المؤلفون ممتنون لأليساندرا موريتي ودينيس شايد للمساهمة عينية من المواد. ونحن نعترف الدعم الكبير من الفريق العامل الجذع وEHT في وزارة التجريبية الأدوية والسموم من UKE. ويدعم هذا العمل من المؤلفين من المنح المقدمة من DZHK (المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية) والوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث (BMBF)، مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG إس 88 / 01/12، HA 3423 / 5-1 )، المركز الوطني البريطاني لاستبدال صقل والحد من الحيوانات في البحوث (NC3Rs CRACK-IT تمنح 35911-259146)، ومؤسسة القلب البريطانية RM / 13/30157، والمجلس الأوروبي للبحوث (متقدم غرانت IndivuHeart)، ومؤسسة القلب الألمانية وفراي اوند Hansestadt هامبورغ.

<ol>
	<li>Laverty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines?.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines?.</a> Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Burridge, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture.">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Mannhardt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Engineered+Heart+Tissue:+Analysis+of+Contractile+Force.">Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).</li><li>Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+proarrhythmic+drugs+on+relaxation+time+and+beating+pattern+in+rat+engineered+heart+tissue.">Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue.</a> Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).</li><li>St&#246;hr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+abnormalities+and+altered+drug+response+in+engineered+heart+tissue+from+Mybpc3-targeted+knock-in+mice.">Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice.</a> J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).</li><li>Schaaf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Engineered+Heart+Tissue+as+a+Versatile+Tool+in+Basic+Research+and+Preclinical+Toxicology.">Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology.</a> PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).</li><li>Hansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Frank, S., Zhang, M., Sch&#246;ler, H. R., Greber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-assisted,+line-independent+maintenance+of+human+pluripotent+stem+cells+in+defined+conditions.">Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions.</a> PloS One. 7 (7), e41958 (2012).</li><li>Lanier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+inhibition+correlates+with+human+embryonic+stem+cell+cardiomyogenesis:+A+structure-activity+relationship+study+based+on+inhibitors+for+the+Wnt+response.">Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response.</a> J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).</li><li>Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy:+a+new+in+vitro+model.">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model.</a> Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).</li><li>Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Tyrosine+Kinase+Inhibitor-Mediated+Decline+in+Contractile+Force+in+Rat+Engineered+Heart+Tissue.">Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue.</a> PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).</li><li>Friedrich, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+FHL1+as+a+novel+disease+gene+for+isolated+hypertrophic+cardiomyopathy.">Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy.</a> Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).</li><li>Crocini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+ANKRD1+mutations+associated+with+hypertrophic+cardiomyopathy+on+contraction+parameters+of+engineered+heart+tissue.">Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue.</a> Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).</li><li>Fiedler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Long+Noncoding+RNA-Based+Strategies+to+Modulate+Tissue+Vascularization.">Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization.</a> J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).</li><li>van Meer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays.">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).</li><li>Godier-Furn&#233;mont, A. F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic+force-frequency+response+in+engineered+heart+muscle+by+electromechanical+stimulation.">Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation.</a> Biomaterials. 60, 82-91 (2015).</li><li>Eng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nat Commun. 7, 10312 (2016).</li><li>Huebsch, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+iPS-Cell-Derived+Cardiac+Muscles+for+Physiologically+Relevant+Drug+Response+Analyses.">Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses.</a> Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).</li><li>Masumoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages.">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).</li><li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Non-myocyte+Cells+Show+Enhanced+Pharmacological+Function+Suggestive+of+Contractile+Maturity+in+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocyte+Microtissues.">Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues.</a> Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durg-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li></ol>

IM، TE وAH هي شارك في تأسيس EHT تقنيات محدودة، وألمانيا.

تقدم المهندسة أنسجة القلب خيار قيمة إلى مربع أداة للبحوث القلب والأوعية الدموية. وقد أثبتت EHTs في شكل 24-جيدا قيمة لنمذجة مرض 8، 14، وفحص سلامة الدواء 7، 8، 10، 11، 15، أو البحث القلب والأوعية الدموية الأساسية 16 و 17. وتشمل التعديلات المحتملة للبروتوكولات EHT الأساسية دراسات على التفاعل الخلوي مع خليط محددة من العضلية وغير العضلية-18 وتعزيز حمولة تلوية 14. جوانب هامة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتشمل نوعية السكان الخلية المدخلات ونوعية الفيبرينوجين. إذا كان تشكيل هلام الأولي هو عدم انتظام أو عدم الاتفاق بما فيه الكفاية لعصا رس المشاركات PDMS، أو إذا تحولت جل بسرعة في غضون بضعة أيام بعد الصب نظرا لتركيز أبروتينين منخفضة، جيل EHTs لن تكون ناجحة. القيود التالية يتعين النظر. (ط) الإنتاجية في شكل 24-جيدا ليست مناسبة تماما لإعداد غربلة أولية، ولكن غير كافية لشاشة تأكيد الثانوية. (ب) وقراءات المتكاملة للقوة، حركية التقلص وإيقاع لها خصوصية منخفضة، مما يجعل من الصعب ربط التغيرات في قوة الآليات الجزيئية محددة. (ج) في حين أن شكل ثقافة 3D وتمتد تفرضها المشاركات PDMS عازمة على تحسين الجوانب الشكلية والوظيفية من النضج، عدم وجود أقراص مقحم الحقيقية، والضرب العفوي، وأقل من الردود الأدرينالية العادية تشير إلى أن نضوج القلب الكامل لم يتحقق بعد مع هذا البروتوكول. (د) وقد تبين PDMS على امتصاص الأدوية المختلفة لمختلف تمديد 19 وويركز فعال الفعليأيون على EHTs قد تختلف. قد يكون هذا التحيز أكثر بروزا في السمية المزمنة يدرس 15 من تلك بالتحقيق آثار المخدرات الحادة 7 و 8 و بشكل واضح يعتمد على الدواء في متناول اليد. ونتيجة لذلك، أي رف PDMS يتعرض للأدوية يجب التخلص منها بعد الاستخدام وسوف امتصاص المحتمل من الأدوية المختلفة يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند تحليل البيانات. (ت) ونظرا لأنه يطلب من 1X10 6 hiPSCs في EHT التكاليف لكل نقطة بيانات مرتفعة. وتكمن أهمية هذا البروتوكول بالمقارنة مع تحليل انقباض القلب خارج الجسم الحي هو القدرة على العمل في النظام البشري، وعدم التجريبي متهدم، وإنتاج موحد من EHTs الذي يسمح بإعداد دراسات كبرى حول خلفيات وراثية محددة (مثل النمذجة المرض ). بالمقارنة مع غيرها من النظم اختبار hiPSC (متعدد مجموعة الكهربائي، مقاومة)، وهذا النظام تحليلالصورة قوة مقلص كمعلمة الفسيولوجية أهم العضلية في بنية ثلاثية الأبعاد وتتيح زراعة تحت حمولة محددة. عقد EHTs بانتظام وفي قوة مستقرة والتردد والإيقاع على مدى عدة ساعات وأسابيع، مما يتيح قياس وتقييم السمية المزمنة على المدى الطويل. يمكن إجراء تحليل EHT تحت التحفيز الكهربائي وهو أمر مهم بالنسبة للعلاقة قوة التردد من تقلص العضلات والتأثير المحتمل على آثار المخدرات. وفيما يتعلق بالوضع غير ناضج من hiPSC-CM، التحفيز الكهربائي لديه القدرة على دفع الخلايا نحو النمط الظاهري أكثر نضجا 20 و 21 و يمكن أن تدرج في صيانة EHT. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر نظام اختبار EHT قراءات عالية المحتوى بما في ذلك جميع المعلمات النسيجية القياسية وكذلك الكيمياء الحيوية (RNA، DNA والبروتين العزلة) 11. وتشمل التطبيقات المستقبلية المحتملة الجوانب<html> تطوير الدواء (التحقق من صحة الهدف والصيدلة سلامة) والنمذجة المرض وخاصة في تركيبة مع كريسبر / Cas9 جيل بوساطة من الضوابط إسوي. وخلال صيانة EHTs وأداء منحنيات التركيز على الاستجابة، فمن المهم اتباع التعليمات بعناية لإجراءات زراعة الخلايا معقمة لتجنب التلوث الفطرية أثناء نقل رفوف PDMS بين 24 لوحات جيدا. الخطوة الأكثر أهمية مع EHT رغم ذلك، هو بروتوكول cardiomyocyte التمايز. لEHTs لتشكيل متماسك بفوزه على شرائط العضلات، والسكان المدخلات يجب أن تتكون من 60٪ على الأقل العضلية. لحسن الحظ، أصبحت البروتوكولات التمايز أكثر قوة وكفاءة على مر السنين والعضلية ومتاحة بسهولة تجاريا حتى الآن. لا يفهم دور غير myocytes في تطوير المستمدة hiPSC-أنسجة القلب هندسيا بشكل كامل، حتى الان. تجارب مع hiPSC-CM عالية النقاء أدت إلى EHT جيدة بصورة مدهشةوقد تبين الحمار = &quot;XREF&quot;&gt; 7، ولكن التكامل بين أنواع الخلايا الأخرى في الأنسجة لتحسين وظيفة الأنسجة وقد يدفع النمط الظاهري نحو علم وظائف الأعضاء ناضجة 22 و 23 و 24. كما يتم إنشاء الأنسجة في شكل جيد على مدار 24 ساعة مع واحد مليون خلية في الأنسجة، وهذه المنصة لا تزال باهظة الثمن إلى حد ما. تقليص إلى تنسيق 96-جيدا وتطمح، لكن متانة حتى الآن outbalances هذا القصور. بروتوكول المعروضة في هذه المخطوطة هو من الناحية الفنية قوية جدا مع تقلب كبير بين مكررات. تباين داخل دفعة منخفضة جدا لحركية (يعني معامل الاختلاف = 5٪)، وكبيرة نوعا ما لتردد الضرب العفوي (يعني معامل الاختلاف 10٪) وقوة انقباض (يعني معامل الاختلاف 17٪). هذه التقنية هي قوية للغاية. عبر المجربون مختلفة، وكفاءة لتوليد EHTs الضرب هو&gt; 90٪ من الهلاميات المائية مسبوكة.

وقد أدت الآثار الجانبية القلبية مثل متلازمة QT الطويلة التي يسببها الدواء لسحب السوق خلال السنوات الماضية. وتشير الإحصاءات إلى أن حوالي 45٪ من جميع عمليات السحب ومن المقرر أن الآثار غير المرغوب فيها على نظام القلب والأوعية الدموية 1. هذا الفشل المخدرات بعد العملية التنموية مكلفة والموافقة هو السيناريو الأسوأ لشركات الأدوية. لذا تركز إدارات البحوث والتطوير في مجال الكشف عن هذه الآثار غير المرغوب فيها القلب والأوعية الدموية في وقت مبكر. لالمخاوف الاقتصادية والأخلاقية، والجهود المبذولة للحد من التجارب على الحيوانات واستبدالها فحوصات في المختبر فحص جديدة جارية. وأدرجت مجموعة من المقايسات التي أنشئت في إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) والوكالة الأوروبية للأدوية (EMA) مبادئ توجيهية لتقييم ما قبل السريرية من آثار المخدرات proarrhythmic 2. تكنولوجيا إعادة برمجة الخلايا الجسدية تليها تمايزالناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) عززت هذا المجال البحثي 3. الآن يوفر إمكانية لفرز المرشحين دواء جديد على العضلية البشرية في المختبر، ويتجنب القضايا مع وجود اختلافات بين الأنواع. الأخيرة البروتوكولات تمايز القلب 4، 5 توفر امدادات غير محدودة من العضلية دون القلق الأخلاقي. ومع ذلك، فإن قياس قوة مقلص، وأهم وأفضل وصف في المعلمة الجسم الحي الخلايا العضلية، لم يتم تأسيس جيدا. ويرتبط هذا إلى عدم النضج النسبي 6 من الجذعية المحفزة العضلية المشتقة من الخلايا البشرية التي يسببها (hiPSC-CM) بالمقارنة مع cardiomyocyte الكبار. وتقدم محتمل هو مهندس أنسجة القلب 3-الأبعاد من الخلايا واحد 7 (هندسة أنسجة القلب، EHT). ويستند البروتوكول EHT على تضمين الفئران واحد أو العضلية الإنسان 8 </سوب&gt;، 9، 10 في هيدروجيل الليفين بين اثنين polydimethylsiloxane مرن (PDMS) المشاركات 11 في شكل 24-جيدا. في غضون بضعة أيام تبدأ العضلية للتعاقد بشكل عفوي كما الخلايا واحد والبدء في تشكيل الشبكات الخلوية. بعد 7-10 أيام، تقلصات العيانية من الأنسجة كلها مرئية. وخلال هذه العملية يتم تشكيلها المصفوفة خارج الخلية، مما يؤدي إلى انخفاض قطرها وطولها. تقصير نتائج EHT في الانحناء للPDMS نشر حتى أثناء الراحة، إخضاع العضلية في EHT النامية لتحميل المستمر. تستمر EHTs لأداء تقلصات العضلات متقلص ضد تزايد المقاومة على مدى عدة أسابيع. تظهر EHTs البشري الردود على التحفيز الفسيولوجية والدوائية مبينا مدى ملاءمتها لفحص المخدرات والمرض النمذجة 7. في هذه المخطوطة نقدم بروتوكول قوية وسهلة للالجيلعلى من EHT الإنسان، وتحليل انقباض الآلي للتغيرات التي تعتمد تركيز نمط انكماش في وجود مثبطات قناة قناة- herg.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EHT analysis intrument</td>
			<td>EHT Technologies GmbH</td>
			<td>A0001</td>
			<td>Software is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHT PDMS rack</td>
			<td>EHT Technologies GmbH</td>
			<td>C0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHT PTFE spacer</td>
			<td>EHT Technologies GmbH</td>
			<td>C0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHT electrode</td>
			<td>EHT Technologies GmbH</td>
			<td>P0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHT pacing adapter/cable</td>
			<td>EHT Technologies GmbH</td>
			<td>P0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well-plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>144530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well-cell culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon tube, graduated&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flask</td>
			<td>Integra</td>
			<td>182 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>70101</td>
			<td>Adjust rotor speed to 40 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 cell culture flask&#160;</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>831,812,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-shaped sedimentation rack&#160;</td>
			<td>Custom made at UKE Hamburg</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215; DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin-A&#160;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua ad injectabilia</td>
			<td>Baxter GmbH</td>
			<td>1428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 PLUS insulin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II&#160;</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase II, type V (from bovine spleen)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D8764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab120843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (bovine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>For coating: 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Ca2+/Mg2+&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-720-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidmix&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>For EHT reconsitutionmix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B3082-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o MgCl2/CaCl2</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#223;1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Biorbyt</td>
			<td>orb6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiPSC</td>
			<td>Custom made at UKE hamburg</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell cardiomyocytes kit</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>CMC-100-010-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluricyte cardiomyocyte kit</td>
			<td>Pluriomics</td>
			<td>PCK-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit</td>
			<td>Axiogenesis AG</td>
			<td>Ax-C-HC02-FR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellartis cardiomyocytes</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>Y10075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated contraction analysis of human engineered heart tissue for cardiac drug safety screening

يصف هندسة الأنسجة القلبية التقنيات لتشكل ثلاثة الأنسجة المهندسة الأبعاد توليد القوة. لتنفيذ هذه الإجراءات في البحوث الأساسية وتطوير العقاقير قبل السريرية، فمن المهم وضع بروتوكولات لتوليد وتحليل الآلي في ظل ظروف موحدة. هنا، نقدم تقنية لتوليد أنسجة القلب مهندسة (EHT) من العضلية من مختلف الأنواع (الجرذان والفئران والبشرية). وتعتمد هذه التقنية على التجميع من الليفين هلام يحتوي على العضلية فصل بين polydimethylsiloxane مرن (PDMS) المشاركات في شكل 24-جيدا. يشكل ثلاثي الأبعاد، EHTs توليد قوة في غضون أسبوعين بعد الصب. يسمح هذا الإجراء لتوليد عدة مئات من EHTs في الأسبوع، ويقتصر من الناحية الفنية إلا من خلال توافر العضلية (0،4-1،0 × 10 6 / EHT). يتم تقييم تقلصات العضلات متقلص ضد تزايد المقاومة في غرفة الحضانة تعديل مع ميكانالتعشيق كال ل24 لوحات جيدا وكاميرا وضعت على رأس هذه القاعة. يتحكم البرمجيات انتقلت الكاميرا على نظام محور XYZ لكل EHT. تم الكشف عن تقلصات EHT بواسطة خوارزمية التعرف على الرقم الآلي، ويتم احتساب القوة على أساس تقصير من EHT والميل مرونة والهندسة وظائف PDMS. يسمح هذا الإجراء للتحليل الآلي للارتفاع أعداد EHT في ظل ظروف موحدة ومعقمة. كشف موثوق بها من آثار المخدرات على انكماش cardiomyocyte هو أمر حاسم لتطوير الأدوية القلبية والصيدلة السلامة. علينا أن نبرهن، مع مثال على قناة- herg قناة المانع E-4031، أن النظام EHT البشري يتطابق الردود المخدرات على حركية انقباض القلب البشري، مشيرا إلى أن يكون أداة واعدة لفحص القلب سلامة الدواء.

القلب التمايز وإعداد EHT تم توسيع HiPSC على انخفاض عامل نمو الغشاء القاعدي المصفوفة، فصلها مع EDTA والهيئات مضغي (EBS) التي تشكلت في قوارير الدوار بين عشية وضحاها. بعد تحريض أرومية متوسطة لمدة ثلاثة أيام، وقد بدأ التمايز القلب مع المانع WNT. بعد ~ 17 يوما من بروتوكول التمايز، وفصلها EBS الضرب في الخلايا وحيدة مع نوع كولاجيناز II (الشكل 1). أعدت EHTs من العضلية المعزولة حديثا مع 1.0 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر الأنسجة مباشرة بعد EB التفكك (الشكل 2). لإعداد من الخلايا المجمدة (مثل الموردين التجاريين)، وإذابة الخلايا عن طريق إعادة تعليق الإفلات من الحكمة في المتوسط ومعلق في ECM بعد الطرد المركزي. في غضون 48 ساعة، لوحظ الضرب العفوي للخلايا مفردة مجهريا في EHT. خلال الأيام القادمة، انتشرت العضلية من طولي على طول خطوط القوة من الأنسجة، إلى جانب وشكلت EHT الضرب متماسك. تم قياس الانحرافات واضحة ظاهريا من المشاركات PDMS مع أداة تحليل EHT. تحليل الانكماش واستند تحليل EHT انقباض على تسجيل الفيديو البصرية (الشكل 3). داخل النظام، ووضع لوحة 24-جيدا مع EHTs في بالغاز والتحكم في درجة حرارته غرفة الحاضنة مع سقف زجاجي. تم وضع كاميرا متصلة بمحرك XYZ محور فوق هذه الوحدة، وكانت محددة إحداثيات XYZ لكل EHT مع أحد البرامج. واستند تحليل كل EHT على الاعتراف الرقم في نهايات العلوية والسفلية من الأنسجة. حلل خوارزمية برامج الحاسوب الآلي تقلصات EHT تصويره والتنمية قوة محسوبة على أساس ما بعد انحراف وايلاsticity / هندسة الوظائف PDMS (الشكل التكميلي 1) 11. بعد تحديد القمم وفقا لمعايير محددة مسبقا، لخص تقرير الشعبي المعلمات من انقباض لجميع EHTs (الشكل التكميلي 2). الاستقرار في قياس المدى الطويل تم إجراء قياس المدى الطويل EHTs في الوضع المستمر مع قياس الآلي تتكرر كل 20 دقيقة. وأظهر تحليل انكماش أي تغييرات تعتمد على الوقت (اختبار للمشاركة والاتجاه الخطي لم يكن كبيرة) في قوة الانكماش، والضرب تردد، T1 وقت الانكماش أو الاسترخاء الوقت T2 لمدة تصل إلى 20 ساعة، مما يدل على مستوى عال من الاستقرار (الشكل 4). كما هو الحال مع كل عينة بيولوجية الرغم من ذلك، تظهر بعض EHTs مستوى التباين، كما هو متوقع لمكررات البيولوجية. معاملات الاختلاف في بداية ونهاية قنينة المدى الطويلكانت rement 13/07٪ للقوة، 06/12٪ للتردد، 03/04٪ لفترة انكماش و03/04٪ لوقت الاسترخاء، على التوالي (ن = 4). هذا التباين بين مكررات البيولوجية ليست قطعة أثرية من الاعتراف شخصية او تحليل ونتائج كل EHT واحدة هي قابلة للتكرار ويكون التباين المنخفض (الشكل التكميلي 2). فحص المخدرات تم إجراء فحص المخدرات في حل تايرود خالية من المصل ل. تم إنشاؤها التراكمية منحنيات استجابة تركيز مع الحد الأقصى للتركيز المركبات DMSO من 0.1٪. وأظهر تحليل انكماش خط الأساس عدم انتظام القليل جدا في ضرب نمط وتقلب منخفض جدا بين مكررات. أدى التعرض للقناة- herg قناة مانع E4031 في إطالة كبيرا من الوقت الاسترخاء (T2) في 10 نانومتر ونمط الضرب غير النظامية في تركيزات أعلى (الشكل 5). لالترددذ تحليل الانكماش التي تسيطر عليها، وأجريت قياسات اختياريا مع التحفيز الكهربائي باستخدام أقطاب الكربون. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55461/55461fig1.jpg" /> الشكل 1: التمايز القلب. الناجم (A) الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة. شريط مقياس = 100 ميكرون. الهيئات (B) مضغي في بداية التمايز أرومية متوسطة. شريط مقياس = 100 ميكرون. الهيئات (C) مضغي المتعاقدة في نهاية التمايز القلب. شريط مقياس = 100 ميكرون. المهندسة (D) الإنسان أنسجة القلب. شريط مقياس = 1 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55461/55461fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55461/55461fig2.jpg" /> الشكل 2: جيل من انجيننسيج القلب eered (EHT). (A) PTFE الفاصل. (B) PDMS الرف. A، (B) مقياس بار = 1 سم (C) أعلى نظرا على بئر من جيدا لوحة 24 مع قالب الصب في الاغاروز بعد إزالة هل PTFE. (D) زوج من المشاركات من رف PDMS وضعه في قالب الصب. (E) إعادة تشكيل مزيج pipetted في القالب الصب وحول المشاركات PDMS. (F) التي تم إنشاؤها حديثا EHT في اليوم 0، ونقل إلى صحن الثقافة الجديد مع المتوسط. (G) تشكيلها EHT في المتوسط في اليوم 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55461/55461fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55461/55461fig3.jpg" /> الشكل 3: تحليل تقلص المهندسة القلب الأنسجة (EHT). (A) EHTأداة التحليل مع كاميرا الكمبيوتر التي تسيطر عليها فوق بالغاز والتحكم في درجة حرارته غرفة الحضانة مع EHTs في صحن 24-جيدا ثقافة على رأس لجنة LED. (B) عرض لايف من خلال تحليل EHT مع برامج التحليل انكماش الآلي. (C) المثالي نمط تقلص عرض قوة تقلص مع مرور الوقت يقاس مع 100 لقطة في الذروة الثانية وتضخم انكماش التخطيطي، وعرض القوة تحليل المعلمة، الساعة انكماش (T1)، وقت الاسترخاء (T2)، سرعة الانكماش (CV)، سرعة الاسترخاء ( RV، وقد تم طبع هذا الرقم من 7 و 27). DH: معلمات للتحليل الانكماش. (D) أمثلة على مستويات مختلفة مرشح (الأزرق تصفية الخط) التي تؤثر على الاعتراف الرقم. اليسار: مستوى تصفية = 0. ملاحظة عدم وجود خط تصفيتها الأزرق مرئيا، ولكن فقط التتبع الأصلي الأحمر. مستوى تصفية = 3، مشيرا المثالي الاعتراف / تحليل عشر: الأوسطالبريد قمم الانكماش. الصحيح: تصفية مستوى = 20. لاحظ أن خطوط تصفيتها الزرقاء هي أصغر بكثير من آثار الأصلية تشير إلى ضعف انقباض الذروة التحليل. (E) مثال من تقلصات EHT عدم اتساق نبضات القلب تحليلها مع عتبة قوة عالية جدا (إلى اليسار) وعتبة أقل قوة (يمين) مع كل القمم معترف بها. (F) أمثلة آثار EHTs تتعرض لقناة الصوديوم ناهض ATX-II مما أدى إلى وقت الاسترخاء لفترات طويلة مع وقت مبكر بعد انكماش. لاحظ أن ذروة الانكماش الرابعة على اللوحة اليسرى لم يتم التعرف (لا مربع أخضر) وذلك بسبب عامل الحد الأدنى منخفض جدا. (G) أمثلة على قمم الانكماش مع (اللوحة اليمنى) ودون (اللوحة اليمنى) منحنى الوردي (مشتق الأولى من منحنى انكماش، تقلص وسرعة الاسترخاء). (H) ملخص توصيات المعلمة عن الفئران والإنسان EHTs. لاحظ أن هذه المعايير قد تحتاج إلى تعديل مع تغير نمط الانكماش خلال التعرض للمخدرات (انظر E،F). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55461/55461fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55461/55461fig4.jpg" /> الشكل 4: السيطرة على الوقت وخلال طويل قياس مدة الضرب بشكل عفوي الإنسان المهندسة القلب الأنسجة (EHT). السيطرة على الوقت خلال قياس على المدى الطويل من الضرب بصورة عفوية الإنسان المهندسة أنسجة القلب (EHT). تم وضع EHTs في الصك تحليل EHT وحضنت لمدة 20 ساعة. أجريت التحاليل انكماش الآلي كل 20 دقيقة مع يست كبيرة بعد اختبار الاتجاه الخطي (ن = 4، وتمثل البيانات يعني + الانحراف المعياري). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55461/55461fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img al<html> ر = &quot;الشكل 5&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 55461 / 55461fig5.jpg&quot; /&gt; الشكل 5: تأثير قناة- herg قناة مانع E4031 لحقوق الإنسان المهندسة القلب الأنسجة (EHT). (A) نمط انكماش المثالي في الأساس. (B) المثالي نمط انكماش بعد الحضانة في 300 نانومتر E4031. (C) متوسط انكماش الذروة (ن = 4) من EHTs حفز كهربائيا في الأساس (أسود) وبعد حضانة 30 دقيقة في 100 نانومتر E4031 (الحمراء). تحليل مع 100 لقطة في الثانية الواحدة. منحنيات (D) استجابة لتركيز E4031 على ضرب عفويا EHTs البشري. لاحظ حجم تأثير أصغر في T2 اطالة في EHTs حفز كهربائيا (C) مقابل EHTs الضرب بشكل عفوي (D). في اتجاه واحد ANOVA والتدابير المتكررة مع مرحلة ما بعد اختبار Dunnett في مقابل خط الأساس. * ف &lt;0.05. ن = 4. Z &#39;عامل 25 لإطالة T2 في 300 نانومتر E4031 هو 0.75.خريج &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> بشري </td><td> فأر </td><td> الفأر </td></tr><tr><td> خلايا </td><td> 26.4x10 6 </td><td> 10.8x10 6 </td><td> 18.0x10 6 </td></tr><tr><td> 2xDMEM [ميكرولتر] </td><td> 147 </td><td> 147 </td><td> 147 </td></tr><tr><td> الغشاء القاعدي مصفوفة [ميكرولتر] </td><td> 264 </td><td> - </td><td> 264 </td></tr><tr><td> Y-27632 [ميكرولتر] </td><td> 2.6 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> الفيبرينوجين [ميكرولتر] </td><td> 66.8 </td><td> 66.8 </td><td> 66.8 </td></tr><tr><td> ECM [ميكرولتر] </td><td> إعلان 2640 </td><td> إعلان 2640 </td><td> إعلان 2640 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: pipetting لمخطط لP<html> جبر إعادة إعماره ميكس لمدة 24 الإنسان، الجرذ والفأر EHTs. تركيز الفيبرينوجين هو 5 ملغ / مل لجميع EHTs. لاحظ أن تركيز خلية مختلفة لكل الأنواع. لEHTs البشري، إضافة الغشاء القاعدي المصفوفة (على سبيل المثال matrigel، انظر المواد الجدول) ورو مثبط كيناز Y-27632 إلى الخليط. لEHTs الماوس، إضافة الغشاء القاعدي المصفوفة. اعتمادا على تركيز الأولي لتعليق الخلية، إضافة ECM إضافية للوصول إلى إجمالي حجم 2640 مزيج إعادة ميكرولتر. <img alt="الشكل التكميلي 1" src="/files/ftp_upload/55461/55461suppl1.jpg" /> الشكل التكميلي 1: حساب معادلة القوة تقلص بناء على المشاركة انحراف 26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55461/55461suppl1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> معشوقة = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل التكميلي 2" src="/files/ftp_upload/55461/55461suppl2.jpg" /> الشكل التكميلي 2: المثالي مقتطفات البيانات من تقرير تحليل تقلص من البرنامج. قمم تقلص خلال 20 ثانية من الوقت المسجل مع 100 لقطة / ثانية: الأعلى (الأحمر: قوة انقباض، وردي: انكماش السرعة). القاع: حلل المعلمة انكماش تبين الحد الأدنى، متوسط، الحد الأقصى لقيمة والانحراف المعياري لل18 تحليلها قمم انكماش ملحوظ مع الساحة الخضراء (أعلى). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55461/55461suppl2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening at JoVE.com

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

هنا، نقدم لك مجموعة من جيل البشرية هندسة أنسجة القلب من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات (hiPSC) -derived العضلية. نقدم طريقة لتحليل قوة التقلص وتغيير المثالي لنمط تقلص من قناة- herg قناة المانع E-4031. يظهر هذا الأسلوب مستوى عال من المتانة وصلاحيتها للفحص المخدرات القلب.

تحليل الآلي تقلص الإنسان المهندسة القلب الأنسجة للفحص القلب سلامة الأدوية

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

automated-contraction-analysis-human-engineered-heart-tissue-for

Google

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Bioengineering

Unit 1

Cardiovascular Drugs: Antiarrhythmic and Heart Failure Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

12.5K Views.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research).  هنا، نقدم لك مجموعة من جيل البشرية هندسة أنسجة القلب من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات (hiPSC) -derived العضلية. نقدم طريقة لتحليل قوة التقلص وتغيير المثالي لنمط تقلص من قناة- herg قناة المانع E-4031. يظهر هذا الأسلوب مستوى عال من المتانة وص...

Video: Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

التصوير تلألؤ بيولوجي لتقييم الاستجابات المناعية عقب زرع أنسجة القلب المهندسة (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

In cardiac myocytes, tubular membrane structures form intracellular networks. We describe optimized protocols for i) isolation of myocytes from mouse heart including quality control, ii) live cell staining for state-of-the-art fluorescence microscopy, and iii) direct image analysis to quantify the component complexity and the plasticity of intracellular membrane networks.

تحليل غشاء أنبوبي الشبكات في القلب Myocytes من أتريا والبطينات

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

إنتاج وتوصيف والمحتملة استخدامات الأنسجة المهندسة-3D الإنسان المريء المخاطي نموذج

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

The functional behavior of cells in culture can be improved by culturing in more in vivo-like 3-dimensional culture environments16-21. This manuscript describes the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for in vivo-like mammalian tissue culture.

المفاعلات الحيوية الألياف المجوفة ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تشبه الثدييات زراعة الأنسجة

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

والأنسجة المشتركة 3D هندسيا<em&gt; في المختبر</em&gt; /<em&gt; في السيليكو</em&gt; الرئة نموذج الورم للتنبؤ فعالية الدواء في خلفيات الطفرات محددة

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

حديثي الولادة القلب السقالات: مصفوفات رواية للدراسات التجدد

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which are developed towards the goal of clinical use. HiPSC-derived cardiomyocytes, endothelial cells, and vascular mural cells are mixed with gel matrix and then poured into a polydimethylsiloxane (PDMS) tissue mold with rectangular internal staggered posts. By culture day 14 ECTs mature into a 1.5 cm x 1.5 cm mesh structure with 0.5 mm diameter myofiber bundles. Cardiomyocytes align to the long-axis of each bundle and spontaneously beat synchronously. This approach can be scaled up to a larger (3.0 cm x 3.0 cm) mesh ECT while preserving construct maturation and function. Thus, mesh-shaped ECTs generated from hiPSC-derived cardiac cells may be feasible for cardiac regeneration paradigms.

The present protocol generates mesh-shaped engineered cardiac tissues containing cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells to allow the investigation of cell implantation therapy for heart diseases.

إعداد الأنسجة القلبية المهندسة على شكل شبكة مشتقة من خلايا iPS البشرية لإصلاح عضلة القلب في فيفو

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular network comprising several levels of complexity to provide oxygen and nutrients within bioengineered heart tissues. Our laboratory has developed a three-dimensional in vitro model of the human heart, known as the "cardiac spheroid" or "CS". This presents biochemical, physiological, and pharmacological features typical of the human heart and is generated by co-culturing its three major cell types, such as cardiac myocytes, endothelial cells, and fibroblasts. Human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs or iCMs) are co-cultured at ratios approximating the ones found in vivo with human cardiac fibroblasts (HCFs) and human coronary artery endothelial cells (HCAECs) in hanging drop culture plates for three to four days. The confocal analysis of CSs stained with antibodies against cardiac Troponin T, CD31 and vimentin (markers for cardiac myocytes, endothelial cells and fibroblasts, respectively) shows that CSs present a complex endothelial cell network, resembling the native one found in the human heart. This is confirmed by the 3D rendering analysis of these confocal images. CSs also present extracellular matrix (ECM) proteins typical of the human heart, such as collagen type IV, laminin and fibronectin. Finally, CSs present a contractile activity measured as syncytial contractility closer to the one typical of the human heart compared to CSs that contain iCMs only. When treated with a cardiotoxic anti-cancer agent, such as doxorubicin (DOX, used to treat leukemia, lymphoma and breast cancer), the viability of DOX-treated CSs is significantly reduced at 10 &#181;M genetic and chemical inhibition of endothelial nitric oxide synthase, a downstream target of DOX in HCFs and HCAECs, reduced its toxicity in CSs. Given these unique features, CSs are currently used as in vitro models to study heart biochemistry, pathophysiology, and pharmacology.

This protocol aims to fabricate 3D cardiac spheroids (CSs) by co-culturing cells in hanging drops.&#160;Collagen-embedded CSs are treated with doxorubicin (DOX, a cardiotoxic agent) at physiological concentrations to model heart failure. In vitro testing using DOX-treated CSs may be used to identify novel therapies for heart failure patients.

الـ 25: الفيزياء القلبية كما في الأنسجة الحيوية للقلب لدراسة أمراض القلب البشري

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...