This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

<ol><li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+stalling+at+natural+impediments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li>
<li>Gupta, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+complexes+are+the+primary+sources+of+replication+fork+pausing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).</li>
<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+fork+dynamics+in+Escherichia+coli+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).</li>
<li>Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+stalling+and+cell+cycle+arrest+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).</li>
<li>Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+replication+reduces+RecA-mediated+repair+of+UV-damaged+plasmids+introduced+into+competent+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli.</a> Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).</li>
<li>Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ruvA+and+ruvB+mutants+specifically+impaired+for+replication+fork+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal.</a> Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).</li>
<li>Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+Escherichia+coli+chromosome+arms+locate+to+separate+cell+halves%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves.</a> Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).</li>
<li>Lau, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+replicating+Escherichia+coli+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes.</a> Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).</li>
<li>Gordon, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+and+low+copy+plasmid+segregation+in+E.+coli%3A+visual+evidence+for+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms.</a> Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).</li>
<li>Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+controlled+Escherichia+coli+replication+fork+stalling+and+restart+at+repressor-bound+DNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo.</a> EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).</li>
<li>Payne, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+blockage+by+transcription+factor-DNA+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+replication+origins+on+ARS+plasmids+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae.</a> Cell. 51 (3), 463-471 (1987).</li>
<li>Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+UV-induced+replication+intermediates+in+E.+coli+using+two-dimensional+agarose-gel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+replication+fork+regression+and+processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli.</a> Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).</li>
<li>Mettrick, K. A., Grainge, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+blocked+replication+forks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of blocked replication forks in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Church, G. M., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).</li>
<li>Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li>
<li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li>
<li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li>
<li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li>
<li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli%3A+mechanism+and+genetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most common impediment to replisomes in living cells is a nucleoprotein block2. However, two longstanding difficulties in studying the collision of a replisome with a nucleoprotein blockage have been how to localize the event to a known position on the chromosome and how to make the event frequent enough to allow detailed analysis. The majority of the knowledge of how E. coli copes with stalled/collapsed replication forks comes from the use of UV as a DNA damaging agent. 
The FROS protocol described here is a novel way of creating a site-specific nucleoprotein roadblock, similar to what the replisome will meet when it encounters proteins tightly bound to the chromosome during replication. The induced blockage and controlled release of this block allows the stages of DNA processing to be studied in discrete steps. The array of tetO sites used to block replication has previously been utilized to visualize chromosome organization9,10. While the array can be placed anywhere in the chromosome, for the purpose of the array described here, it should be distant from both the origin and the terminus to avoid complications in interpreting the signals observed from second rounds of initiation at the origin or from the replication fork proceeding around the opposite replichore. By optimizing the overproduction of TetR with the use of the dilute complex medium (protocol 1), we have found that sufficient TetR is produced to create a complete replication blockage that is stably maintained, while limiting the number of new rounds of replication that are initiated. The incorporation of replisome temperature sensitive mutations22 into the system ensures all replisomes are deactivated simultaneously and uncontrolled replisome reloading is prevented.
Whilst the number of foci per cell are useful for knowing the cell's replication status, the most enlightening data for DNA repair is from the analysis of the replication intermediates revealed by 2-D gel electrophoresis during an active replication blockage. Analysis of different genetic backgrounds can identify proteins involved in processing and restart of collapsed replication forks by the different patterns observed following the 2-D gel protocol. Further, intermediates from the processing of collapsed replication forks can be present at the array region or in the DNA upstream of the array, and can be visualized using 2-D gel electrophoresis. Creating duplicate agarose plugs (Protocol 3) has the advantage of allowing for digestion of the same sample with different restriction enzymes to be able to visualize replication intermediates in successive DNA regions. Therefore, the array region should be located in a position where appropriate restriction enzymes can be used to probe these regions of interest using Southern hybridization. 
The most common reasons that this technique may be unsuccessful are having either too little DNA which produces faint signals compared to background, or incomplete digestion of the DNA within the plugs. This can be caused by having too much DNA in the agarose plugs or the carry-over of some inhibitor from the lysis/washing steps. The number of cells taken for lysis within the agarose plugs may need to be varied from the protocol described here if modifications such as growth media are changed. However, it is futile to continue with the hybridization if the DNA in the plugs has not digested to completion. A repeat treatment of ESP may be required to better prepare the DNA (protocol 3.6). 
If the replication intermediates that are of interest are only transient, or are particularly rare within the cell, the DNA sample may need to be enriched for them, for example with the use of BND-cellulose which will bind short stretches of single stranded DNA, such as those found in replicating chromosomes23. Stabilization of replication intermediates by crosslinking with psoralen has also been used as a method of preserving DNA integrity24. When the intermediates are rare, it is important to optimize the probe and blocking of the membrane to prevent background signals from interfering. On completion of the blots the signals may be quantified with appropriate image processing software.
The protocol described here is an optimized system for creating a site-specific nucleoprotein blockage and analyzing replication intermediates when the replisome is unable to proceed through the blockage. With the establishment and optimization of this technique, the roles of various helicases and recombination proteins in processing the replication fork and in allowing the restart of replication can be identified. By varying the genetic background, the effect of the absence of these proteins can be analyzed. However, this technique is limited by requiring not only viable strains but strains that are also able to overproduce TetR at a rate that will create a stable nucleoprotein blockage.

خلال تكرار الحمض النووي، وجسيم مكرر يواجه عقبات على الحمض النووي التي تعيق تقدمه. الحمض النووي من التلف بما في ذلك الآفات والثغرات فضلا عن الهياكل الشاذة يمكن أن تمنع جسيم مكرر من المضي 1. في الآونة الأخيرة، فقد وجد أن البروتينات منضمة إلى الحمض النووي هي المصدر الأكثر شيوعا للإعاقة على النسخ المتماثل تطور شوكة 2. معرفة الأحداث التي أعقبت لقاء للجسيم مكرر مع كتلة البروتين النووي قد سبق محدودة بسبب عدم القدرة على إحداث مثل كتلة في الكروموسوم من خلية حية في مكان معروف. في المختبر تحليل عززت فهمنا للسلوك الحركي من جسيم مكرر نشطة عندما تجتمع انسداد البروتين النووي 3، فضلا عن تفاصيل الآلية للجسيم مكرر نفسها 4،5. ويتم الاضطلاع الفهم الحالي للإصلاح النسخ المتماثل عادة مع الأشعة فوق البنفسجية وكيلا ضررا وتدرس باستخدام الحمض النووي البلازميد في الجسم الحي 6-8 </sتصل&gt;. في حين أن البروتينات التي يمكن أن تشارك في إصلاح الحمض النووي بعد أنه واجه في الجسم الحي كتلة البروتين النووي مفهومة عموما من هذه الدراسات ما إذا كانت هناك اختلافات في الأحداث الجزيئية ضمن مسارات الإصلاح نظرا لسبب واضح في كتلة تكرارها لا يزال حتى الآن يحدد لاحقا. هنا، نحن تصف النظام الذي يسمح للكتلة البروتين النووي التي ستنشأ في مكان معين من الكروموسوم باستخدام كاظمة نظام التشغيل نيون (FROS). علينا الاستفادة من سلالة من E. القولونية التي تمت زيارتها مجموعة من 240 مواقع تيتو دمجها في كروموسوم 9. كل موقع TETO ضمن مجموعة لديه 10 نقطة أساس تسلسل عشوائي المرافقة لزيادة استقرار مجموعة عن طريق منع إعادة التركيب بوساطة RECA داخل المصفوفة. هذه المجموعة، والاختلافات منه، واستخدمت أصلا لفهم E. القولونية ديناميات كروموسوم 10،11 ولكن تم بعد ذلك تكييفها لpreveالإقليم الشمالي في الجسم الحي تكرار 12. تم العثور على مجموعة إلى الحفاظ عليها بشكل مستقر ولمنع ما يقرب من 100٪ من الشوك النسخ المتماثل عند ملزمة TetR 10،12. وقد وجدت استخدام مجموعة LACO مماثلة في المختبر عدد قليل من كانت 22 موقعا كافية لمنع 90٪ من التكرار، على الرغم من أن هذه المجموعة أقصر كانت أقل فعالية في الجسم الحي 13. للتكيف مع مجموعة لإنشاء انسداد البروتين النووي، والبروتين كاظمة يجب أن يفرط إنتاجها للغاية في ظل الظروف الأمثل حيث أنه بعد ذلك بربط مجموعة لإنشاء حاجز. تشكيل انسداد، والإفراج لاحقا، يمكن رصدها من خلال استخدام المجهر مضان إذا تم استخدام البديل الموسومة fluorescently من قامع تيت. يشار إلى حالة تكرارها في كل خلية من قبل عدد من البؤر ينظر، حيث نقطة محورية واحدة تعني نسخة واحدة فقط من مجموعة موجودة داخل الخلية وبؤر متعددة تدل على تكرار النشط. هذا إعادة النشطةيتم تمكين الثني عندما يتم عكس انسداد البروتين النووي من خلال إضافة محفز مبرر له أن يقلل من تقارب ملزمة من TetR للموقع المشغل بما فيه الكفاية لجسيم مكرر على المضي قدما من خلال مجموعة. بروتين كاظمة لا يزال قادرا على ربط الحمض النووي مع قابلية عالية بما فيه الكفاية أن النسخ الآن متعددة من مجموعة يمكن تصور. يمكن اكتشاف تفاصيل أكثر تعقيدا من الأحداث في انسداد البروتين النووي باستخدام محايد محايد ثنائي الأبعاد الاغاروز الكهربائي للهلام والتهجين الجنوبي 14-16. هذه التقنيات تسمح للتحليل الهياكل الحمض النووي عبر السكان. وسيطة النسخ التي يتم تشكيلها خلال هذا الحدث، وربما لا تزال دون اصلاح، يمكن تصور. من خلال تغيير انزيم التقييد وتحقيق الاستفادة منها، وسيطة يمكن تصور ليس فقط في المنطقة ولكن أيضا مجموعة من المنبع مجموعة عندما يرتد شوكة تكرار 17،18. الالانحدار يقام لاحقا إلى التفكك جسيم مكرر. فروع الوليدة الرائدة والمتخلفة منفصلة عن مسارات قالب ويصلب لبعضها البعض كما فروع قالب بالتزامن إعادة يصلب، مما أدى إلى بنية الحمض النووي رباعية (أ تقاطع هوليداي). باستخدام هذا النظام فقد تبين أن شوكة تكرار غير مستقر عندما يواجه هذه الكتلة 18. وبالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحرارة المشتقات الحساسة من مكونات جسيم مكرر يمكن استخدامها لمنع إعادة الشوكة تكرارها بعد أن يكون قد انهارت. مرة واحدة يتم تأسيس كتلة، سلالة يمكن تحويل إلى درجة حرارة غير متساهلة لضمان التعطيل متزامن من جسيم مكرر والوقاية التي تتحكم فيها من إعادة شحن. هذا التعطيل الناجم عن الحرارة يضمن كل من الشوك في أوساط السكان قد انهار في وقت معين، ويسمح تقييم ما يحدث عندما ينهار جسيم مكرر، وكيف يتم معالجة الحمض النووي، وما هو المطلوب لإعادةبدء عملية تكرار الحمض النووي. ميزة من النظام المذكور هنا هو أن كتلة البروتين النووي هو عكسها تماما. وبالتالي فإن قدرة الخلايا على التعافي من كتلة البروتين النووي هي قادرة على أن يتبع. وإضافة إلى anhydrotetracycline الخلايا تخفيف الربط ضيق من كاظمة، والسماح لشوكة النسخ المتماثل إلى المضي قدما من خلال والخلية لاستعادة قدرتها على البقاء. تخفيف من انسداد يمكن تصور بواسطة محايد محايد ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز بعد 5 دقائق، وبواسطة المجهر في غضون 10 دقيقة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل الجدوى تكشف عن قدرة سلالة للتعافي من انسداد التكرار والاستمرار لتتكاثر. عن طريق تغيير الخلفية الوراثية للسلالات المستخدمة في إجراء التجارب وصفها هنا، مسارات إصلاح لهذا النوع من انسداد يمكن إجمال.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>For induction of TetR-YFP production</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>Release of replication bloackage</td></tr><tr><td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>eYFP filter set</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>Visualization of YFP</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>MetaMorph&amp;nbsp; Software (Molecular Devices)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>For agarose plug manufacture</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE, TBE buffer component</td></tr><tr><td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Bacteriostatic agent</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE buffer component</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>Cell lysis and ESP buffer component</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP buffer component</td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>Electrophoresis system</td></tr><tr><td>UV transilluminator 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>BioRad</td><td>1610433</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE component</td></tr><tr><td>Hybond-XL nylon memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td></tr><tr><td>3MM Whatman chromatography paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>Crosslinking of DNA and hybridization</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Denaturation buffer component</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Wash buffer component</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Random Hexamer Primers</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Visualization of blot</td></tr><tr><td>Hybridization bottle</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

العقبات موجودة على الحمض النووي، بما في ذلك البروتينات بإحكام والآفات المختلفة، يمكن أن تمنع بشدة تطور ماكينات النسخ المتماثل الخلية. وتوقف لجسيم مكرر يمكن أن يؤدي إلى التفكك لها من كروموسوم، سواء في جزء أو مجملها، مما أدى إلى انهيار شوكة النسخ المتماثل. الشفاء من هذا الانهيار هو ضرورة للخلية لبدقة كاملة ازدواج الكروموسومات وتقسيم وقت لاحق. آليات متنوعة لذلك، عند حدوث الانهيار، الخلية تطورت التي تجري لاستعادة شوكة الحمض النووي والسماح النسخ المتماثل إلى أن تكتمل مع الدقة العالية. سابقا، وقد تم دراسة هذه المسارات إصلاح تكرارها في البكتيريا باستخدام أضرار الأشعة فوق البنفسجية، والتي لديها عيب عدم المترجمة إلى موقع معروف. توضح هذه المخطوطة على نظام يستخدم نظام الإسفار كاظمة المشغل (FROS) لإنشاء كتلة البروتين في مواقع محددة يمكن أن تحفز المماطلة وانهيار تكرار FOركس في القولونية. البروتوكولات بالتفصيل كيفية وضع النسخ المتماثل يمكن تصور في الخلايا الحية واحدة باستخدام المجهر مضان وتكرار الحمض النووي وسيطة يمكن تحليلها من قبل 2-الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز. ويمكن إدراج درجة الحرارة المسوخ الحساسة من مكونات جسيم مكرر (على سبيل المثال DnaBts) في النظام للحث على انهيار متزامن من تكرار الشوك. وعلاوة على ذلك، فإن الأدوار من البروتينات إعادة التركيب وhelicases التي تشارك في هذه العمليات يمكن دراستها باستخدام بالضربة القاضية الجينية داخل هذا النظام.

وFROS هو، كتلة البروتين النووي في مواقع محددة محرض تمكن سيطة النسخ إلى أن تصور في الخلايا الحية 12،18. ويتضح تصميم تجريبي العام لأخذ عينات الخلايا في الشكل 1، وتوقيت أخذ العينات والاختلافات في الخلفية الوراثية جعل هذا النظام تنوعا لدراسة إصلاح مثل هذه الكتلة. يوضح التخطيطي كيف درجة الحرارة حساسة المسوخ، مثل نهاية الخبر dnaB والخبر dnaC التي استخدمت سابقا 18، يمكن أن تستخدم في هذا النظام. وجرى تحريض على FROS خارج في E. سلالة القولونية كما هو مبين في الشكل رقم 1 لسلالات حساسة غير درجة الحرارة. للتأكد من أن كتلة البروتين النووي قد أنشئت، وتصور الخلايا باستخدام المجهر مضان بعد 1 ساعة من النمو في 0.1٪ أرابينوز. هذاالإطار الزمني هو عادة كافية لإنتاج كتلة في نوع السلالة البرية ولكن سلالات أكثر الحساسية قد تتطلب التحسين. تحتوي معظم الخلايا 1 التركيز (الشكل 2A، + آرا)، الموافق نسخة واحدة فقط من مجموعة داخل الخلية مما يدل تكرار قد تم حظره. احصي عدد الخلايا مع 1 التركيز، 2 بؤر أو أكثر من 2 بؤر في عدد سكانها أكثر من 100 خلية. تم العثور على 92٪ من الخلايا لديك 1 التركيز مع ال 8٪ مع 2 البؤر. وكان يفترض أن الخلايا التي كان اثنين من بؤر جيدا متباعدة عن بعضها البعض، تمثل نسختين من مجموعة، سيكون في الجولة المقبلة من تكرار المحظورة. الخلايا مع اثنين من بؤر قريبة من بعضها البعض يعني أن مجموعة تم مؤخرا تكرارها ولم يتحقق كتلة البروتين النووي بعد. وقد انعكس كتلة البروتين النووي عن طريق إضافة anhydrotetracycline (AT) والازدواجية اللاحقة للمجموعة تصور مثلتراكم الخلايا مع بؤر متعددة (الشكل 2A، + آرا / AT). بؤر متعددة داخل الخلية التي تصور مضان microcopy دلالة على مجموعة لقد تم نسخ بنجاح ولقد مر وقت كاف للسماح للمواضع للتحرك بعيدا، والتغلب على أي أخت كروموسوم التماسك التي كانت موجودة. في هذه الحالة، وبعد 10 دقيقة إضافة AT، كان 94٪ من الخلايا 2 أو أكثر من البؤر وكانت تصور ما يصل إلى 8 بؤر لكل خلية. للتأكد من أن كتلة البروتين النووي لم تمنع في الواقع تكرار، تم تحليل بقاء الخلية (الشكل 2B). الخلايا التي كان تكرار مستعمل من قبل FROS تظهر انخفاضا حوالي 1000 أضعاف في مستعمرة تشكيل وحدة مقارنة ب الخلايا التي لم تزرع في وجود أرابينوز. الخلايا التي كانت تزرع بعد ذلك في وجود anhydrotetracycline تظهر عكس هذا تثبيط النمو. إذا كانت الخلايا غير قادرة على إصلاح الحمض النووي بعد الإفراجمن انسداد البروتين النووي، فإن انخفاض في قابلية ينتج. لتصور سيطة النسخ، وخلايا يمكن هي lysed داخل المقابس الأغاروس والبروتين والحمض النووي الريبي إزالتها. الحمض النووي يمكن بعد ذلك يتفاعل مع انزيم تقييد المناسبة للمنطقة من الفائدة. تم هضمها الحمض النووي في الصورة في الشكل 3A مع EcoRV الذي يقطع الحمض النووي مباشرة قبل مجموعة، ضمن مجموعة وبعد مجموعة لإعطاء 5.5 كيلو بايت و 6.7 كيلوبايت شظايا في المنطقة من اهتمام (الشكل 3B). شظايا هي مثالي ~ 3-7 كيلو بايت للبروتوكول وصفها هنا. شظايا خارج هذا النطاق قد تتطلب تغيير في تركيز الاغاروز المستخدمة وظروف الكهربائي لتحقيق الانفصال جيد. وقد electrophoresed الحمض النووي في البعد الأول وتصور (الشكل 3A). إذا تمت هضم الحمض النووي تماما، وسوف يكون تشغيل جميع الممرات بالتساوي، وستكون هناكعلى كمية عالية من الوزن الجزيئي المنخفض (أقل من حوالي 3 كيلو بايت، اعتمادا على انزيم التقييد). الحمض النووي موجودة في البئر تشير تحلل الخلايا غير مكتملة والكثير من ارتفاع الوزن الجزيئي الحمض النووي (فوق 10 كيلو بايت) يعني غير كاملة الهضم الحمض النووي. تم رفعه الحمض النووي للاهتمام في كل حارة. في الشكل 3A، أدرج الحمض النووي فوق 5 كيلو بايت. وقد electrophoresed البعد الثاني لاحق من هلام، مما أدى إلى قطري من الحمض النووي الخطي (الشكل 3C). الحمض النووي مجموعة داخل هذا الجل ثم تصور بواسطة التهجين الجنوبي (الشكل 3D). في الافراج (- عينة آرا)، مركزين يمكن أن يرى، الموافق 5.5 كيلو بايت و 6.7 كيلوبايت أجزاء من مجموعة، كما هو متوقع. وأظهرت العينة التي تكرار المحظورة (+ آرا) انخفاض في بقعة 5.5 كيلو بايت في المقارنة وإضافة إشارة بيضاوي الشكل، مما يشير إلى تراكم الحمض النووي على شكل حرف Y في العينة. والإشارةالمترجمة إلى موقف واحد، مما يدل على تكرار الشوك واعتقال في مكان مماثل بين السكان. على إضافة anhydrotetracyline، لم يعد من الممكن النظر إلى إشارة DNA على شكل حرف Y. يشار إلى إعادة تشغيل صدر مؤخرا عن وجود إشارة من كامل Y-قوس، والتي تصور الشوك المهاجرة عبر المنطقة. ومن المهم لتطبيع DNA داخل كل المكونات الاغاروز لضمان إشارات من العينات حتى. إشارات يمكن قياسها كميا مع برنامج التصوير المناسب. آخر سيطة شيوعا ينظر هو أن تشير هوليداي مفرق (HJ) تشكيل. هو تصور وHJ كإشارة مخروط في الجزء العلوي من Y-قوس وارتفاع من الحمض النووي الخطي في نهاية قوس Y (الشكل 3D). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig2.jpg" /> الشكل 2: مضان المجهر وViab<html> ility. (أ) E. كانت تزرع القولونية سلالة تحمل مجموعة تيتو عند 30 درجة مئوية في وجود من 0.1٪ الارابينوز (+ آرا) لمدة 1 ساعة ثم anhydrotetracycline (AT) وأضيف لمدة 10 دقيقة لجزء من السكان للافراج عن كتلة النسخ المتماثل. وتظهر الميكروسكوب تمثيلية للإنتاج YFP (أعلى هيئة). شريط مقياس = 2 ميكرون. تم تعداد نسبة الخلايا التي تحمل 1 أو 2 أو أكثر من 2 بؤر وتعرض كنسبة مئوية (اللوحة السفلى). (ب) الخلايا المزروعة في غياب الارابينوز (- آرا)، مع الارابينوز (+ آرا) ومع كل الارابينوز وanhydrotetracycline (AT و 10 دقيقة) كانت التسلسلية مخففة 10 أضعاف، وإما رصدت أو نشرها على أجار التي تحتوي على الأمبيسلين فقط ( - / + عينات آرا) أو الأمبيسلين مع anhydrotetracycline (+ AT العينة) ونمت عند 30 درجة مئوية لتحديد بقاء الخلية. الأعلى: لوحة تمثيلية تظهر نمو في التخفيفات المشار إليها. أسفل: رسم بياني يوضح متوسط ​​كفو / مل + ووزارة شؤون المرأة.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig3.jpg" /> . الشكل (3): التصور من الحمض النووي وسيطة النسخ المتماثل في كتلة البروتين النووي (A) الحمض النووي الجيني من الخلايا (1 - آرا، 2، + آرا؛ 3، + آرا / AT) التي هي lysed داخل المقابس الاغاروز ويتفاعل مع انزيم التقييد EcoRV تم فصل على هلام الاغاروز 0.4٪ (55 V، 16 ساعة). يشار إلى 3 كيلوبايت، 5 كيلو و 10 كيلو بايت العصابات. تم رفعه الحمض النووي فوق علامة 5 كيلو بايت كما يتضح من المربعات البيضاء. (ب) تخطيطي لEcoRV هضم المنطقة مجموعة. تكرار الشوك دخول مجموعة من أصل انسداد في جزء 5.5 كيلوبايت عندما تم نمت الخلايا في وجود أرابينوز. مواقع تقييد استخدام بالرمز السهام وعيظهر شعاع على شكل مربع مع خطوط. وقد تناوب (C) والحمض النووي رفعه 90 درجة وفصل في هلام الاغاروز 0.8٪ (220 V، 4 ساعة). يشير مربع أبيض على الختان من الحمض النووي بعد الانفصال. وقد تصور (D) المنطقة مجموعة في وقت لاحق عن طريق تحليل لطخة الجنوبي باستخدام مسبار المشعة إلى المنطقة مجموعة. والخلايا مع كتلة تكرارها في هذا الموقف يكون إشارة المقابلة للجزء 5.5 كيلوبايت تقع على الصبغي Y-القوس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System at JoVE.com

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

الأمر الذي أدى إلى انسداد النسخ المتماثل الموقع المحدد في<i&gt; E. القولونية</i&gt; استخدام نظام نيون كاظمة المشغل

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

8.9K Views.  University of Newcastle. We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Video: Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Genetics

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Bioengineering

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

الهندسة البكتيريا تمسكا من إنشاء واحدة الاصطناعية Curli OPERON

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

إنتاج الجينات الحذف في الإشريكيّة القولونية بتوصيل P1 مع أشرطة الكاسيت المهربة مقاومة المضادات الحيوية

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

أسلوب Fluorescence المستندة إلى دراسة تنظيم الجينات البكتيرية في الأنسجة المصابة

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

جيل المحددة والمسوخ Markerless في أنواع السيانوبكتيريا نموذج

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

تصوير الخلايا الحية للنشاط النسخي في فواصل الحمض النووي مزدوجة ستراند

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

الأمر الذي أدى إلى انسداد النسخ المتماثل الموقع المحدد في

Summary

Explore More Videos