نشكر جمعية ماكس بلانك، وبرنامج العلوم الحدودي الإنسان (HFSP) وبورنغير إنغلهايم فون للتمويل والدعم.

1. إعداد المواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنابيب FEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف محطة إثراء الوقود أنبوب (الشكل 2A) من قبل بيغ السوائل (في الخطوات المذكورة أدناه) من خلال أنبوب وباستخدام حقنة مرفقة مع نهاية حادة قنية (الشكل 2B) ملاحظة 1:. استخدام القفازات في جميع أنحاء الداخلي ملاحظة 2: نوصي قطع الأنبوب في قطعة من كاليفورنيا. 1 متر في الطول وتنظيف تلك بالتوازي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أول تدفق أنبوب مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم بشكل متكرر. ثم نقل إلى أنبوب 50 مل أنبوب الطرد المركزي مليئة 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم وultrasonicate ذلك لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنبوب البوليمر لحوض صغير مع DDH 2 O. طرد الأنبوب الأول مع [ده 2 O ثم مع 70٪ ETOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق نقل أنبوب محطة إثراء الوقود إلى أنبوب الطرد المركزي الطازجة مع 70٪ ETOH. مرة أخرى هذا ultrasonicate أنبوب الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أنبوب محطة إثراء الوقود تنظيفها إلى قطعمن حوالي 3 سم (طول نموذجي للاستخدام في تصاعد الزرد والتصوير) وتصويب عليها إذا لزم الأمر. تخزين أنابيب FEP تنظيفها في 50 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة مليئة ده 2 O (الشكل 2C). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون تريكين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون 0.4٪ تريكين عن طريق إذابة 400 ملغ تريكين (MS-222) في 97.9 مل DDH 2 O. بعد مسحوق قد حلت تماما، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام 2.1 مل 1M تريس (الرقم الهيدروجيني 9.0). حماية الحل بعيدا عن الضوء. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3٪ ميثيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3٪ محلول ميثيل للطلاء الداخلي للأنابيب محطة إثراء الوقود كما هو موضح أدناه. تسخين E3 11 في زجاجة إلى ما يقرب من 60-70 درجة مئوية، وإضافة كمية مناسبة من مسحوق ميثيل. إضافة شريط التحريك وإثارة في 4 درجات مئوية. حالما يتم تبريد الحل وصولا الى أقل من 30 درجة مئوية، إضافة إلى حل تريكين ج النهائيoncentration من 100 ملغ / لتر. الحفاظ على اثارة في 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1.5٪ و 0.1٪ الاغاروز في E3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب كمية مناسبة من نقطة انصهار منخفضة مسحوق الاغاروز في حجم محدد من E3 في قارورة زجاجية. تسخين الخليط في الميكروويف والتخلص منه مرة واحدة في حين، حتى يظهر الحل الاغاروز متجانسة، من دون أي بلورات المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 مل aliquots من 0.1٪ الاغاروز حل في 1.5 مل أنابيب رد الفعل. يمكن تخزين aliquots في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحل 1.5٪ إلى معطف طبق بتري البلاستيكية. يجب أن يكون سمك طبقة الاغاروز كاليفورنيا. 2 مم. بعد توطد الاغاروز، إضافة E3 المتوسطة على أعلى من طبقة لمنعها من الجفاف. يمكن تخزين طبق المغلفة في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الزرد (دانيو rerio) البالغين والأجنة في 28.5 درجة مئوية، والتعامل معها وفقا للبروتوكولات المعمول 11،12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأسماك الذكور والإناث في فترة ما بعد الظهر وفصلها باستخدام المفرق. إزالة المفرق في صباح اليوم التالي لآخر التزاوج من الأسماك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة في صحن مليء E3 وفحصها باستخدام stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 24 HPF (أو المرحلة التنموية ذات الاهتمام الخاص بك)، حدد الجنين الزرد مضان للتعبير ونقل الإيجابية إلى طبق جديد مع E3 الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> dechorionate بعناية الأجنة باستخدام اثنين من ملقط حاد (أرقام 2D و 2E). استخدام ملقط لانتزاع أول وعقد المشيمه وملقط الثانية المسيل للدموع فتحه وتسحبه بعيدا ملاحظة 1: تنفيذ هذه الخطوة مع مساعدة من stereomicroscope. </li></ol></li></ol> 2. تصاعد متعدد الطبقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء أنبوب محطة إثراء الوقود <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق قنية نهاية حادة لحقنة. إدراج قنية بعناية لحوالي 3 ملم في واحدة من نهاية تنظيفها وقطع قطعة من. محطة إثراء الوقود أنبوب (أرقام 2F و 2G) ملاحظة 1: استخدام القفازات وتجنب الانحناء أو أي عصر من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع نهاية خالية من أنبوب محطة إثراء الوقود إلى 3٪ ميثيل وملء الأنبوب مع الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإفراج عن ببطء ميثيل بالضغط على حقنة. تجاهل الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.1.2 و2.1.3 باستخدام E3 ملاحظة 1: الأنابيب المغلفة بحاجة إلى أن تستخدم لتركيب على الفور. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الزرد إلى الاغاروز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين قسامة واحدة من 0.1٪ الاغاروز إلى 70 درجة مئوية في كتلة الحرارة. دوامة لفترة وجيزة أنبوب تفاعل وتحويلها إلى كتلة الحرارة لتعيين 38 ° C (الشكل 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ رد فعل أنبوب الخروج من كتلة الحرارة واتركها تبرد لفترة وجيزة. إضافة تريكين إلى تركيز النهائي من 133-200 ملغم / لتر ودوامة مرة أخرى (الشكل 2I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار واحد من الأجنة الزرد dechorionated وحوالة. ص إلى أنبوب تفاعل مع مسخن 0.1٪ الاغاروز باستخدام ماصة باستير الزجاج (أرقام 2J و2K) ملاحظة 1: في محاولة لنقل أقل قدر ممكن E3 إضافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق الجنين مع المرفقة حقنة محطة إثراء الوقود أنبوب (الشكل 2L). وينبغي أن تملأ أنبوب تماما مع 0.1٪ الاغاروز، مع الجنين وضعه على مقربة من طرفي الأنبوب ومع رئيس لافتا نحو افتتاح أنبوب ملاحظة 1: تأكد من تناول بعض الاغاروز قبل تناول الأسماك. ملاحظة 2: سحب بلطف شديد على حقنة لتجنب الفقاعات ملاحظة 3: الحفاظ على أنبوب في اتجاه أفقي لتجنب تسرب محتواه (أرقام 2M و2N). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنبوب <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. متعدد الطبقات المتزايدة للالأجنة الزرد. A) الإيثيلين البروبيلين المفلورة (محطة إثراء الوقود) أنابيب على أسطوانة كابل قبل التحضير. B) A المحاقن مع نهاية حادة قنية المرفقة. C) وتنظيفها وقطع أنبوب محطة إثراء الوقود. D، E) Dechorionation من 24 HPF الأجنة الزرد. F) ربط أنبوب إلى نهاية قنية حادة. G) والمحاقن مع قنية وأنبوب المرفقة. H) قسامة من 0.1٪ الاغاروز داخل أنبوب رد فعل حين نقله إلى كتلة الحرارة. الأول) vortexing لمن ذاب الاغاروز. J) من امتصاص الجنين dechorionated باستخدام ماصة الزجاج. K) نقل الجنين إلى الاغاروز ذاب. L) كمية من الجنين مع توضيح الاغاروز في أنبوب محطة إثراء الوقود. M، N) الجنين الزرد داخل أنبوب محطة إثراء الوقود . <stroنانوغرام&gt; O) قطع أنبوب بين العينة وقنية. P) يسد الأنبوب عن طريق استخدام طبق المغلفة الاغاروز. س) الجنين داخل أنبوب موصول. R) إعداد العينة النهائية في حامل معدني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا ل عرض صورة أكبر.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرة حلاقة لقطع أنبوب قبالة قنية (الشكل 2O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العصا ببطء نهاية الأنبوب الذي يحتوي على الأسماك من خلال طبقة كاملة من 1.5٪ الاغاروز في طبق من البلاستيك لسد الأنبوب (الشكل 2P) ملاحظة 1: تجنب تشكيل فقاعات ومحاولة الحصول على سطح المكونات على التوالي من خلال عقد . أنبوب بالضبط عمودي على سطح الاغاروز ملاحظة 2: تدوير الأنبوب قليلا للحصول على المكونات لطيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على العينة التي شنت في أنبوب 1.5 مل التفاعل مع E3 لتجنب التجفيف. العينة هو نآه جاهزة للتصوير. قبل التصوير، والتحقق ما إذا كان السمك هو يجلس على قمة المكونات (أرقام 2Q و2R). تأكد من إضافة أيضا إلى تريكين المتوسطة داخل غرفة التصوير في نفس التركيز كما في المتوسطة المتزايدة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy.">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li><li>Swoger, J., Muzzopappa, M., L&#243;pez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies.">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li><li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology.">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy.">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb. Prot. 2010 (5), (2010).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy.">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2002).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Jin, S. -. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -. N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li><li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+histone+variant+H2A.F/Z+and+a+transgenic+H2A.F/Z:GFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development.">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تقنيات الفحص المجهري المتقدمة مثل المجهر ورقة ضوء تمكننا من تسجيل بيانات الصورة مع القرار الزماني والمكاني عالية على مدى عدة أيام، ولكن أيضا تتطلب تقنيات تركيب العينة إلى تحسين. نقدم بروتوكول مفصلة من متعدد الطبقات المتزايدة للفحص المجهري ورقة ضوء التطور الزرد. طريقة واضحة لتنفيذ ونستخدمها في مختبرنا على أساس يومي. أنابيب FEP المكونات الأساسية لاستراتيجيتنا هي تركيب أنابيب مصنوعة من الإيثيلين البروبيلين البوليمر المفلورة (محطة إثراء الوقود). قررنا استخدام محطة إثراء الوقود في المقام الأول بسبب معامل الانكسار لها من 1.338، والذي يشبه إلى المياه وبالتالي فهي مناسبة بشكل مثالي للفحص المجهري ورقة خفيفة مع أهداف المياه وغمس العينة التي تتطلب الوسط المائي. الأنابيب مع 0.8 ملم وقطرها الداخلي 0.4 مم سماكة الجدار تناسب الزرد النامية بشكل جيد للغاية، ويمكن استخدامها مع أصحاب عينة نموذجية مناسبة لل1.6 مم<html> والشعيرات الدموية هي خيارنا الاول لطريقة عرض في تصاعد مستمر. نحن اختبار لهم بدقة في منطقتنا الاجهزة المدمج المنزل وكذلك في النظام التجاري &quot;Lightsheet Z.1&quot; من قبل كارل زايس المجهر وجدت أن أنابيب FEP توفر الاستقرار على المدى الطويل، لها تأثير ضئيل فقط على الأداء البصري وnonfluorescent هي 10. و، ومع ذلك، فإنها لا تتناسب مع عينات للتطبيقات التي تتطلب معامل الانكسار مختلفة، مثل مسح العينة. تتوفر أنابيب فضلا عن رقائق مصنوعة من محطة إثراء الوقود في مجموعة متنوعة من أقطار وسمك. بالإضافة إلى ذلك، محطة إثراء الوقود يمكن ذاب في 260 درجة مئوية، وبالتالي تقدم احتمالات لا نهاية لها تقريبا لعينة الدعم حسب الطلب في تصاعد مستمر. أنابيب البوليمر تميل إلى أن يتم توفير غير المعقمة، وهذا هو السبب يتضمن البروتوكول تنظيف عدة خطوات لضمان أفضل جودة البصرية. طلاء مع ميثيل يضمن أن أي جزء من الجنين الزرد المتزايد تتمسك البوليمر. الحمار = &quot;jove_step&quot;&gt; والمتوسطة المتزايدة ويستند القرار ل0.1٪ الاغاروز على اختبارات مكثفة من معدل النمو والجمود في تركيزات مختلفة من الاغاروز وميثيل 10. تركيزات الاغاروز أعلاه 0.1٪ وأظهرت بالفعل تأثير شديد على معدل نمو 24 HPF الزرد. بالإضافة إلى ذلك نستخدم جرعات منخفضة من تريكين المخدرات التخدير. إمكانات كتل تريكين العمل، مما يحول دون نقل الإشارات بين الدماغ والعضلات ويمنع تقلصات العضلات 16. A تركيز 133-200 ملغم / لتر يضمن تجميد كافية من الزرد بين 24-72 HPF. ومع ذلك، تريكين والمخدرات التخدير أخرى اختبرنا جرعة تظهر الآثار الجانبية تعتمد مثل الوذمة القلبية. بالإضافة إلى الجرعة المطلوبة من تريكين يختلف مع المرحلة التنموية للجنين. لذا نوصي الحد من تركيز تريكين إلى المبلغ اللازم للمراحل التنموية التي يتم تصويرها. لضمان أفضل الاداءم، ومنع تشكيل السامة والمنتجات، وينبغي أن تستخدم محلول المخزون تريكين الطازجة أو مطلق، محمية من الضوء وليس يسخن فوق 30 درجة مئوية. التضمين في أنابيب FEP يسمح أيضا للتعديل من السهل المتوسطة المتزايدة لحساب احتياجات محددة. للالوقت الفاصل بين التصوير من القلب، ونحن نوصي باستخدام 3٪ ميثيل و 100 ملغم / لتر تريكين بدلا من 0.1٪ الاغاروز و 200 ملغم / لتر للتركيب. ميثيل هو أكثر لزوجة من 0.1٪ الاغاروز وبالتالي توفير أعلى الجمود من تلقاء نفسه ويحتاج إلى أقل تريكين استخدامها لضمان الحبس من الجنين. تريكين حساس لدرجات حرارة تتجاوز 30 درجة مئوية، ويمكن أيضا أن تضعف من المتوسطة في غرفة التصوير، مما يؤدي إلى انخفاض الأداء والوخز ممكن من الجنين. لذلك، تأكد من استخدام تريكين أيضا في التصوير المتوسطة التي تغمر العينة التي شنت. إذا تجاربك تتطلب استخدام أعلىدرجات الحرارة، نوصي تبادل المتوسطة في غرفة التصوير إما باستمرار باستخدام نظام نضح أو يدويا مع أنبوب والمحاقن بين اثنين من نقاط الوقت. الخطوات الحاسمة الخطوات الحاسمة خلال عملية تركيب العينة هي كمية من العينة في أنبوب والإدراج من المكونات الاغاروز. يحدد كمية الموقف المبدئي للجنين، والتي هي مرهقة للتغيير بعد ذلك. يجب أن تكون العينات المتعددة المتاحة لتركيب وينبغي رصد نوعية تصاعد مع stereomicroscope. إذا كان التوجه عينة ليست مرضية، وتغيير سرعة وضع العينة وتجنب الحركات اللاحقة من المكبس قد تساعد في كثير من الأحيان وهذا يلوي الجنين. الاغاروز المكونات 1.5٪ ضروري لتجنب تسرب من الاغاروز 0.1٪. يجب أن يكون سطح المكونات داخل الأنبوب شقة لعدم التأثير على التوجه عينة خلال التنمية. لتحقيق الأمواج جيدةالآس، سمك طبقات مختلفة من الاغاروز تحتاج لفحصها ويحتاج الأنبوب ليتم وضعه في الاغاروز العادي إلى السطح. الدورية للأنبوب قليلا وسحب الأنبوب النشرات بعناية المكونات من الطبق. يجب فحص جودة التركيب مع stereomicroscope قبل التصوير. التصوير Multiview واحدة ميزة كبيرة من ورقة المجهر ضوء التصوير multiview، والقدرة على تدوير العينة، واكتساب ض أكوام من زوايا متعددة، وبعد ذلك تسجيل وتلتحم بها. طريقة أنشئت لتسجيل ض مداخن في الفضاء 3D هو تسجيل القائم على حبة باستخدام الخرز الفلورسنت المحيطة العينة كعلامات الائتمانية 17. ولكن هذه الطريقة تعتمد على وسيط الصلبة تصاعد مثل 1.5٪ الاغاروز وبالتالي يبدو لتكون متوافقة مع تصاعد متعدد الطبقات المقدمة هنا. ولكن العديد من الحلول البديلة تعمل بالاعتماد على التطبيق. أولا، يمكن للالخرز الفلورسنتأن تدمج المكونات الاغاروز، والتي يجب أن تكون في مجال الرؤية أثناء عملية الاستحواذ. الثانية، مواقف مرحلة يمكن معايرة قبل التجارب الفعلية باستخدام 1.5٪ العمود الاغاروز مع حبات الفلورسنت. الثالث، علامات بديلة مثل نوى الفلورسنت يمكن استخدامها لتحديد موقف ض مداخن بالنسبة لبعضها البعض. تبخر نموذجية الاجهزة المجهري ورقة ضوء استخدام حجرة العينة المفتوحة، الأمر الذي يؤدي إلى تبخر لا مفر منه على المدى المتوسط. منذ المتوسط ​​هو ضروري لبقاء العينة، لتقييد تبخر المتوسطة المتزايدة ومعامل الانكسار الصحيح بين البصريات وعينة، ونحن نوصي اتخاذ واحد أو أكثر من التدابير التالية لمنع التبخر. الأولى، والمتوسطة في غرفة يمكن تبادلها باستمرار من قبل نظام الارواء. الثانية، والمتوسطة يمكن تعبئتها يدويا. ثالثا، يمكن تغطيتها الغرفة مع غطاء أو رقائق مرنة. <pالطبقة = &quot;jove_step&quot;&gt; امدادات الاوكسجين تم تطوير محطة إثراء الوقود البوليمر على تحمل مجموعة كبيرة ومتنوعة من المواد الكيميائية وبالتالي فهي قوية، خامل كيميائيا وnonpermeable إلى الغاز. في حالة تصاعد الأكسجين متعدد الطبقات يمكن ان تخترق إلا من خلال المكونات الاغاروز واجهة الاغاروز الهواء، ولكن يبقى أن يظهر إذا امدادات الاوكسجين في تركيب متعدد الطبقات أقل بشدة بالمقارنة مع 1.5٪ في تصاعد الاغاروز دون دعم أنبوب البوليمر. لكن، وكما تصاعد في 1.5٪ الاغاروز يمكن أن تستخدم إلا لمدة ساعتين تقريبا قبل يتأثر التشكل الزرد متعدد الطبقات تصاعد يبدو أن الحل الشامل للتصوير متفوقة على المدى الطويل. تصوير المراحل الأولى من التطوير متعدد الطبقات المتزايدة أصبح الآن لدينا تقنية التضمين القياسية للفحص المجهري ورقة ضوء الوقت الفاصل بين الزرد الأكبر سنا من 24 HPF. وبالاضافة الى ذلك، ونحن أيضا استخدام أنابيب البوليمر لتصوير الأجنة مرحلة مبكرة. البريدتبقى mbryos في chorions وتقام في أنبوب محطة إثراء الوقود مع القطر الداخلي من 1 ملم ومليئة E3. الزرد يمكن أن تتطور بحرية داخل المشيماء ومازال يمكن تصويرها بشكل جيد باستخدام المجهر رقة الخفيفة. توقعات وقدم عينة متعدد الطبقات تصاعد تطلق العنان لكامل إمكانات المجهر ضوء ورقة في الوقت الحقيقي البيولوجيا التطورية مع الزرد. يمكن بسهولة أن يتم اعتمادها لتقنيات الفحص المجهري أخرى مثل التصوير المقطعي البصري الإسقاط (الأراضي الفلسطينية المحتلة) والكائنات الحية الأخرى. ونحن نعتقد أن محطة إثراء الوقود أنابيب من الحجم العادي ليست سوى الخطوات الأولى نحو تقنيات التركيب عينة مصممة خصيصا لتلبية الاحتياجات المحددة.

لفهم الأحداث والتفاعلات المعقدة خلال مرحلة التطور الجنيني، والبحوث في البيولوجيا التطورية هو المزيد والمزيد من التحرك من المجهري للخلايا وحيدة وأجهزة لفي الجسم الحي التصوير من الكائنات بأكملها. تفشل تقنيات الفحص المجهري التقليدية عادة لتقديم القرار المكانية والزمانية لمتابعة الأحداث السريعة على مدى فترة طويلة من الزمن، وغالبا ما تسبب تبيض أو التأثيرات الضوئية في العينة 1. نحن وغيرنا وجدت ورقة المجهر الضوئي (الشكل 1) أن الأسلوب المثالي لفي الجسم الحي التصوير من الزرد 2-4. إضاءة العينة مع ورقة رقيقة من ضوء الليزر، ومتعامد على محور الكشف، ويقدم باجتزاء بصري سريع لقرار مكانية عالية وكذلك التقليل من الصور سمية 5. في نفس الوقت، ونتيجة لهذا الترتيب بصرية فريدة من نوعها، وتقنيات التركيب عينة التقليدية باستخدام أطباق بتري أو دوائر الثقافة ليست مناسبة. في ضوء نموذجيالمجهر رقة ثلاثة محركات متعدية ومحرك التناوب عقد العينة، بحيث يمكن وضعه على وجه التحديد، وتحولت وينظر إليها من أي اتجاه. في العينات للفحص المجهري ورقة الماضي الضوء وغالبا ما كان جزءا لا يتجزأ من 1-2٪ الاغاروز داخل الزجاج الشعرية 6،7. في هذه الحالة هو مقذوف الاسطوانة الاغاروز طدت مع العينة جزءا لا يتجزأ من الزجاج الشعرية في حجرة العينة مليئة المتوسطة مثل الماء للتصوير. الاغاروز لديها معامل الانكسار على مقربة من المياه وبالتالي فهي مناسبة تماما لفي الجسم الحي المجهري ورقة الخفيفة التي يسهل الإضاءة والكشف البصريات تصحيح الماء. يقتصر العينة في الاغاروز جامدة ويمكن تصويرها بشكل جيد لفترة قصيرة من الوقت، ولكن يعانون من ضعف بشدة التغييرات التخلق ونمو الجنين عند التصوير لعدة ساعات 7،8. على الرغم من حلول لتطبيقات أخرى تم تطويرها 9، وموسع على المدى الطويل الوقت الفاصل بين الزرد<html> إمكانية التصوير المجهري ورقة ضوء لا يمكن استغلالها باستخدام التقليدية 1.5٪ الاغاروز التضمين. لذا قمنا بتطوير استراتيجية جديدة للتصاعد في الجسم الحي المجهري ورقة ضوء الأجنة الزرد 10. هي التي شنت العينة في 0.1٪ الاغاروز مع 200 ملغم / لتر تريكين داخل أنبوب مصنوع من البوليمر واضحة بصريا المفلورة الإثيلين البروبيلين (محطة إثراء الوقود). الجنين جزءا لا يتجزأ من تطور عادة بسبب اللزوجة المنخفضة من المتوسط. في نفس الوقت، وأنبوب محطة إثراء الوقود يحصر المتوسطة وعينة لمدة التجربة. ونحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتقنية جديدة وتركيب البيانات الحالية تعكس مزاياه عبر بروتوكول التقليدية. علينا أن نبرهن أنه مع أسلوبنا التنمية الزرد يمكن تصويرها بشكل مستمر مع القرار المكانية والزمانية عالية على مدى فترة من أكثر من يومين. 5IN &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. مبدأ المجهر رقة الخفيفة. يمكن ترجمتها A الزرد شنت في أنبوب مصنوع من الإيثيلين البروبيلين المفلورة (محطة إثراء الوقود) واستدارة من خلال البؤري للهدف الكشف. ومن المتوقع ورقة رقيقة من ضوء الليزر (ورقة الضوء) عن طريق الهدف الإضاءة في المستوى البؤري للهدف الكشف وينير سوى جزء البصرية رقيقة من العينة. يتم جمع إشارة مضان المنبعثة من الهدف كشف وتسجيلها على شريحة الكاميرا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

المجهر الضوئي ورقة هي تقنية التصوير المثالي لدراسة التطور الجنيني الزرد. بسبب الحد الأدنى الصور سمية والتبييض، ويناسب ذلك وخاصة على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير على مدى ساعات طويلة تصل إلى عدة أيام. ومع ذلك، هناك حاجة إلى استراتيجية مناسبة تركيب العينة أن يقدم كل من الولادة والتطور الطبيعي للعينة. متعدد الطبقات المتزايدة، وهي تقنية جديدة باستخدام التضمين المنخفضة تركيز الاغاروز في أنابيب واضحة بصريا، ويتغلب الآن هذا القيد وتطلق العنان لكامل إمكانات المجهر ضوء ورقة في الوقت الحقيقي البيولوجيا التطورية.

التصوير Multiday من اسماك الزرد الأوعية الدموية التنمية نستخدم 1 DPF تيراغرام (kdrl: GFP) 13 الزرد للتدليل على مزايا استراتيجية متعددة الطبقات المتزايدة على المدى الطويل المجهري ورقة الخفيفة. والهدف من ذلك هو صورة تطوير الأوعية الدموية في الزرد بأكملها على مدار أيام 2. وقد شنت الجنين الزرد في 0.1٪ الاغاروز داخل ميثيل المغلفة أنبوب البوليمر. هنا، لا يقتصر الزرد من تصاعد المتوسطة ويمكن أن تتطور بشكل طبيعي. يرفع رأسه، والذيل يمتد ويظهر تنتشر الأوعية الدموية دون عوائق (الشكل 3). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> الشكل 3. التصوير Multiday للتنمية الأوعية الدموية الزرد. والأوعية الدموية من multilaشنت ريال يمني 1 DPF تيراغرام (kdrl: GFP) 13 الزرد يتطور دون عوائق في ضوء المجهر رقة على مدار يومين. ورقة ضوء الليزر 488 نانومتر متحمس مضان وتم الكشف عن إشارة باستخدام 10X/0.3 الهدف W وكاميرا EMCCD. تم الحصول عليها Z-المداخن على أربعة مناصب المتاخمة كل 10 دقيقة ومخيط مع فيجي 15 في وقت لاحق. وتظهر التوقعات كثافة اكبر من مجموعة فرعية من نقاط الوقت. شريط مقياس: 500 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> التصوير من اسماك الزرد مرحلة التطور الجنيني المبكر هنا، علينا أن نظهر قدرة أنابيب محطة إثراء الوقود كوسيلة لدعم تصاعد للفحص المجهري ورقة ضوء مرحلة التطور الجنيني المبكر الزرد خلال اليوم الأول بعد الإخصاب. 8 HPF تيراغرام (H2A: GFP) أقيم 14 الجنين الزرد مع المشيمه لها سليمة داخل أنبوب E3 شغل مع طقطر nner من 1 ملم. أن النتائج في لقط طفيف في المشيمه. جميع العمليات التنموية خلال مرحلة التطور الجنيني لا تتأثر التركيب ويمكن تصور أمثل باستخدام المجهر رقة الخفيفة. في هذا المثال، ونحن تصوير العينة على مسار 12 ساعة (الشكل 4). يتغير شكل نموذجي خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، مثل استطالة متزايدة من صفار البيض وسماكة الأنسجة على طول خط الوسط، سيكون المظلوم عند استخدام التركيب التقليدية دون المشيماء في 1.5٪ الاغاروز. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> الشكل 4 التصوير في وقت مبكر من مرحلة التطور الجنيني الزرد A تيراغرام (H2A: GFP). يمر 14 الزرد خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. تم الكشف عن ورقة ضوء الليزر 488 نانومتر GFP متحمس وإشارة مضانمع الهدف W 10X/0.3 وكاميرا EMCCD. تم الحصول عليها Z-أكوام من زاويتين كل 3 دقائق على مدار 12 ساعة. وتظهر التوقعات كثافة اكبر من تطبيع مجموعة فرعية من مرور الوقت. مرئية الضبابية في 19 HPF النتائج من الوخز الجنين خلال الاستحواذ، حيث تم استخدام أي مخدر. شريط مقياس: 150 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish at JoVE.com

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

يمكن اتباعها لتطوير الزرد خلال الأيام مع المجهري ورقة الضوء عندما يتم تضمين الأجنة في أنابيب البوليمر واضحة بصريا مع منخفضة التركيز الاغاروز.

متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

multilayer-mounting-for-long-term-light-sheet-microscopy-of-zebrafish

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  يمكن اتباعها لتطوير الزرد خلال الأيام مع المجهري ورقة الضوء عندما يتم تضمين الأجنة في أنابيب البوليمر واضحة بصريا مع منخفضة التركيز الاغاروز. 

Video: Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

إعداد ذبابة الفاكهة خلايا S2 الميكروسكوب لايت

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل<em&gt; في توتو</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; التنمية

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

المجهر الضوئي ورقة الإسفار من جذور النباتات التي تنمو على سطح الأرض من هلام

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA، طريقة لتركيب Drosophila Larva للتصوير على المدى الطويل الفاصل الزمني

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.