وقد أيد هذا المشروع من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (NSFC): 31301950 و31671288.

تم تأسيس الطريقة الحالية والتحقق من صحتها لحصاد وتخزين أكثر من 1000 عينة العضلات لتلطيخ النسيجي في مختبرنا. وجاءت جميع الإجراءات التي تنطوي على رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية التي وضعتها وزارة الزراعة في الصين. 1. المعدات اللازمة لجمع العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية هوية العينة على كل قارورة المبردة. ملاحظة: قارورة المبردة صمم خصيصا لتجميد عينات أنسجة جديدة لهذا الإجراء cryosection (الشكل 1A). مصنوعة من قوارير من البولي بروبلين في قالب المصنع (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على المعدات التالية: النيتروجين السائل في خزان النتروجين السائل المناسب، ونظارات السلامة أو درع الوجه، والقفازات الثلاجة، 10 سم ملقط، 25 ملاقط سم، برودة الستايروفوم (الأبعاد الداخلية: 20 سم × 12 سم واسعة × 13.5 سم ارتفاع ؛ الأبعاد الخارجية: 24 سم × 16 سم × 15 سم ارتفاع)، فيلم من البلاستيك (2.5 سم × 0.8 سم واسعة × 0.1 مم)،مشرط، ويغطي ملزمة A4 PVC (21 سم × 29.5 سم) (الشكل 1B). </li></ol> 2. إعداد عينات العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء برودة الستايروفوم مع النتروجين السائل 5 دقائق قبل جمع العينة. ملاحظة: عمود كبير من النيتروجين السائل أمر ضروري لأن جزءا من النيتروجين السائل يغلي بعيدا ويتحول إلى غاز عندما تلمس عينات جديدة منه. من أجل الحد من وتيرة نقل النيتروجين السائل لتجديد الخسارة، يجب أن تكتسب برودة الستايروفوم بحجم مناسب مقدما وفقا لعدد من العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم الحصول على العينة، وضع بلطف على قطعة من غطاء ملزمة A4 PVC ومراقبة اتجاه الألياف العضلية. ملاحظة: هنا، استخدمنا المقطع العرضي للعضلة الطولى دوريس من الأول إلى فقرة القطنية الأخيرة في الخنازير. العينات هي حوالي 12 سم، 8 سم واسعة، وارتفاع 5 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مشرط لجعل اثنين من الشقوق موازية من خلال ط عينةن اتجاه الألياف العضلية، ما يقرب من 3 سم في الطول و 0.6 سم عن بعضها البعض. تقليم العضلات قطعي في مستطيل حوالي 0.6 سم واسعة × 0.6 سم ارتفاع × 1.5 سم. ملاحظة: موثوقية لقياس مساحة المقطع العرضي للألياف العضلات يعتمد في الغالب على اتجاه الألياف في عضلة قطعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 10 سم ملقط لوضع بلطف العينة على قطعة من البلاستيك فيلم، مع المحور الطولي للبالتوازي العضلات قطعي إلى حافة طويلة من الفيلم (الشكل 2A). ملاحظة: فيلم من البلاستيك وظيفتين: وظيفة القابضة التي تساعد في تحديد اتجاه الألياف العضلية وظيفة التصاق أن يمنع التشققات في العينة بسبب تجميد السريع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، ضع الأنسجة العضلية في منتصف السفلي من القارورة المبردة المسمى، فقط بين الثقوب مدخل، ثم الغطاء بإحكام القارورة (الشكل 2B). </li></ol> 3. تجميد وتخزين عينة العضلاتالصورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملاقط 25 سم، وسرعان ما يغرق القارورة المبردة كاملة في النيتروجين السائل في برودة الستايروفوم تبرد قبل، والانتظار حتى النيتروجين السائل لا تغلي (حوالي 10-20 ق). ملاحظة: سيتم cryovial تطفو عندما النيتروجين السائل يغلي، لذلك بعناية تزج القارورة في النيتروجين السائل المغلي لمدة 10-20 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينات العضلات إلى خزان تخزين النتروجين السائل أو -80 ° C الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل. </li></ol> 4. شريحة التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool ناظم البرد إلى ما بين -20 درجة مئوية و -22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة والتخلص من شفرة مشراح القديمة، ومسح أسفل حامل سكين ولوحة مكافحة لفة في ناظم البرد، تثبيت شفرة مشراح جديدة في ناظم البرد، وتعيين سماكة القطع الى 8 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينة العضلات في القارورة المبردة من خزان النتروجين السائل أو الفريزر -80 درجة مئوية إلى ناظم البرد، نقله في النيتروجين السائل أو على الثلج الجاف. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 30 دقيقة لعينة لكي تتوازن مع درجة حرارة ناظم البرد. ملاحظة: أي معدات قد لمس العينة يجب أن يكون قبل تبريده، وذلك لأن درجة حرارة عالية قد تتسبب في تكوين بلورات الثلج في العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل العينة في حامل العينة تحت درجة حرارة صياغة قطع المثلى من الجليكول وراتنجات للذوبان في الماء (OCT). قطع أقسام 8 ميكرومتر. ملاحظة: ضبط زاوية القطع عموديا على اتجاه الألياف العضلية، لأن CSAF هو منطقة مستعرضة من الألياف العضلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل أقسام نحو وسط شريحة مجهرية درجة حرارة الغرفة. المكان على الفور الشريحة في مربع الشريحة في الفريزر -80 درجة مئوية. لا تسمح الشريحة لتجف في RT. </li></ol>

<ol>
	<li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics.">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li><li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality.">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li><li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Muscling+in+Cattle:+Genes,+Husbandry,+Carcasses+and+Meat.">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li><li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep.">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).</li><li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RYR1+g.1843C&gt;T+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G&gt;A+mutation+on+muscle+hypertrophy.">The RYR1 g.1843C&gt;T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G&gt;A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li><li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation.">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li><li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation.">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li><li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease.">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793 (2015).</li><li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria.">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li><li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Freezing+Temperature+and+Water+Activity+on+Microstructure,+Color,+and+Protein+Conformation+of+Freeze-Dried+Bluefin+Tuna+(Thunnus+orientalis).">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li><li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).</li><li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).</li><li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubbles+Size+Estimation+in+Liquid+Flow+Through+a+Vertical+Pipe.">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li><li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+A+Flow+through+Small+Apertures+:+2nd+Report,+Experiments+on+The+Velocity+Field.">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li><li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+flow+through+an+orifice+meter:+CFD+simulation.">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li></ol>

أي تضارب في المصالح أو مالية أو خلاف ذلك، أعلن من قبل المؤلفين.

هنا، نحن تصف الجديد، cryovial متعددة حفرة لتجميد وتخزين الأنسجة العضلية لإجراء عمليات تقييم النسيجية وظيفة العضلات. الخطوة تعديل حاسمة في هذا البروتوكول هو أن العينة في cryovial متعددة ثقب مغمورة مباشرة في النيتروجين السائل. على حد علمنا، وهذا هو أبسط وrapidest طريقة للحصول عل?...

الهيكل العظمي والعضلات هي العنصر الأكثر قيمة من الحيوانات المنتجة للحوم من الناحية التغذوية وتجهيز الرأي. في صناعة اللحوم، هناك جانبان خصوصا الحرجة: كفاءة نمو العضلات ونوعية اللحوم الناتجة عن ذلك. كعنصر رئيسي من العضلات، وألياف العضلات هي ذات الصلة مباشرة إلى أداء النمو وجودة اللحوم الطازجة في الحيوانات 1. على سبيل المثال، فإن العدد الإجمالي للألياف (TNF) ومنطقة مستعرضة للألياف (CSAF) تحديد معظمهم من كتلة العضلات وجودة اللحوم. أيضا، نوع من الألياف التركيب (FTC) تؤثر بقوة جودة اللحوم الطازجة 2. ولذلك، فإن التلاعب في خصائص الألياف العضلية في الحيوانات هي طريقة فعالة للغاية لزيادة الربحية الأساسية والقدرة التنافسية للمزارع 1. حتى الآن، وقد تم تحديد العديد من العوامل الجوهرية وخارجي لمعالجة الألياف العضلية characteristICS 1. هذا التلاعب لا يمكن أن يتحقق من خلال اختيار المستهدفة من الحيوانات مع جينات معينة، مثل الجين Myostatin في الماشية 3، والجينات Callipyge في الأغنام 4، وRYR1 والجينات IGF2 الخنازير 5. أيضا، مراقبة النظام الغذائي والعلاجات مع هرمونات معينة تلعب دورا هاما في خصائص الألياف العضلية 6. وهكذا، وهو نهج يجمع بين العوامل الوراثية والغذائية قد تكون قادرة على تحسين محتوى اللحوم الخالية من الدهون وجودة اللحوم. ومع ذلك، تقتصر الدراسات على ألياف العضلات في صناعة اللحوم لاستجلاء هيكل من ألياف العضلات لا يزال يشكل تحديا. يتم تحديد خصائص الألياف العضلية باستخدام أساليب النسيجية، مثل فحص الميوسين الأدينوزين فسفاتاز (أتباز). ويعتمد هذا الأسلوب على حقيقة أن الإنزيمات الموجودة في أقسام رقيقة (6-8 ميكرون) المجمدة منألياف العضلات يمكن أن يتفاعل كيميائيا مع بعض المنتجات. ومع ذلك، فإن المحتوى المائي للعضلات أكبر من 75٪ في الخنازير والأرانب والفئران والبشر، بغض النظر عن موقف (أي والظهر والبطن، أو hindlimb) 7. هذا نسبة عالية من الرطوبة في العضلات يسبب مشكلة تصادفها - تجميد التحف - أثناء إعداد cryosections، كما هو موضح سابقا 8 و 9. في معظم الحالات، فإنه يكاد يكون من المستحيل لتجميد الأنسجة العضلية بشكل مناسب في خط إنتاج المسلخ، وفقا لتجربتنا. بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة بسيطة وفعالة المستخدمة في المختبر لدينا لتجميد الأنسجة العضلية لcryosectioning بطريقة عالية الإنتاجية. تسليط الضوء على هذا الأسلوب هو cryovial الجديد الذي تم تصميمه لأنسجة العضلات فلاش تجميد في النيتروجين السائل. سير العمل الحالي يمكن أن تسهل في الوقت نفسه الأنسجةتجميد وتصنيع لcryosection العضلات ممتازة، مع حجرة حشوية واضحة للعيان وبدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمجموعة واسعة من الخيارات لتحليل الأنسجة لأن النيتروجين السائل لا يمتزج مع الأنسجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="508">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Cryostat Microtome</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Leica</td>
			<td style="width:111px;">Leica CM1950</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon DS-U3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:140px;">&#160;Cryogenic Vial&#160;&#160; Plastic film</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Designed by ourself</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cm-forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25cm-tweezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Safety glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezer gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen

تواجه دراسات على فسيولوجيا العضلات والهيكل العظمي التحدي الفني للمعالجة بشكل مناسب العينات للحصول على المقاطع مع مقصورات حشوية واضحة للعيان. عقبة أخرى هي بدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها. لأن عملية تثبيت الأنسجة وتضمينها البارافين يؤدي إلى انكماش ألياف العضلات التجميد هو وسيلة مثلى لتصلب الأنسجة العضلية لباجتزاء. ومع ذلك، تحدث مشكلة شيوعا التي تواجهها، وتشكيل بلورات الثلج، أثناء إعداد الأبواب المجمدة بسبب ارتفاع محتوى الماء من العضلات. بروتوكول المعروضة هنا يصف أولا طريقة بسيطة وفعالة لتجميد أنسجة العضلات بشكل صحيح عن طريق غمر لهم في النيتروجين السائل. المشكلة باستخدام النيتروجين السائل وحده هو أنه يؤدي إلى تشكيل حاجز غاز النيتروجين بجانب الأنسجة، الذي يعمل بمثابة عازل ويحول دون تبريد الأنسجة. لتجنب هذا &quot;بطانية البخار&quot; تأثير، وشمال شرقوقد تم تصميم cryovial ث لزيادة سرعة تدفق السائل حول سطح الأنسجة. وقد تحقق ذلك من خلال اللكم ما مجموعه 14 الثقوب مدخل في جدار القارورة. وفقا لديناميات فقاعة، وهو معدل أعلى من النتائج تدفق السائل في فقاعات أصغر وأقل فرص لتشكيل حاجز الغاز. عندما يتدفق النيتروجين السائل في cryovial من خلال الثقوب مدخل، وسرعة تدفق في جميع أنحاء الأنسجة سريعة بما يكفي للقضاء على حاجز الغاز. مقارنة لطريقة تجميد أنسجة العضلات باستخدام نظير البنتان قبل المبردة، وهذا البروتوكول هو أبسط وأكثر كفاءة، ويمكن استخدامها لتجميد العضلات بطريقة الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب هو الأمثل للمؤسسات التي ليس لديها إمكانية الوصول إلى نظير البنتان، وهي قابلة للاشتعال للغاية في درجة حرارة الغرفة.

وتظهر التوضيح cryovial والمعدات المختبرية الشائعة لتجميد العضلات أثناء إعداد أقسام المجمدة في الشكل 1. مصنوعة من مادة البولي بروبيلين cryovials في مصنع العفن. كل قارورة لديها ما مجموعه 14 الثقوب مدخل: واحد على الغطاء. وآخر هو في الأسفل. والباقي 12 شكل ...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen at JoVE.com

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

يصف هذا البروتوكول إجراء لتجميد الأنسجة العضلية التي تغرق بها مباشرة في النيتروجين السائل. كما يسلط الضوء على هذا البروتوكول cryovial الجديدة التي يمكن أن تجنب &quot;تأثير بطانية&quot; من غاز النيتروجين عندما الاتصالات النيتروجين السائل على سطح الأنسجة من العينة.

A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

a-multi-hole-cryovial-eliminates-freezing-artifacts-when-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Jiangxi Agricultural University.  يصف هذا البروتوكول إجراء لتجميد الأنسجة العضلية التي تغرق بها مباشرة في النيتروجين السائل. كما يسلط الضوء على هذا البروتوكول cryovial الجديدة التي يمكن أن تجنب "تأثير بطانية" من غاز النيتروجين عندما الاتصالات النيتروجين السائل على سطح ا?...

Video: A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove residual media that could otherwise quench the Trypsin reaction.  Warmed 0.05% Trypsin-EDTA is then added to cover the cells, and the plate allowed to incubate for up to 5 mins at room temperature.  During this time cells can be observed rounding, and colonies lifting off the plate surface.  Gentle repeated pipetting will remove cells and colonies from the plate surface.  Trypsinized cells are placed in a standard conical tube containing pre-warmed hES cell media to quench remaining trypsin, and then spun.  Cells are resuspended growth media at a concentration of approximately one million cells in one mL of media, a concentration such that one frozen aliquot is sufficient to resurrect a culture on a 10cm plate.  After cells are adequately resuspended, ice cold freezing media is added at equal volume.  Cell suspensions are mixed thoroughly, aliquoted into freezing vials, and allowed to slowly freeze to -80C over 24 hours.  Frozen cells can then moved to the vapor phase of liquid nitrogen for long term storage, or remain at -80 for approximately six months.

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.

تجميد الخلايا البشرية ES

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Demonstrated in this video are the techniques for flash freezing and sectioning embryonic brain tissue from mouse. Useful tips for using the cryostat are given, including troubleshooting methods that can be used while cutting to ensure that the resultant tissues sections are free of cracks and other distortions.

فلاش التجميد وCryosectioning E12.5 مخ الفأر

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

تجميد والذوبان ، وخلايا تغليف للنقل

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of fluorescently tagged proteins using total internal fluorescence (TIRF) microscopy is used to visualize and quantify changes in cytoskeletal dynamics. TIRF microscopy and the use of fluorescent tags also allows for quantification of the changes in cytoskeletal dynamics caused by mutations in actin. Using this technique, quantification of cytoskeletal function in live cells valuably complements in vitro studies of protein function. As an example, missense mutations affecting the actin residue R256 have been identified in three human actin isoforms suggesting this amino acid plays an important role in regulatory interactions. The effects of the actin mutation R256H on cytoskeletal movements were studied using the yeast model. The protein, Aip1, which is known to assist cofilin in actin depolymerization, was tagged with green fluorescent protein (GFP) at the N-terminus and tracked in vivo using TIRF microscopy. The rate of Aip1p movement in both wild type and mutant strains was quantified. In cells expressing R256H mutant actin, Aip1p motion is restricted and the rate of movement is nearly half the speed measured in wild type cells (0.88 &#177; 0.30 &#956;m/sec in R256H cells compared to 1.60 &#177; 0.42 &#956;m/sec in wild type cells, p &#60; 0.005).

Disease-causing mutations in actin can alter cytoskeletal function. Cytoskeletal dynamics are quantified through imaging of fluorescently tagged proteins using total internal fluorescence microscopy. As an example, the cytoskeletal protein, Aip1p, has altered localization and movement in cells expressing the mutant actin isoform, R256H.

Aip1p حيوية هل غيرت من الطفرة R256H في أكتين

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

الفرز الأنسجة وتجميد لنماذج من الأمراض العضلات الهيكلية

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

ابتلاع فلوري، جسيمات نانوية مغناطيسية لتحديد قدرات امتصاص السوائل في الحشرات

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...