. In der vorgestellten Protokoll beschreiben wir eine MC-WISH Verfahren zum Vergleich der mRNA-Expressionsmuster verschiedener Gene in Drosophila-Embryos. Bis zu drei RNA-Sonden, die jeweils spezifisch für ein anderes Gen von einem anderen Hapten markiert ist, gleichzeitig hybridisierten, um den Embryo Proben und anschließend durch alkalische detektiertenne Phosphatase-basierten colorimetrischen Immunhistochemie. Die beschriebene Vorgehensweise ist hier für Drosophila beschrieben, funktioniert aber genauso gut mit Zebrafischembryonen.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Darstellung mehrerer Transkript Muster in verschiedenen Farben. MC-WISH hat den Vorteil, direkt zu vergleichen die Expressionsmuster verschiedener Gene in der gleichen Embryos. Als ein Beispiel, die Expressionsmuster von leeren Stigmen (ems) 19, fushi tarazu (FTZ) 20 und schlampig gepaart 1 (slp1) 21 werden direkt in Drosophila melanogaster Blastodermstadium Embryonen verglichen und in einer Vielzahl von Farbnuancen sichtbar gemacht (Abbildung 4) . Verschiedene AP-Substrat-Kombinationen stehen zur Verfügung, um eine Platte von den Vereinsfarben Niederschläge (Tabelle 1) zu erhalten. Die von Fast Red und dem von BCIP / NBT produziert lila Niederschlag produziert rote Farbe Niederschlag kann leicht unterschieden werden und werden daher verwendet häufigstenly in Zweifarbenexperimenten (4A). Allerdings kann die BCIP / NBT-Färbung schnell in eine eher dunkle Farbe zu drehen, so dass der Fast Red Farbe wird bei Teil Co-Verteilung der Transkripte verkleidet. Daher kann die Anwendung von Fast Blue von Vorteil, die blau, grün und violett Produkte in Kombination mit NAMP, NAGP und NABP (Tabelle 1) erzeugt. Die Kombination von Fast Blue mit NAMP gibt eine hellblaue Farbe, die von der Fast Red Produkt in benachbarten oder überlappenden Expressionsdomänen leicht erkennbar ist, wie hier für ems und slp1 Expressionsstellen in rot und blau, jeweils visualisiert (4B) gezeigt. Die Fast Blue NAGP Kombination bietet eine ähnliche starke Gegensatz zum Fast Red-Färbung, so dass die grüne ems Domain ist klar von der markanten roten slp1 Expressionsstelle (4C). Allerdings, wenn ems und slp1 Expressionsstellen sind dedurch Fast Blue NABP und Fast Red geschützt jeweils die resultierende violette und rote Farbe Niederschläge sind weniger wahrnehmbar (4D). Wie oben erwähnt, Fast Red und Fast Blue NAGP sind leicht zu unterscheiden, wie durch slp1 und FTZ-Expression in rot und grün, jeweils (4D) gezeigt. MagentaPhos in Kombination mit INT erzeugt ein gelber Niederschlag, der verwendet wird, um die segmentale Expression FTZ (4C, E) offenbaren. Die gelbe Niederschlag erzeugt guten Kontrast zu den blau gefärbten Substraten, wie durch den Nachweis von slp1 und FTZ mit Fast Blue NAMP und MAG / INT bzw. (4E) veranschaulicht. Ist der gelbe Niederschlag jedoch weniger leicht erkennbar aus der Fast Red Produkt. Die gelb gefärbten Ausdruck Domäne von ems kaum disti sein<html> von der rostral Ausdruck slp1 in rot (4F) gezeigt nguished. Daher weist die Kombination aus Farbe Substrate sorgfältig für jedes Experiment ausgewählt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> Abbildung 1. Flussdiagramm der MC-WISH. Für mehrfarbige Darstellung von drei einzigartigen Transkript Mustern, zwischen verschiedenen Antikörper-AP-Konjugate und Farbe Substrat-Kombinationen in jedem Erfassungszyklus zu wählen. Abkürzungen: AP, alkalische Phosphatase; BIO, Biotin; DIG, Digoxigenin; FLUO, Fluorescein. Für anderer Abkürzungen siehe Legenden auf Figur 4 und Tabelle 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> s / ftp_upload / 53.830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Einsätze als Embryo Träger. (A) Einsätze an der Unterseite mit Polyestermembranen von 15 mm Durchmesser und 74 um Maschenweite ausgestattet sind, wie Drosophila-Embryo Träger verwendet. (B) Die Einsätze werden in 12-Well-Platten, die als Vorratsfächern für die verschiedenen Lösungen funktionieren montiert. (C) erhältlich Träger und Griffe ermöglichen die Verarbeitung von (D) 12 Einsätze / Embryo Proben gleichzeitig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> Figur 3. Montage von gefärbten Embryonen. Die Embryonen werden in einen Tropfen von 70% igem Glycerin zwischen zwei Stapel von Deckplättchen, die als Abstandshalter fungieren montiert. Sanfte Bewegung des Applogen großen Deckglas hilft, die montiert Embryonen in die gewünschte Ausrichtung für die Beobachtung und Fotografie zu drehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> Abbildung 4. Multicolor Visualisierung der mRNA-Transkripte in Drosophila-Embryos. Beispiele für MC-WISH Versuche in Drosophila Embryonen von Seitenansichten gezeigt. Die mRNA-Expressionsmuster von leeren Stigmen (ems), fushi tarazu (FTZ) und schlampig gepaarten 1 (slp1) werden durch unterschiedliche Farb AP Substrat-Kombinationen, die auf jeder Platte angegeben werden visualisiert. Transkripte wurden durch (A) FTZ FLUO und ems DIG, (detektiert <strong&gt; B) SLP1 FLUO, ems BIO und FTZ DIG, (C) ems BIO, SLP1 FLUO und FTZ DIG, (D) FTZ BIO, SLP1 FLUO und ems DIG, (E) slp1 FLUO, ems DIG und FTZ BIO, (F) FTZ BIO, SLP1 FLUO und ems DIG markierten Sonden. Das Hapten-markierten Sonden wurden immunhistochemisch nacheinander in den aufgelisteten Befehle. Abkürzungen: FB Fast Blue; FR, Fast Red Tablette. Für anderer Abkürzungen siehe Legende zu Abbildung 1 und Tabelle 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Substrat-Kombination </td><td> In den 1 ml AP-Puffer </td><td> Concentration [pg / ml] </td><td> AP-Puffer </td><td> Farbe </td><td> Signalempfindlichkeit </td></tr><tr><td> BCIP NBT </td><td> 3,5 &amp; mgr; l 4,5 &amp; mgr; </td><td> 175 337,5 </td><td> SB9.5 </td><td> lila </td><td> +++ </td></tr><tr><td> MAG INT </td><td> 5 ul 5 ul </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> gelb </td><td> + </td></tr><tr><td> BCIP / INT-Stammlösung </td><td> 7,5 ul </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> gelb </td><td> + </td></tr><tr><td> Fast Blue NAMP </td><td> 5 ul 5 ul </td><td> 250 250 </td><td> SB8.2 </td><td> blau </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Fast Blue NABP </td><td> 20 &amp; mgr; l 10 &amp; mgr; </td><td> 1.000 500 </td><td> SB8.2 </td><td> violett </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Fast Blue NAGP </td><td> 10 &amp; mgr; l 10 &amp; mgr; </td><td> 500 500 </td><td> TT8.2 </td><td> grün </td><td> + </td></tr><tr><td> Fast Red NAMP </td><td> 1 Tablette </td><td> 1.000 400 </td><td> TT8.2 </td><td> rot </td><td> ++ </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Substrat-Kombinationen Abkürzungen: +++, stark;. ++, Medium; +, Schwache NBT, 4-Nitro-blau-Tetrazoliumchlorid; BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat; INT, 2- (4-Jodphenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-tetrazoliumchlorid; MAG, Magenta-Phos, 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-phosphat, NAMP, Naphthol-AS-MX-Phosphat; NABP, Naphthol-AS-BI-Phosphat; NAGP, Naphthol-AS-GR-Phosphat; SB9.5, Färbung bei pH 9,5; SB8.2, Färbung bei pH 8,2; TT8.2, Tris-Tween-Puffer bei pH 8,2.

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Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

multi-target-chromogenic-whole-mount-situ-hybridization-for-comparing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

11.4K Aufrufe.  Stockholm University.  Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge. 

Serie: Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Forschung

Genetik

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologie

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Entwicklungsbiologie

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount

Zusammenfassung

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