Name: a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development
Uploaded: 2017-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development at JoVE.com

Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. הכנת פתרונות ומשך מחט זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 25x של Tricaine (3-אמינו אתיל אסתר חומצה בנזואית, המכונה גם אתיל 3-aminobenzoate) בשעה 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב 20 מ&quot;מ טריס pH 8.8 ולהביא פתרון זה ב- pH 7. Aliquot ב -4 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C. הערה: Tricaine ההרדמה פועל באופן מועדף על תעלות נתרן מתח מגודרות עצביות ובכך חוסם שרירי עוויתות ותנועה 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של Tricaine בריכוז סופי של 0.17 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במדיום העובר E3. 7 הערה: הפוך את Tricaine פתרון עובדת מראש כמו ה- pH של פתרון זה נסחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את נקודת התכה נמוכה agarose לריכוז סופי של 1.5% בטווח הבינוני העובר E3 בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל על ידי חימום הפתרון במיקרוגל. תנו פתרון זה לאזן ל -42 - 45 ° C באחת באמבט מים או בחממה הספסל העליון. אם מכינים מנות גדולות עבור אנכיהדמית אור גיליון (שלב 4), לבצע 25 מיליליטר נוסף של 1% היתוך תקן agarose במדיום עובר E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זכוכית בורוסיליקט עם נימים נימה עם ממדים של 1.20 מ&quot;מ OD, מזהה 0.69 מ&quot;מ, אורך 10 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נימים נמשכים לסוג חולץ מחט חימום-נימה שמתואר בטבלה של ציוד ריאגנטים, השתמש את ההגדרות הבאות: חום 600, משיכת 120, מהירות 50, זמן 225, לחץ 500. עם זוג מלקחיים חדים, הפסקה המחט בעבר רק את הנקודה שבה זה מכופף ליצור מחט נקי וחד עבור orientating עוברים והסרת agarose עודף. אזמל מיקרו-כן, ניתן להשתמש כדי להסיר agarose עודף. </li></ol> Embedding 2. עוברים על הפוך או מיקרוסקופי Upright <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העוברים עד השלב המתאים במדיום העובר E3. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב נדרש, עובר dechorionate עם זוג מלקחיים חדים מתחת dissec המשקףמיקרוסקופ טינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים dechorionated עבור 5 דקות לפחות הפתרון עובד Tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון agarose מומסת מתקרר ל -45 מעלות צלזיוס, השתמש פיפטה זכוכית פסטר להעביר את העובר dechorionated ישירות לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל עם העברת מינימלי של מדיום E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר העובר יחד עם כ 1 מ&quot;ל של הרכבה בינונית ומוסיפים כ. 100 μl של הרכבה בינונית יחד עם העובר למעגל המרכזי של צלחת פטרי 35 מ&quot;מ עם תחתית זכוכית עם microwell 10 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל הרכבה בינונית שוקעת, להזיז את העובר עד קצה המעגל של agarose עם הזנב כלפי חוץ (איור 1 א). השתמש מחט הנימים לשמור על העובר בכיוון לרוחב הרצוי עד ג&#39;ל מוגדר לחלוטין. כדי פיתוח גוף התמונה האחורי, לטפל להתמצא העובר כמו לרוחב אוריינטציה ככל האפשר. לכן, לשמור על העובר בתפקיד זה על ידי adjustmen הזהירts עם המחט נימי. הערה: ניתן להוסיף עוברים מרובים כדי בצלחת גוברת בשלב זה, אם נדרש. אם זה המקרה, להעביר את נמוכה להמיס agarose לתוך המנה הראשונה ולהוסיף את העוברים למרכז הירידה agarose. לאחר מכן, דחף את העוברים אל הקצוות של הטבעת הזכוכית להתמצא לתוך המיקום הרצוי. עד שישה עוברים יכול להיות מותקן בדרך זו לפני agarose הופך הקרושה. </li></ol> הסרת 3. עודף Agarose סביב הגוף האחורי הערה: סעיף זה מתאר את ההליך שבאמצעותו agarose יוסר האזור שמסביב הגוף האחורי. במקרה של התארכות הגוף האחורי, חשוב להבטיח כי הזנב יכול לגדול-אאוט כרגיל. על ידי הסרת agarose לאחר שהעובר נכללה לחלוטין על ידי agarose, העובר ונותר מוקפת באזור הראש כמחצית שק החלמון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ירידת agarose קבעה, להציף את di פטריsh עם הפתרון עובד Tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ המשקפת לנתח עם בסיס מועבר-אור, להתאים את המיקום במראה זווית אור האירוע כזה כי הניגוד החזק מאפשר קיצוץ agarose להיראות בבירור במהלך כל הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע לחתוך 1 (איור 1), השתמש מחט נימי או-אזמל מיקרו לחתוך את אמצע הדרך agarose לאורך חלמון, מתוך עמדה רק האחורי לשדה הלב להרכיב את עמדת somite 5 (5 th somite הקדמי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את החתך הראשוני סמוך ללב להרכיב כמוצג, והדרך מלאה דרך agarose אל הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את נימי או מיקרו-אזמל עמוק בתוך agarose, וראיתי לאט ולמטה תוך מתחילים לעשות חתך ארוך על העובר כפי שמוצג באיור 1. גזור קרוב לעובר ככל האפשר ללא ניקוב העובר או חלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לבצע חתכים 2 ו -3 (איור 1 </strong&gt;), החל מעמדת נגד העובר ועם לחתוך הולך כל הדרך למטה אל הכוס תחתית צלחת. הפוך לחתוך 2 כך שהוא משיק 5 somites הראשון, המאפשר dorsalward מלא התגלגלות של הגוף האחורי. הפוך לחתוך 3 בזווית של 90 מעלות עם משטח החלמון החל HEARTFIELD. הערה: חיתוך agarose עד קצה עיגול זכוכית (כפי שמוצג באיור 1) עזרי בהסרת agarose כבלוק שלם (שלב 3.6). עם זאת, זה לא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בצומת של חתכים 1 ו -3, לעשות חתך אלכסוני איטי לקראת סוף לחתוך 2 תוך הרמת לאט כלפי מעלה על מנת לשחרר את הכיכר של agarose המקיפים את הגוף האחורי. הערות: במקרים מסוימים, זה ישוחרר בבלוק אחד בתום הניתוח בבת אחת. במקרים אחרים, זה עלול לקחת כמה ניסיונות דיס-Lodge כל agarose סביב העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג מלקחיים חדים, להסיר את b וחלצהמנעולים של agarose מן המדיום העובר. כדי לסייע בתהליך זה, להעביר את חתיכות agarose אל דופן הכלי ולהשתמש קיר צלחת פטרי כתמיכה תוך הרמת את חתיכות agarose. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> איור 1: תרשימים של גדר קופצת שמה. (א) התרשים מראה את המיקום של העובר רכוב בתוך טבעת זכוכית במרכז צלחת פטרי. מימין זום של העובר עם כל חתך רצוף דרך הסובבים לראות agarose עם קווים אדומים dottted. (ב) עוברי הרכוב diagrammed לאור לרוחב הצגת קלות הגישה לשתי מטרות הפוכות וזקופות. (ג) digram דומה מראה כיצד עובר יכול להיות מותקן עבור קופצים להגדיר הדמית גיליון אור אנכית. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">אנא CL</a>איכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התכווצויות שרירים אינה חסומה לחלוטין בנקודה זו, להוסיף טיפות Tricaine מפתרון המניות של 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל, pH 7. </li></ol> 4. הרכבה של עוברים אנכיים אור גיליון מיקרוסקופי הערה: זוהי וריאציה על השיטה שתוארה לעיל המאפשרת הגישה של יעדים מרובים עבור הדמיה של דגימות ידי SPIM אנכית-חוקית. הרעיון מאחורי וריאציה זו הוא להרים המדגם גבוה במעט התחתונה של המנה, כדי לאפשר גישה קלה של שתי מטרות הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לדגום הרכבה, מעיל צלחת פטרי פלסטיק 100 מ&quot;מ עם agarose 1% בטווח הבינוני E3 עד לגובה של 5 מ&quot;מ ולאפשר להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של 1 מ&quot;ל agarose נקודת התכה נמוכה אל מרכז הצלחת ולאפשר להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים שבץ agarose נקודת התכה נמוכה כמו בסעיף 2. עם זאת, הפעם, להסיר את העובר מהצינור 50 מ&quot;לagarose של עם ירידה קטנה של פתרון (0.5 מ&quot;ל) ומקום טיפה קטנה זו על גבי 1 מ&quot;ל לרדת במרכז המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מחט הנימים למקם את העובר במרכז הטיפה הקטנה ולשמור הכיוון הנכון שלה עד מוגדר ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציף את המנה עם פתרון Tricaine עבודה להסיר את agarose העודף כאמור בסעיף 3 אבל בלי לחתוך דרך הכרית של 1% agarose הסטנדרטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

טכניקה זו מאפשרת הרכבה עוברת להישמר עדיין במהלך העברת המיקרוסקופ ושוב לטווח ארוך ניסויי הזמן לשגות הדמיה שמטרתה הבאה התארכות גוף אחורית בסקאלות אורך המרובה. יתר על כן, זה הוא תכליתי בכך שהיא מאפשרת הדמיה משני מיקרוסקופיה זקוף הפוך בחרו קופץ, וכן המלצה ניתנת למען איך ...

התארכות גוף האחורית היא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו העובר משתרע מהווה חלק גדול של ציר הגוף. זוהי דוגמא של תהליך מורכב המוךפו&quot;גנטי שהולך שבאמצעותו התנהגויות תאים מרובות לפעול בצורה מתואמת כדי ליצור את morphogenesis ברמה של רקמות פרט. דפורמציות רקמות הפרש אלה ולאחר מכן לפעול יחד כדי ליצור את ההתארכות של הגוף האחורי ברמת המבנה כולו. כדי להבין כיצד תהליכים אלה נשלטים ומתואמים במהלך פיתוח, אנחנו חייבים להיות מסוגלים לעקוב אחר התהליכים האלה בקני מידה מרובות (כלומר ברמה של מולקולות, תאים, אוכלוסיות תאים ורקמות) ולהתייחס זה ישירות morphogenesis של המבנה כולו . עוברי דג זברה הם אידיאליים עבור התארכות גוף אחורי הדמיה כמו השקיפות האופטית שלהם והגודל קטן מאפשרים ליישום הדמית אור פולשנית מתקרבים גם מתאים ליבהדמית דואר. 1 זה כבר שמעיד סדרת הפרסומים האחרונים כי שפכו אור על התפתחות גוף אחורית ברמה של מולקולות, 2 תאים בודדים, 3 והתנהגויות בין רקמות, 4 וכן ברמה של אוכלוסיית תא כולו איברים. 5 שיטות הדמיה מתקדמות כגון confocal, מיקרוסקופיה-פוטון רב מיקרוסקופיה תאורת מטוס סלקטיבית (SPIM) מאפשרות הדמיה לטווח הארוך של תהליכים התפתחותיים עם ירידת ההשפעה רעילה אור צילום לבן. טכניקות חזקות עבור ההרכבה של דגימות חיות נדרשות להשיג שלוש מטרות: 1) תמיכה מספקת כדי לשמור על דגימות בכיוון הנכון במהלך העברה המיקרוסקופ במהלך רכישה, 2) חופש מספיק תנועה של המדגם כדי לאפשר את התולדה של באזור הגוף האחורי מבלי להשפיע devel הרגילopment, ולבסוף 3) במידה מסוימת ב צדדי של שיטת ההרכבה לאפשר הדמיה על סט-אפ הדמיה המגוון. פרוטוקול זה מציג טכניקת הרכבת הדמיה בפיתוח של דג הזברה ד rerio. טכניקה זו כרוכה הרכבה עוברים כך אזורים שק ראש וחלמון כמעט כלולים כולו agarose, תוך השארת באזור הגוף האחורי להאריך ולהתפתח באופן תקין. ככזה, הוא גם בשיטה מתאימה ההדמיה לטווח הארוך של אזורים אחרים בגוף מתפתח כמו agarose מאפשר הדמיה על ידי שיטות הדמית אור רגילות. פרוטוקול זה מדגים הרכבה של עוברים בכיוון לרוחב, אם כי אפשר גם לעלות עוברים אוריינטציות alterative. עוד יציגו כיצד להתאים את השיטה עבור זקוף, פנימה ובמאונך setups מיקרוסקופ אור גליון.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass</td></tr><tr><td>Capillaries for injection needles</td><td>&amp;nbsp;Sutter&amp;nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td></td><td></td><td>230 mm long</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting point agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&amp;nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&amp;nbsp;</td><td>11252-30&amp;nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Needle puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P97</td><td>Heating-filament needle puller</td></tr><tr><td>Binocular dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

עוברי דג זברה להציע מערכת ניסיונית אידיאלית ללמוד תהליכים מורכבים המוךפו&quot;גנטי שהולכים בשל קלויות נגישות ושקיפות אופטית שלהם. בפרט, התארכות גוף האחורי הוא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו דפורמציות רקמות מרובות לפעול יחד כדי לכוון את ההיווצרות של חלק גדול של ציר הגוף. על מנת להתבונן בתהליך זה על ידי הדמיה לטווח ארוכת זמן לשגות יש צורך לנצל טכניקת הרכבה המאפשרת תמיכה מספקת כדי לשמור על דגימות בכיוון הנכון במהלך העברת המיקרוסקופ והרכישה. בנוסף, ההרכבה חייבת גם לספק חופש מספיק תנועה של התולדה של אזור הגוף האחורי מבלי להשפיע ההתפתחות התקינה שלו. לבסוף, חייב להיות מידה מסוימת ב צדדי של שיטת ההרכבה לאפשר הדמיה על סט-אפ הדמיה המגוון. כאן, אנו מציגים טכניקת הרכבת הדמיה בפיתוח elongatio גוף האחוריn של דג הזברה ד rerio. טכניקה זו כרוכה הרכבה עוברת כך אזורי צק הראש והחלמון כמעט כלולים כולו agarose, ומותיר מחוץ לו באזור הגוף האחורי להאריך ולהתפתח באופן תקין. אנו נראים כיצד זה יכול להיות מותאם עבור קופצים להגדיר מיקרוסקופ זקוף, הפוך ואנכי אור גיליון. בעוד פרוטוקול זה מתמקד הרכבה עוברת הדמיה של הגוף האחורי, זה יכול בקלות להיות מותאם עבור הדמית החיה של היבטים רבים של פיתוח דג זברה.

הפרוטוקול שתואר לעיל פרטי שיטה תכליתית עבור ההרכבה של עוברי דג זברה עבור הדמית הזמן לשגות לטווח ארוך. דוגמא לכך היא שמוצגת באיור 2 א ו בסרטון אנימציה / וידאו איור 1. עוברים הוזרקו בשלב 1 תא עם mRNA המקודד את החלבון פלורסנט photoconvertible kikumeGR...

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development at JoVE.com

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Views.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Video: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biology

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

ניתוח התכווצות הלב של דגי זברה עם אינטראקציית מציאות מדומה

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

מחבר זרקור: דימות גיליון אור ברזולוציה גבוהה 4D ומציאות מדומה בדגי זברה לניתוח תא יחיד של תפקוד הלב

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Bioengineering

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה