يسمح هذا البروتوكول بمراقبة واكتشاف أحداث النسخ ويعطي رؤى حول آثار فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي على النسخ المستمر للجين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي مراقبة نصوص الحمض النووي الريبي المسماة بشكل فردي في خلايا واحدة على فترات زمنية من الثواني على مدى فترة إجمالية قدرها ساعة واحدة أو أكثر. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على استجابة تلف الحمض النووي للتحقيق في الحديث المتبادل بين النسخ والعمليات الخلوية ، مثل تكرار الحمض النووي وآفات الحمض النووي.
نصيحتنا هي مراقبة الخلايا باستخدام الدوكسيسيكلين وإجراء قياسات المعايرة لتدريب الكشف عن موقع النسخ وجزيئات الحمض النووي الريبي المسمى. في أنبوب 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيق، قم بإعداد الحل A الذي يحتوي على 150 ميكرولتر من الحمض النووي البلازما MEM المخفض في المصل و2.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي في كاشف مساعد العدوى. وبالتوازي مع ذلك، قم بإعداد المحلول B الذي يحتوي على 150 ميكرولتر من MEM المصلي المخفض و1.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي في كاشف إصابة قائم على الدهون.
احتضان كلا الحلين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، ثم إضافة الحل بلطف A إلى الحل B واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتضمين الخلايا، أضف 300 ميكرولتر من الحلول المختلطة A وB إلى كل طبق واوزعه برفق. تخزين طبق أسفل الزجاج داخل طبق 100 ملليمتر ثقافة الخلية القياسية واحتضانه في 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
إعداد أنبوب 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيق مع 200 ميكرولتر من DMEM مع HEPES دون فينول الأحمر وتكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني جردت الفحم، ثم إضافة TA. ما يقرب من ساعة واحدة قبل بدء المراقبة المجهرية، والحث على نسخ الجينات مراسل عن طريق إضافة doxycycline إلى متوسط النمو ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع 200 ميكروليتر micropipette. نقل الخلايا إلى المجهر 30 دقيقة على الأقل قبل بدء الملاحظة ووضع طبق 100 ملليمتر مع الخلايا داخل غرفة حضانة المجهر الكبيرة المسخنة. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع TA المخفف مسبقا داخل غرفة المجهر البيئية الكبيرة لتدفئته إلى 37 درجة مئوية.
استبدل غطاء الطبق السفلي الزجاجي بغطاء يحتوي على ثقب قطره ثلاثة ملليمترات. حدد هدف الغمر 100X النفط في لوحة التحكم المجهر وتطبيق قطرة من زيت الغمر إلى الهدف. ضبط طبق القاع الزجاجي مع الخلايا داخل غرفة حضانة مرحلة المجهر وقفل في مكانه، ثم إغلاق غطاء حاضنة المرحلة وجميع أبواب السكن المجهر.
بدء تشغيل المجهر والتحكم في البرامج، وفتح نافذة التحكم التركيز وانقر على جزء النطاق. في جزء تحديد الانبعاثات، انقر فوق مربع العين بنسبة 100٪ لتعيين مسار شعاع العين لمراقبة العين مباشرة بالعين. في قائمة مجموعة عوامل التصفية، قم بالتبديل إلى مجموعة فلتر العين وانقر فوق برايتفيلد، ثم اضغط على زر برايتفيلد المفتوح.
حرك هدف المجهر نحو طبق القاع الزجاجي حتى يلمس الزيت الزجاج. ننظر من خلال العين والتركيز يدويا على مستوى الخلايا، ثم إيقاف تشغيل زر برايتفيلد مفتوحة. اترك الخلايا لمدة 30 دقيقة قبل بدء عمليات المراقبة التجريبية للسماح لها بالتكيف مع الظروف البيئية ومنع الانجراف البؤري أثناء التصوير بسبب تدرجات درجة الحرارة.
إعداد 200 ميكرولتر micropipette و 200 نصائح مرشح ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة. في إطار التحكم البؤري لبرنامج التحكم بالمجهر، قم بتعيين كثافة الليزر إلى 5٪ وأدخل قيمة 50 مللي ثانية لوقت التعرض. افتح نافذة الالتقاط لضبط الإعدادات لتنفيذ عملية اقتناء تلقائي للصورة للوقت ثلاثي الأبعاد.
حدد نوع اكتساب الالتقاط ثلاثي الأبعاد وحدد 12 إلى 16 شريحة بصرية مفصولة ب 0.4 ميكرومتر. حدد خانات الاختيار الخاصة بالنطاق حول التيار وارجع إلى الوضع الحالي بعد الالتقاط. في جزء التقاط الفاصل الزمني، أدخل قيمة 120 لعدد النقاط الزمنية و30 ثانية للفاصل الزمني.
حدد مرشح الكونفوجال المحدد وفقا لتسميات البروتين الفلورية المنقوزة كما هو مذكور في مخطوطة النص وحدد وقت التعرض لكل قناة إلى 50 مللي ثانية. استخدم الإعداد الحالي لطاقة الليزر لاستخدام قيمة 5٪ المحددة في إطار التركيز البؤري. في إطار التحكم في التركيز، انتقل إلى جزء الكاميرا، وحدد عنصر التحكم في عرض صورة المقياس واختر الزر اليدوي لإعداد نطاق ثابت من شدة الصورة ليتم عرضها.
حدد الخلايا للتصوير الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد لمواقع النسخ عند تحريض فاصل حبلا مزدوج الحمض النووي. قم بفحص الخلايا وحدد ثلاثة حقول للعرض وفقا للشروط الموضحة في مناقشة النص. التركيز على كل خلية مختارة موجودة سابقا في وسط مجال الرؤية مع موقع النسخ في المستوى الأوسط من المكدس Z.
وضع علامة على كل موضع XYZ في مستوى XY من إطار التحكم في التركيز بالنقر فوق نقطة تعيين. إضافة 200 ميكرولتر من TA المخففة مسبقا إلى الخلايا وبدء التصوير سلسلة زمنية 3D عن طريق النقر على البدء على نافذة الالتقاط. حفظ بيانات التصوير في تنسيق بيانات برنامج التحكم بالمجهر على القرص الصلب للكمبيوتر التحكم بالمجهر.
إضافة 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من دوكسيسيكلين إلى متوسط النمو للخلايا ساعة واحدة قبل البدء في اكتساب صورة المجهر. جبل طبق أسفل الزجاج داخل غرفة الحضانة مرحلة المجهر وإعداد الحصول على الصورة كما هو موضح سابقا. استخدم نفس إعدادات كثافة الليزر والتعرض كما كان من قبل.
تعيين إعدادات التقاط سلسلة زمنية 2D وتعيين 120 نقطة زمنية على فترات من 500 مللي ثانية في لوحة التقاط الفاصل الزمني. الحصول على العشرات من سلسلة زمنية المعايرة من مواقع متعددة من أجل توليد مجموعات البيانات لحساب عدة مئات من القياسات TFI نسخة واحدة. باستخدام هذا البروتوكول، يتم الحصول على رسم بياني يعرض عدد النصوص الجينية للمراسل ذات العلامات الفلورية بمرور الوقت بدقة زمنية تبلغ ثوان على مدى فترات تصل إلى ساعات.
يظهر هنا المسار الزمني لقيم TFI لموقع نسخ الجينات لمراسل PROM المسمى بتراكم بروتين معطف MS2 المسمى بجزيئات البروتين الفلوري الأخضر على النصوص الوليدة. إن تحريض DSB واحد في جينات المراسل يجعل من الممكن دراسة تأثيره على النسخ الجيني المستمر للمراسل ورصد أحداث النسخ الناشئة من موقع DSB ، وهي النسخ الناجم عن الكسر. TA إضافة وتعريف DSB يؤدي إلى قمع النسخ الجيني مراسل PROM بعد حوالي 11 دقيقة التي لم يتم استعادتها حتى 60 دقيقة.
يظهر الاسترداد الكامل لإشارة PP7-RFP بدء النسخ الناجم عن الكسر. يظهر جين المراسل المضاد للمنطق EXON 2 إنهاء النسخ المدفوعة بالمروج ، والذي يتم استبداله بعد ذلك بنسخ مستحث من قبل antisense break-induced كما كشف عن تراكم بروتين معطف MS2 المسمى بربط بروتين فلوري أحمر إلى الحمض النووي الريبي المتولد من تسلسل الحلقة الجذعية MS2 المضادة للمنطق. اختيار الخلايا للتصوير، وإعداد التصوير الفاصل الزمني المعالجة ضبط موقف Z من موقع النسخ المسمى على كل موقف XY في وسط المكدس Z ليتم الحصول عليها.
وأخيرا، يجب تنفيذ إضافة TA المخفف في متوسط النمو بعناية فائقة لمنع أي تحولات في المواقف المختارة مسبقا مع الخلايا التي سيتم تصويرها. يمكن تطبيق تصوير نسخ الحمض النووي الريبي المفردة في 3D مع مرور الوقت في الخلايا الحية لدراسة نسخ الحمض النووي الريبي أثناء تكرار الحمض النووي أو تغييرات النسخ أثناء تطور دورة الخلية.
