ويعود الفضل في بلازميد معربا عن pCG001 في Ubp1 بيكر روهان في مدرسة جون كورتين للأبحاث الطبية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مارس من الدايمات البحث المنح 1-FY2011 مارس من الدايمات جائزة باسل كاتب أوكونور الباحث بحوث # 5 FY20 وNSF جائزة CAREER 0746796.

1. سلالة الهندسة سير العمل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج تسلسل الترميز (أ) تسلسل غشاء الترجمة، (ب). بروتين سريع النضج والفلورسنت (ج) تسلسل الاعتراف البروتيني N-محطة لوالإطار مع بروتين من الفائدة (على سبيل المثال عامل النسخ) كنا الغشاء استهدفت TSR-2 و فينوس مراسل تنصهر إلى البروتيني تسلسل الاعتراف اليوبيكويتين (UB) لحساب عدد من عاثية أعرب λ قامع جزيئات البروتين CI. تفاصيل عن الكيفية التي شيدت البروتين الانصهار TSR-فينوس-UB-CI، لتحل محل البرية من نوع الترميز CI المنطقة وإدماج بناء في E. ويرد وصف كروموسوم القولونية باستخدام λ الأحمر إعادة التركيب 3، بالتفصيل في المرجع. 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من جميع تعديلات من قبل التسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل ترميز البلازميد والبروتيني محددة لتسلسل الاعتراف المستخدمة أعلاه الى سلالة التعبير عن بروتين الفلورية ومراسل من الفائدةفي الانصهار متعدية. استخدمنا البروتيني Ubp1، الذي يشق مباشرة بعد محطة بقايا C-اليوبيكويتين 4. </li></ol> 2. خلايا الثقافة وإعداد نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار واحد E. مستعمرة بكتيريا من الاهتمام من لوحة أجار يشوبه طازجة على 1 مل سائل الإعلام M9 الحد الأدنى من 5 تستكمل مع الأحماض الأمينية MEM 1X والمضادات الحيوية المناسبة. احتضان في درجة الحرارة المطلوبة في شاكر طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى OD 600&gt; 1.0 (الكثافة البصرية في 600 نانومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافة في 1 مل المتوسطة M9 جديدة مع المضادات الحيوية المناسبة لOD ​​600 = 0.02. احتضان شاكر في في درجة حرارة مناسبة. ويمكن زيادة الكثافة الخلوية الأولية إذا لزم الأمر لدرجات الحرارة المنخفضة النمو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما OD 600 = 0،2-0،3 (عند 37 درجة مئوية مع زراعة الخلايا الأولية في OD 600 = 0.02، هذا سيستغرق ساعة 3-4)، البدء في إعداد جيل الاغاروز وحة (الخطوة 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا على استعداد للتصوير عندما OD <suب&gt; 600 = 0،3-0،4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ثقافة مل نقل المحتضنة في أنبوب مل ميكروسنتريفوج 1.5، الطرد المركزي في 10،000 XG لمدة 1 دقيقة في ميكروسنتريفوج الفوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وإضافة 1 مل M9 المتوسطة الطازجة و resuspend بيليه بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 1.6 و 1.7. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بلطف وسائل الاعلام في 1 مل M9. ويمكن استخدام خلايا مباشرة للتصوير المجهر المخفف أو 10 - لأضعاف-100 لضمان الكثافة المنخفضة خلية للتصوير timelapse. نلاحظ أن كثافة منخفضة الخلية مهمة للتصوير timelapse الموسعة. وختم غرفة التصوير (الخطوة 4) أثناء التجربة. بسبب النمو المتسارع للخلايا، ويمكن تركيزات عالية من الخلايا الأولية تستنفد الأكسجين بشكل كبير داخل غرفة بعد نمو متواصل في لوحة هلام، والحد من الفلورسنت النضج البروتين والتي تؤثر في نمو الخلايا. </li></ol> 3. إعداد الحل الاغاروز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن 10-20 ميلي غرامذوبان منخفضة درجة الحرارة الاغاروز في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مناسبة المتوسطة M9 حجم الحد الأدنى من المضادات الحيوية دون حل لجعل الاغاروز 3٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين الحل الاغاروز لمدة 30 دقيقة في 70 درجة مئوية لإذابة، عكس الأنبوب للتأكد من أن الحل هو ذاب تماما ومتجانسة. يمكن سكب هلام لوحة في هذه المرحلة (الخطوة 4) أو يمكن تخفيض درجة الحرارة إلى 50 ° C واحتجز لعدة ساعات لاستخدامها لاحقا. </li></ol> 4. إعداد لوحة جل في الدائرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حوالي 50 دقيقة قبل التصوير، وشطف شريحة Microaqueduct بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الزجاج غطاء تنظيفها 1 (باستخدام طريقة التنظيف صارمة مثل التي وصفت في 6) وMicroaqueduct الشريحة مع الماء المعقم والجافة التي تهب مع الهواء المضغوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طوقا المطاط على الشريحة Microaqueduct بحيث يغطي مداخل ومنافذ على الجانب كوب من الشريحة Microaqueduct (يمكن تعديل هذه لتقديم الطلبات فيالذي perfused وسائل الإعلام من خلال العينة). تطبيق 50 ميكرولتر حل الاغاروز (الخطوة 3) إلى وسط الشريحة Microaqueduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتصدر حل الاغاروز مع تنظيفها، والزجاج غطاء الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للحل الاغاروز الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، يعد عينة الخلية (الخطوة 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقشر بعناية والزجاج غطاء من أعلى منصة هلام. إضافة ميكرولتر 1،0 زراعة الخلايا غسلها إلى الأعلى لوحة هلام. انتظر دقيقة 2 ~ للثقافة لتمتصه لوحة هلام. من المهم عدم الانتظار طويلا حتى يتسنى للسادة هلام overdries، ولكن لفترة كافية من الالتزام بشكل صحيح الخلايا إلى لوحة هلام. والوقت المثالي انتظار تختلف مع درجة الحرارة والرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء انتظار، تجف آخر الزجاج غطاء precleaned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية العينة مع غطاء زجاجي جديدة ضمان الانحياز جيدا الزجاج غطاء الشريحة وMicroaqueduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع غرفة درجة حرارة النمو تسيطر عليها باتباع إرشادات الشركة المصنعة.ويمكن الآن أن تستخدم للتصوير في المجهر (الخطوة 5). </li></ol> 5. التصوير واقتناء أفلام Timelapse <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الليزر والمجهر باتباع إرشادات الشركة المصنعة (مثل الليزر قد تحتاج إلى استعد للساعة 0.5 ~ قبل التجربة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قفل الدائرة تجميعها لإدراج المرحلة على المجهر. تعيين درجة حرارة غرفة النمو وسخان الهدف عند 37 ° C درجة الحرارة أو غيرها من النمو المنشود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا التصوير فوق درجة حرارة الغرفة، سيتم التركيز أو هلام وسادة الانحراف عادة بشكل ملحوظ لدقيقة 15 ~ بعد التحول درجة الحرارة الأولية. في الممارسة العملية، استخدم هذا الوقت للعثور على مناطق المصالح وتعديل النصوص التصوير اللازمة لتجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على خلايا المجهر وتخزين موقف كل خلية بعد ذلك تركز داخل منطقة محددة مسبقا التصوير والانحياز. ولا يمكن تصوير أكثر من خلية واحدة في كل مرة نافذة الصورة الاستحواذ. لtimelapse التصوير أكثر مأي أجيال، وضمان أن يتم فصل الخلايا في البداية المصورة من الخلايا الأخرى بما لا يقل عن بضع مئات من ميكرومتر حتى أن المستعمرات الأخرى لن تدخل المنطقة خلال التصوير النمو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط كثافة الليزر الإثارة بحيث تقريبا كل photobleach جزيئات الفلورية في غضون 6 التعرض (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام برنامج نصي التصوير الآلي / مجلة، الحصول على البيانات باستخدام خوارزمية timelapse هو موضح في سير العمل التجريبي في الشكل 3. </li></ol>

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

ليس لدينا أي الإفصاحات.

يمكن للطريقة CoTrAC يمكن تعميمها لقياس إنتاج بروتينات أخرى حيث N-C-التقليدية أو محطة اندماج بروتين فلوري قد وقف نشاط البروتين. استراتيجية CoTrAC ثلاثة مزايا فريدة على الطرق الحالية. الأولى، وشارك في متعدية الانصهار يضمن أن يتم إنتاج جزيء واحد لمراسل الفلورسنت لكل جزيء من البروتين من الفائدة، مما يسمح عد دقيق لإنتاج البروتين في الوقت الحقيقي. ثانيا، مراسل غشاء استهداف TSR-فينوس تمكين الكشف عن جزيء واحد من الصحفيين الفلورسنت، مما يتيح الكشف عن البروتينات التي أعرب عنها في مستويات منخفضة جدا. الثالث والأهم من ذلك، شارك في الانقسام متعدية لمراسل الفلورسنت يسمح للبروتين من الفائدة على الحفاظ على شبه البرية من نوع تسلسل وظيفة التي تستخدم عادة اليوبيكويتين كتسلسل البروتيني الاعتراف في E. القولونية والبروتينات المستهدفة تختلف فقط من سلاسل الببتيد بهم من النوع البري في أن N-N أول محطة &lt;/ م يتم تغيير&gt;-فورميل ميثيونين لميثيونين. عند استخدام الأسلوب CoTrAC، ومن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن طريقة CoTrAC يقيس عدد جزيئات البروتين المنتجة في كل نافذة الوقت 5-دقيقة، والذي يختلف من قياس عدد جزيئات البروتين موجودة في كل خلية (أي البروتين التركيز). معظم حيدة الخلية التعبير الجيني مضان فحوصات قياس تركيز البروتين، والذي هو نتيجة متوازنة من البروتين وتدهور الإنتاج. ولذلك، لا بد من النظر في معدل التدهور من البروتين من الفائدة بعناية إذا تم استخدام قياس تركيز البروتين لاستنتاج المعلومات الإنتاج. وعلاوة على ذلك، وتركيز البروتين يخضع لتقلبات الناجمة عن تقسيم من البروتين بين الخلايا الوليدة اثنين في انقسام الخلايا، والتي قد تكون كبيرة لمحدودي التعبير على مستوى البروتينات وتفسيرها عن طريق الخطأ على أنها ناتجة من ديناميات إنتاج البروتين. يمكن أن تكون طريقة CoTrAC موديfied لقياس تركيز البروتين من خلال عدم photobleaching جزيئات مراسل المنتجة حديثا، ولكن يجب أن يتم ذلك مع تدقيق إضافي. يجب على المرء أن تحقق من أن معدلات تدهور مراسل الفلورسنت والبروتين من الفائدة متشابهة، والتي يتم تقسيم كل من هم بالمثل في الخلايا ابنة في الثانية على انقسام الخلايا، حتى يتسنى للتركيز لمراسل الفلورسنت التي تعكس من البروتين من الفائدة. نلاحظ أنه في حين أن CoTrAC لا يغير تسلسل البروتين، إضافة الجين مراسل تغيير تسلسل مرنا. قد يكون ذلك، النسخ والترجمة ديناميكية و / أو معدلات تدهور مرنا نص مضطرب. إذا تم استخدام أسلوب CoTrAC لمراقبة إنتاج البروتين في سياق من النوع البري، من المهم للمقارنة بين مستويات التعبير من البروتين المستهدف سواء في تسلسل من النوع البري والانصهار مع CoTrAC علامة فلوري (على سبيل المثال في المرجع .. 1 قارنا CI التعبير في الإنشاءات CoTrAC لدينار إلى أنه في مستذيب من النوع البري). نناقش أدناه الاعتبارات اللازمة لتعميم أسلوب CoTrAC. أولا، نحن مناقشة إمكانية استخدام تسلسل غير TSR-فينوس-UB. المتطلبات العامة هي: (1) يجب أن تكون مترجمة لمراسل لبعض الموقف داخل الخلية بحيث لا منتشر بسرعة (مع TSR للصحفيين هي في القطبين الخلية 1). هذا ضروري لواحدة جزيء الكشف عن جزيء بروتين فلوري والإشارة من جزيء بروتين فلوري نشرها بسرعة وعادة ما لا يكون للكشف أعلاه خلفية الخلية autofluorescent، (2)، وبروتين فلوري يجب أن يكون مشرقا بما فيه الكفاية ليتم الكشف عن على واحدة جزيء المستوى ويجب أن تنضج (تصبح الفلورسنت) بسرعة كافية لتطبيق المطلوب (فينوس هو البروتين أسرع تستحق الفلورسنت حتى الآن 7)، (3)، ويجب أن photobleached البروتين الفلوري بعد الكشف بحيث البروتينات الفلورية يمكن أن يكون حديثا ديtected في نقاط وقت لاحق (البروتينات الفلورية التي تقاوم بشكل مفرط لphotobleaching غير مرغوب فيها والتعرض ليزر المفرط يمكن أن يسبب التحف الضيائية)، (4)، وتسلسل الاعتراف البروتيني لا يمكن مغادرة أي الأحماض المتبقية الأمينية على البروتين من الفائدة التي سوف التشويش وظائفه (Ubp1 يشق مباشرة بعد بقايا UB-كربوكسي محطة، دون ترك أي مخلفات إضافية على الإطلاق). الثاني، لا بد من التحقق من أن يتم التعبير بشكل صحيح ومراسل المشقوق. يجب فصل الانقسام بروتين مراسل من البروتين من الفائدة تكون فعالة، ويمكن قياس الكفاءة باستخدام البقع الغربية الانقسام ضد مراسل والبروتين من الفائدة أو كليهما، JL (الأجسام المضادة متاحة تجاريا للكثير من البروتينات الفلورية مثل الأجسام المضادة لمكافحة GFP 8 من Clontech، الذي يربط فينوس في طخة غربية). ينبغي للمرء التأكد من أن يتم الكشف عن أي البروتين الانصهار في uncleaved البقع ضد لست] من الخلايا معربا عن الانصهارالبروتين عند مستويات أعلى من تلك المتوقعة في التجارب CoTrAC. أيضا، يجب أن يكون أنتجت مراسل والبروتين من الفائدة عند نسبة 1:1 بعد الانقسام. يمكن التحقق من ذلك عن طريق قياس شدة الفرق المشقوق في مكافحة مراسل والمضادة للبروتين في المصالح البقع الغربية تطبيع من قبل عصابات من شدة uncleaved في سلالات تفتقر البروتيني. إذا مراسل والبروتين من الفائدة موجودة في نسبة 1:1 بعد الانقسام، ثم: نلاحظ أنه منذ الغربية البقع قياس تركيز البروتين، ونسبة الناتج سوف تنحرف من 1:1 مراسل وإذا كان البروتين من الفائدة تظهر معدلات التحلل مختلفة بعد الانقسام. الثالثة، ينبغي للمرء أن تحقق من أن يسلك البروتين في المصالح وظائفه المتوقعة بعد الانقسام. وجود لمراسل بناء الانصهار الكبيرة و / أو الترجمة إلى غشاء الخلية من المتوقع أن تعطيل أهم العوامل النسخ (وكان كاظمة λ CI المشتركغير نشط mpletely دون Ubp1 التعبير في تجاربنا 1). يجب تحويل البلازميد البروتيني، معربا عن تفعيل بروتين من الفائدة بمقدار البروتين تحريرها من علامة الانصهار متعدية الضخمة. هذه الظاهرة يؤدي إلى تطبيقات أخرى CoTrAC ممكن. وقد استخدم الانقسام في محطة للكربوكسي UB من Ubp1 لفضح غير قانوني الأمينية الأحماض الأمينية محطة لتوضيح البكتيرية N-نهاية حكم تدهور البروتين 9. إذا الانصهار لمراسل كبيرة الأغشية المرتبطة بها، يثبط نشاط عامل النسخ (أو البروتين الأخرى مثل إنزيم)، يمكن أن تسترد نشاطها بسرعة عن طريق التعبير البروتيني حمل. ويمكن استخدام CoTrAC لغاية بسرعة &quot;تشغيل&quot; مجموعة من عوامل النسخ الموجودة مسبقا عن طريق إزالة / إضافة مثبط / شارك في المنشط أو الشروع في ذلك التعبير البروتيني أو النشاط. وأخيرا، قد التعبير لمراسل الفلورسنت التشويش خلية علم وظائف الأعضاء، وينبغي التأكد من أن خصائص مثل خليةدورة الزمن تتأثر؛ في التجربة الموضحة في المرجع. 1، استخدمنا البروتين TSR كتسلسل غشاء توطين بسبب TSR بالفعل بروتين الغشاء أعرب للغاية وزيادة طفيفة في التعبير TSR من غير المتوقع أن تؤثر على سلوك الخلية. الرابع، عند استخدام تسلسل مراسل غير ناقش تحديدا TSR-فينوس-UB، ينبغي أيضا البروتوكول التصوير المطابق تعديلها حسب الحاجة. على سبيل المثال، سوف البروتينات الفلورية مختلفة تتطلب بروتوكولات الإضاءة المختلفة لتحقيق توازن جيد بين الكشف عن جزيئات البروتين بكفاءة الفلورسنت، والضيائية من التعرض الليزر وphotobleaching. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون الإثارة الليزر في ذروة الامتصاص للبروتين فلوري في المختارة؛ الذروة الإثارة يتطلب شدة الإثارة أعلى (وبالتالي ارتفاع الضيائية والخلفية تألق ذاتي) لتحقيق نفس الانبعاثات بروتين فلوري وخصائص photobleaching. أيضا،يمكن تعديل التردد التصوير ليكون أبطأ أو أسرع من 5 دقائق اعتمادا على التسامح من الخلايا إلى الضيائية من التعرض الليزر. في تجاربنا، 12 E. منفصلة تم تصوير كل المستعمرات القولونية 5 دقائق ومتابعتهم لمدة 7-8 قبل خلية دورات مراقبة عيوب كبيرة الضيائية 1. أخيرا، وبعد مرور الزمن أفلام من إنتاج بروتين يتم الحصول في التجربة CoTrAC (أمثلة تبين في أرقام 4 و 5)، فلوري التعبير البروتين يحتاج إلى كمية عن طريق الكشف عن البقع الفلورية المقابلة لواحد أو أكثر الجزيئات، وتكليف لجزيئات الخلايا الفردية و تتبع الأنساب الخلية. وقد وصفت ونحن روتين مخصصة لدراسة مطلب λ الإنتاج CI كاظمة 1. لفترة وجيزة، يجب على المرء أولا تحديد الخطوط العريضة للخلايا فردية والنقاط الزمنية المقابلة لانقسام الخلايا في الصور brightfield في حين تتبع الأنساب الخلية من خلال إطار الصورة اللاحقةق. وجدنا أن الوقت 5 دقائق الفاصلة كانت قصيرة بما فيه الكفاية أن خلية في إطار واحد يقابل عادة إلى الخلية في الإطار السابق الذي تقاسم مع أكثر بكسل في صورة مجزأة. في الحالات التي لوحظت تحولات كبيرة في بعض الأحيان من المستعمرات بين إطارين لاحقة، كان مطلوبا من الاحالة دليل على الخلايا الفردية الأنساب. المقبل، ويحتاج المرء لتحديد المواقع وقياس الفلورسنت حدتها. وجدنا أن يمكن تحديد البقع الفلورية من (1) ممر الموجة تصفية الصورة مضان لإزالة التردد المنخفض خلفية مضان (على سبيل المثال تألق ذاتي) وضوضاء عالية التردد، (2) العتبة الصورة يعتمد على كثافة مضان و (3) تحديد الأجسام أكبر من بضع بكسل في الصورة thresholded. وتناسب الكائنات في الصورة thresholded إلى وظيفة جاوس 2-الأبعاد بالإضافة إلى خلفية ثابتة، ونقل كثافة متكاملة من بقعة بوصفها نتاجا لاتساع ائقا والتباين.في تجاربنا، TSR-متعددة فينوس-UB للصحفيين في كثير من الأحيان مترجمة شارك في القطبين في الخلية، وخلق بؤر التي كانت أكثر إشراقا من تلك التي من جزيئات TSR-فينوس واحد. تم تحديد عدد من الجزيئات داخل فينوس بقعة واحدة بقسمة كثافة متكاملة من بقعة من كثافة مضان من جزيء واحد فينوس، الذي كميا باستخدام منخفضة المستوى سلالة التعبير التي تحتوي على بقع نادرا أكثر من بروتين فلوري جزيء. ويمكن قياس هذا تكميل مع القياسات في المختبر من الجزيئات واحدة بروتين فلوري انضمت إلى شريحة زجاجية. لقد وجدنا أن البروتين الفلوري خصائص متشابهة إلى حد كبير في الجسم الحي في المختبر وفي النظم مع ظروف مماثلة عازلة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> الاغاروز (درجة حرارة انصهار منخفضة) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> ملي-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × أملاح M9 </td><td></td><td></td><td> وصفة التالية صفها في 9 </td></tr><tr><td> 20٪ نسبة الجلوكوز </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × MEM حل الأحماض الأمينية </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> التحكم في درجة حرارته النموغرفة المرحلة محول </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> الهدف سخان </td><td> Bioptechs </td><td> نموذج يعتمد على الهدف المجهر </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct الشرائح </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> النظارات غطاء الصغيرة </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> قد يكون من الصعب المصدر؛ متاحة أيضا من Bioptechs </td></tr><tr><td> تغطية الزجاج / الشريحة طوقا </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0.75 مم </td><td></td></tr><tr><td> مضان المجهر </td><td> مختلف </td><td> الإعداد سبيل المثال: المتماسك إنوفا 308C الأرجون ليزر ايون، أوليمبوس IX-81 المجهر، أوليمبوس PlanApo 100X 1،45 NA الهدف، Metamorph البرمجيات </td><td> يجب أن يكون الإثارة الليزر، المرحلة الآلي XYZ، برامج التشغيل الآلي قادرة على ضبط تلقائي للصورة والتصوير كتابتها، والبصريات قادرة على resolvinالبروتينات الفلورية واحد ز </td></tr><tr><td> كاميرا EM-CCD </td><td> مختلف </td><td> الإعداد سبيل المثال: أندور Ixon DU-898 </td><td> يجب أن يكون انخفاض مستوى الضجيج بما فيه الكفاية للكشف عن البروتينات الفلورية واحد فوق خلفية </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC) لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لحساب عدد جزيئات البروتين التي تنتج في خلية واحدة خلال متتابعة، ويندوز غضون خمس دقائق. يتطلب المجهر مضان مع الإثارة ليزر كثافة قوة كيلوواط 0،5 حتي 1 ~ / سم 2، وهي حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن جزيئات البروتين واحد الفلورية في الخلايا الحية. مراسل الفلورية المستخدمة في هذا الأسلوب يتكون من ثلاثة أجزاء: سلسلة استهداف الغشاء، وهي سريعة النضج، بروتين فلوري الصفراء وتسلسل الاعتراف البروتيني. وتنصهر translationally مراسل لمحطة-N من البروتين من الفائدة. تزرع الخلايا على مرحلة المجهر التحكم في درجة حرارته. كل خمس دقائق، وتصوير جزيئات نيون داخل الخلايا (وشارك في وقت لاحقمن خلال تحليل الصور unted مضان) وبعد ذلك photobleached بحيث يتم عد البروتينات حديثا فقط ترجمت في قياس المقبل. ويمكن تحليل الصور مضان الناتجة عن هذه الطريقة عن طريق الكشف عن البقع الفلورية في كل صورة، وتكليف لهم لخلايا فردية ومن ثم تعيين الخلايا لالأنساب الخلية. يتم حساب عدد من البروتينات التي تنتج داخل نافذة الوقت في خلية معينة بقسمة كثافة مضان متكاملة من البقع من جزيئات الشدة متوسط ​​الفلورسنت واحدة. استخدمنا هذا الأسلوب لقياس مستويات التعبير في حدود 0-45 الجزيئات في واحدة 5 دقائق الوقت في Windows. تمكين هذه الطريقة لقياس الضوضاء لنا في التعبير عن CI قامع λ، ولها العديد من التطبيقات المحتملة الأخرى في بيولوجيا الأنظمة.

وتظهر نتائج نموذجية من تجربة تتبع CoTrAC إنتاج CI قامع λ في أرقام 4 و 5. في هذه التجربة، تم تصوير 12 المستعمرات على فترات 5 دقائق. في كل نقطة زمنية، وautofocused أولا مستعمرة مركزية والتصوير داخل المنطقة. المقبل، وتركز على موقف تخزين / تركيزا وتم الحصول عليها صورة brightfield. وtranslocated ثم المرحلة من 0.5 ميكرومتر ~ على طول محور Z-الانتقال من الطائرة brightfield التنسيق إلى الطائرة التي تفصل بين شطري الخلايا (دون المرحلة التباين أو الفرق المقابل تدخل (DIC) البصريات، يمكن تصوير الأجسام شبه شفافة قليلا في خارج التركيز الطائرات 8). وأخيرا، تم الحصول عليها ست صور على فترات ثانية 1، ولكل منها التعرض ميللي ثانية 100 (الشكل 5 يظهر نقطة واحدة مثل هذا الوقت). وتكرر هذا لجميع الخلايا في كل نقطة زمنية. لأن تقريبا كل الجزيئات photobleached فينوس في كل timepoint، وfluoresالبقع المائة في أرقام 4 و 5 تتوافق مع الجزيئات التي نضجت فينوس (أصبح الفلورسنت) في 5 دقائق الماضية. جزيئات الزهرة تنضج بسرعة في الجسم الحي مع عمر نصف دقيقة 2-7 ~ 1، 2، 7 و الانقسام من Ubp1 فعال جدا 4 و 9. ولذلك، يمكن عدد جزيئات البروتين أنتجت منذ القياس بدقة الاستدلال مشاركة من عدد من الجزيئات فينوس تحسب على الغشاء. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50042/50042fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig1.jpg" /> الشكل 1. باستخدام CoTrAC لحساب تعبير عن جزيئات واحد عامل النسخ. (1) ويعبر عن مراسل TSR بما في ذلك تسلسل غشاء توطين وسريعة النضج فينوس YFP، واليوبيكويتين (UB) في الانصهار متعدية مع عامل النسخ من promotإيه ينظمها عامل النسخ. (2) والبروتيني Ubp1 شارك في translationally يشق على ببتيد الوليدة بعد بقايا C-UB المحطة الطرفية. (3) ومراسل TSR-فينوس-UB يموضع لغشاء حيث يمكن الاعتماد عليه في واحد جزيء المستوى. (4) وعامل النسخ يمكن تنظيم التعبير الخاصة بها. طريقة الكرتون. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig2.jpg" /> الشكل 2. توضع العينة في غرفة التخطيطي المستخدمة في التجارب CoTrAC. خلايا بين سادة هلام الاغاروز والزجاج غطاء. وتعقد Microaqueduct الشريحة وموضوعية عند درجة حرارة ثابتة باستخدام وحدة تحكم إلكترونية. تحضير العينة. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig3.jpg" /> الشكل 3. سير العمل لتجربة نموذجية CoTrAC. التجاربالعقلية سير العمل. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50042/50042fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig4.jpg" /> الشكل 4. وتظهر البيانات timelapse نموذجية من تجربة CoTrAC. صور من مستعمرة واحدة على فترات 25 دقيقة. في هذه التجربة، تم الحصول على بيانات كل 5 دقائق من 12 مستعمرات مختلفة. (A) الصور Brightfield. (B) صورة فينوس مضان (YFP) (خلفية طرح المتوسط ​​لحساب التغير في مجال التصوير خلفية كامل مع مرور الوقت). (C ) يظهر صورة التراكب توطين قطب من الجزيئات مراسل TSR-فينوس-UB وعدم التجانس في عدد الجزيئات تنتج في 5 دقائق وقت النوافذ في خلايا مختلفة (مقلوب brightfield الصورة والصورة هي فينوس ممر الموجة تصفية). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50042/50042fig4large.jpg" target="_blank">اضغط ساعة</a>يحرث لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم. <img alt="الشكل 5" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50042/50042fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig5.jpg" /> الشكل 5. نموذجية البيانات من نقطة مرة واحدة في تجربة CoTrAC. (A) فينوس (YFP) الصور مضان. تم الحصول عليها ستة 100 ميللي ثانية التعرض في بداية كل فترة دقيقة الوقت 5. تم فصل كل من التعرض بمقدار 900 ميللي ثانية 6 لإتاحة الوقت للجزيئات الزهرة الداكنة التي تراجعت عابر من أن تصبح الفلورسنت. (B) للتحليل، وطرح صورة 6 من الصورة 1 إلى تصحيح لجزيئات غير مقصورة الخلفية وتألق ذاتي. وقد تمت ترجمة هذه البقع في الصورة لخلية معينة الأنساب وكميا من حدتها مضان متكاملة. (C) ومضان متوسط ​​المتكاملة للمستعمرة في A يتم رسم أكثر من 6 صور (حتىخط الغطاء). تركيب هذا الخط إلى تسوس الأسي بالإضافة إلى تعويض ثابت (خط متقطع) يعطي تسوس نصف الوقت من 1 ثانية. في هذه التجربة، والزهرة جزيئات photobleach بسرعة أكبر بكثير من تألق ذاتي الخلوية، لذلك هذا يعني أن photobleached ما يقرب من نصف العدد الإجمالي للجزيئات فينوس في كل إطار. Photobleaching التقدم في نقطة زمنية واحدة.

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC)، لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. وقد استخدم هذا الأسلوب لمتابعة ديناميات التعبير العشوائية من عامل النسخ، وقامع λ CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

9.8K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC)، لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. وقد استخدم هذا الأسلوب لمتابعة ديناميات التعبير العشوائية من عامل النسخ، وقامع λ CI 1.

Video: Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

في المختبر والمجراة في ضوء بارد مراسل التصوير الجيني للخلايا منشأ جنينية بشرية

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes can be demonstrated by combining current measurements with a biotinylation approach to investigate the appearance of ion channel cleavage products at the cell surface. Functionally important cleavage sites can be identified by using site-directed mutagenesis.

مظاهرة من بروتين تفعيل قناة الصوديوم الظهارية (عناق) من خلال الجمع بين المقاييس الحالية مع الكشف عن الشق شظايا

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...