31301950 und 31671288: Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC) unterstützt.

Die aktuelle Methode wurde entwickelt und validiert zu ernten und lagert mehr als 1.000 Muskelproben zur histologischen Färbung in unserem Labor. Alle Verfahren beteiligen Tierpflege und Verwendung folgten die vom Ministerium für Landwirtschaft von China festgelegten Richtlinien. 1. Ausrüstung für die Probenentnahme <ol><li> Beschriften Sie die Probe Identität auf jeder kryogenen Fläschchen. Hinweis: Die Kryo - Fläschchen speziell frische Gewebeproben für das Kryoschnittes Verfahren (Abbildung 1A) einzufrieren ausgelegt ist. Die Fläschchen werden aus Polypropylen in einer Form Fabrik (1C) gebildet. </li><li> Erhalten, die folgende Ausrüstung: flüssigen Stickstoff in einem geeigneten Flüssigstickstofftank, eine Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz, Gefriertruhe Handschuhe, 10 cm Zange 25 cm Pinzette, eine Styropor-Kühler (innere Abmessungen: 20 cm lang x 12 cm breit x 13,5 cm hoch Außenabmessungen;: 24 cm lang x 16 cm breit x 15 cm hoch), Kunststofffolien (2,5 cm lang x 0,8 cm breit x 0,1 mm dick),ein Skalpell, und A4 PVC Bindungsabdeckungen (21 cm x 29,5 cm) (1B). </li></ol> 2. Herstellung von Muskelproben <ol><li> Füllen Sie das Styropor-Kühler mit flüssigen Stickstoff 5 min vor der Probenentnahme. HINWEIS: Die große Säule von flüssigem Stickstoff ist wichtig, weil ein Teil des flüssigen Stickstoffs verkocht und verwandelt sich in Gas, wenn frische Proben berühren. Um die Häufigkeit der Übertragung von flüssigem Stickstoff zu reduzieren, um den Verlust, ein entsprechend dimensioniertes Styropor-Kühler aufzufüllen muss entsprechend der Anzahl von Abtastwerten im Voraus erfasst werden. </li><li> Sobald eine Probe erhalten wird, ist es leicht Platz auf einem Stück PVC-Bindungs ​​A4 Abdeckung und die Richtung der Muskelfasern beobachten. HINWEIS: Hier haben wir den Querschnitt des longissimus doris Muskel von der ersten bis zur letzten Lendenwirbel bei Schweinen. Die Proben sind etwa 12 cm lang, 8 cm breit und 5 cm hoch. </li><li> Verwenden eines Skalpells zwei parallele Schnitte durch die Probe i zu machenn die Richtung der Muskelfasern, etwa 3 cm lang und 0,6 cm auseinander liegen. Schneiden Sie den eingeschnittene Muskel in ein Rechteck ungefähr 0,6 cm breit x 0,6 cm x 1,5 cm lang. HINWEIS: Die Zuverlässigkeit der Messung der Querschnittsfläche der Muskelfasern hängt vor allem von der Faserorientierung des eingeschnittenen Muskel. </li><li> 10 cm verwenden Pinzette vorsichtig auf die Probe stellen auf einem Stück Kunststofffolie, die mit der Längsachse des eingeschnittenen Muskel parallel zur langen Kante des Films (2A). HINWEIS: Der Kunststofffilm hat zwei Funktionen: eine Haltefunktion, die bei der Festlegung der Ausrichtung der Muskelfasern und eine Haftfunktion hilft, dass Risse in der Probe aufgrund des schnellen Einfrierens verhindert. </li><li> Mit einer Pinzette, legt das Muskelgewebe in die untere Mitte eines Kryoröhrchen gekennzeichnet, genau zwischen den Einlasslöchern und dann fest verschließen die Phiole (2B). </li></ol> 3. Einfrieren und Speichern von Muskelprobes <ol><li> Unter Verwendung von 25 cm Pinzette, unterzutauchen schnell das gesamte Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff in dem vorgekühlten Styroporkühler, zu warten, bis der flüssige Stickstoff nicht siedet (ungefähr 10-20 s). HINWEIS: Die Cryovial schwimmt, wenn der flüssige Stickstoff kocht, so sorgfältig das Fläschchen in dem siedenden Flüssigkeit Stickstoff taucht für 10-20 s. </li><li> Übertragen der Muskelproben zu einer Flüssigstickstofflagertank oder ein -80 ° C-Gefrierschrank für die Langzeitlagerung. </li></ol> 4. Schieben Vorbereitung <ol><li> Vorkühlen eines Kryostaten auf zwischen -20 ° C und -22 ° C. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die alte Mikrotom-Klinge, wischen Sie den Messerhalter und Treckerplatte im Kryostaten, ein neues Mikrotomklinge im Kryostaten installieren, und stellen Sie die Schnittstärke bis 8 um. </li><li> Übertragen der Muskelprobe in der Kryoröhrchen aus dem Flüssigstickstofflagertank oder -80 ° C Gefrierschrank zu dem Kryostaten, es in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis transportiert. </li&gt; <li> Warte 30 min für die Probe mit der Temperatur des Kryostaten äquilibrieren. HINWEIS: Alle Geräte, die die Probe berühren könnten, muß vorgekühlt werden, da eine hohe Temperatur könnte die Bildung von Eiskristallen in der Probe führen. </li><li> Montieren der Probe in der Probenhalter unter der optimale Schnitttemperatur Formulierung von wasserlöslichen Glykolen und Harze (OCT). Geschnitten 8-um-Schnitte. HINWEIS: Einstellen der Schnittwinkel senkrecht zur Ausrichtung der Muskelfasern, weil die CSAF die Querschnittsfläche der Muskelfasern ist. </li><li> Montieren Sie die Abschnitte in Richtung der Mitte einer Raumtemperatur Mikrodia. unmittelbar die Folie in eine Folie Box in einem -80 ° C-Gefrierschrank. Halten Sie das Dia bei RT trocknen. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenkonflikte, finanzielle oder sonstige, werden von den Autoren erklärt.

Hier beschreiben wir ein neues, Mehrloch Kryoröhrchen zum Einfrieren und Speicher von Muskelgewebe zu histologischer Beurteilung der Muskelfunktion führen. Der kritische Schritt in diesem modifizierten Protokoll ist, dass die Probe in den Mehrloch-Kryoröhrchen direkt in flüssigem Stickstoff eingetaucht ist. Unser Wissen ist dies die einfachste und rapidest Art und Weise ausgezeichnete gefrorene Proben für Muskel Kryoschneiden unter den bestehenden Gefrierverfahren zu erhalten (siehe die repräsentativen Ergebnisse)...

Der Skelettmuskel ist das wertvollste Komponente eines fleischproduzierenden Tieres aus der Ernährungs- und verarbeitungstechnischer Sicht. In der Fleischindustrie gibt es zwei besonders kritische Aspekte: die Effizienz des Muskelwachstums und der Qualität des resultierenden Fleisch. Als Hauptbestandteil des Muskels, sind Muskelfasern zu Wachstum und frische Fleischqualität 1 bei Tieren direkt in Zusammenhang steht. Zum Beispiel ist die Gesamtanzahl von Fasern (TNF) und die Querschnittsfläche der Fasern (CSAF) meist Muskelmasse und Fleischqualität bestimmen; auch, Fasertyp Zusammensetzung (FTC) wirkt sich stark auf frische Fleischqualität 2. Daher ist die Manipulation von Muskelfasereigenschaften bei Tieren eine sehr wirksame Methode 1 den Kern der Rentabilität und die Wettbewerbsfähigkeit der Betriebe zu erhöhen. Bis heute wurden mehrere intrinsische und extrinsische Faktoren identifiziert worden, Muskelfaser characterist zu manipulierenics 1. Diese Manipulation kann durch die gezielte Auswahl von Tieren mit spezifischen Genen, wie die Myostatin - Gene in cattle 3, das Callipyge Gen in sheep 4 und die RYR1 und IGF2 Gene in pigs 5 erreicht werden. Auch Ernährung Kontrolle und Behandlungen mit spezifischen Hormone spielen eine wichtige Rolle bei der Muskelfasereigenschaften 6. So ein Ansatz, die genetischen und Ernährungsfaktoren kombiniert könnte Muskelfleischanteil und Fleischqualität verbessern kann. Allerdings Studien über Muskelfasern sind in der Fleischindustrie, weil die Aufklärung der Struktur von Muskelfasern begrenzt noch eine Herausforderung. Muskelfasereigenschaften werden unter Verwendung histochemischer Methoden, wie beispielsweise die Myosin Adenosintriphosphatase (ATPase) -Assay identifiziert. Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, dass die in dünnen (6-8 um) gefroren Abschnitte angeordnet EnzymeMuskelfasern chemisch reagiert mit bestimmten Produkten werden kann. Jedoch ist der Wassergehalt der Muskeln mehr als 75% bei Schweinen, Kaninchen, Mäusen und Menschen, unabhängig von der Position ( das heißt, Rücken, Bauch oder hinteren Gliedmaßen) 7. Solche hohen Feuchtigkeitsgehalt in Muskeln verursacht eine häufig auftretende Problem - Einfrieren Artefakte - bei der Herstellung von Gefrierschnitten, wie zuvor beschrieben , 8, 9. In den meisten Fällen ist es fast unmöglich, in geeigneter Weise zu Muskelgewebe in einem Schlachthof Produktionslinie, nach unserer Erfahrung einzufrieren. Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt ein einfaches und effizientes Verfahren in unserem Labor verwendete Muskelgewebe einzufrieren für in einer Hochdurchsatz-Art und Weise Kryoschneiden. Der Höhepunkt dieses Verfahrens ist ein neues, die für Flash-Kryoröhrchen Frieren Muskelgewebe in flüssigem Stickstoff ausgelegt ist. Der aktuelle Workflow kann gleichzeitig Gewebe erleichternEinfrieren und die Verarbeitung für einen ausgezeichneten Muskel Kryoschnitt, mit einem deutlich sichtbar cytoplasmatischen Kompartiment und der engen Apposition von Muskelfasern an das umgebenden Gewebe. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf eine breite Palette von Möglichkeiten für Gewebeanalyse angewendet werden, da flüssiger Stickstoff mit Gewebe nicht mischen.

<table><tbody><tr><td>Cryostat Microtome</td><td>&amp;nbsp;Leica</td><td>Leica CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Digital Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Cryogenic Vial&amp;nbsp;&amp;nbsp; Plastic film</td><td></td><td></td><td>Designed by ourself</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>10 cm forceps</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>25 cm tweezer</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>Safety glass</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>Freezer gloves</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr></tbody></table>

a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen

Studien über die Skelettmuskelphysiologie stehen vor der technischen Herausforderung, in geeigneter Weise die Proben Verarbeitungsabschnitte mit deutlich sichtbaren cytoplasmatischen Kompartimenten zu erhalten. Eine weitere Hürde ist die enge Apposition von Muskelfasern zu den umliegenden Geweben. Da der Prozess der Gewebefixierung und Paraffineinbettung der Schrumpfung von Muskelfasern führt, Gefrieren ist ein optimales Mittel zum Härten Muskelgewebe zur Sektionierung. Allerdings ist ein häufig auftretendes Problem, die Bildung von Eiskristallen, tritt während der Herstellung von Gefrierschnitten aufgrund des hohen Wassergehalt des Muskels. Das Protokoll hier vorgestellte erste beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Muskelgewebe richtig Einfrieren, indem sie in flüssigem Stickstoff eingetaucht wird. Das Problem bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff allein ist, dass es die Bildung einer Stickstoffgasbarriere bewirkt neben das Gewebe, das als Isolator wirkt und hemmt die Kühlung der Gewebe. Um dies zu vermeiden „Dampfdecke“ -Effekt, ein new Kryoröhrchen wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströmung um die Gewebeoberfläche zu erhöhen. Dies wurde durch Stanzen eines insgesamt 14 Einlassöffnungen in der Wand des Fläschchens erreicht. Nach Blasendynamik, eine höhere Rate des Flüssigkeitsstrom führt zu kleineren Blasen und weniger Chancen eine Gasbarriere zu bilden. Wenn flüssiger Stickstoff die Kryoröhrchen durch die Einlasslöcher strömt, ist die Strömungsgeschwindigkeit um das Gewebe schnell genug, um die Gasbarriere zu beseitigen. Im Vergleich zu dem Verfahren von Muskelgewebe Einfrieren unter Verwendung von vorgekühltes Isopentan, ist dieses Protokoll einfacher und effizienter und kann verwendet werden, Muskel in einem Durchsatz Weise einzufrieren. Darüber hinaus ist dieses Verfahren optimal für Institutionen, die keinen Zugang zu Isopentan haben, die bei Raumtemperatur extrem leicht entflammbar ist.

Die Kryoröhrchen Illustration und die gemeinsamen für Laborgeräte Muskeln während der Herstellung von Gefrierschnitten Einfrieren sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Kryoröhrchen sind aus Polypropylen in einer Form Fabrik. Jedes Fläschchen hat insgesamt 14 Einlasslöcher: Ein an der Kappe ist; eine andere ist an der Unterseite; und die verbleibenden 12 bilden vier parallele Leitungen, die jeweils mit vier Bohrungen um 90 ° zueinander. Diese Einlasslöcher können...

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A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Muskelgewebe einzufrieren, indem sie direkt in flüssigen Stickstoff tauchen. Dieses Protokoll zeigt auch eine neue Cryovial, die den „Decke-Effekt“ von Stickstoffgas, wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit der Gewebeoberfläche einer Probe zu vermeiden.

Ein Multi-Loch Cryovial Eliminiert Einfrieren Artefakte, wenn Muskelgewebe wird in flüssigem Stickstoff direkt tauchend

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Aufrufe.  Jiangxi Agricultural University.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Muskelgewebe einzufrieren, indem sie direkt in flüssigen Stickstoff tauchen. Dieses Protokoll zeigt auch eine neue Cryovial, die den „Decke-Effekt“ von Stickstoffgas, wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit der Gewebeoberfläche einer Probe zu vermeiden. 

Serie: A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires a thin layer of vitreous ice containing the biomolecules of interest. Despite numerous technological advances in recent years that have propelled single-particle cryoEM to the forefront of structural biology, the methods by which specimens are vitrified for high-resolution imaging often remain the rate-limiting step. Although numerous recent efforts have provided means to overcome hurdles frequently encountered during specimen vitrification, including the development of novel sample supports and innovative vitrification instrumentation, the traditional manually operated plunger remains a staple in the cryoEM community due to the low cost to purchase and ease of operation. Here, we provide detailed methods for using a standard, guillotine-style manually operated blot-and-plunge device for the vitrification of biological specimens for high-resolution imaging by single-particle cryoEM. Additionally, commonly encountered issues and troubleshooting recommendations for when a standard preparation fails to yield a suitable specimen are also described.

This manuscript outlines the blot-and-plunge method to manually freeze biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.

Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Forschung

Biochemie

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures for rat laryngeal dissection, flash-freezing, and cryosectioning of the vocal folds. This study describes how to cryosection vocal folds in both longitudinal and cross-sectional planes. A novelty of this protocol is the laryngeal tracking during cryosectioning that ensures accurate identification of the intrinsic laryngeal muscles and reduces the chance of tissue loss. Figures demonstrate the progressive cryosectioning in both planes. Twenty-nine rat hemi-larynges were cryosectioned and tracked from the emergence of the thyroid cartilage to the appearance of the first section that included the full vocal fold. The full vocal fold was visualized for all animals in both planes. There was high variability in the distance from the appearance of the thyroid cartilage to the appearance of the full vocal fold in both planes. Weight was not correlated to depth of laryngeal landmarks, suggesting individual variability and other factors related to tissue preparation may be responsible for the high variability in the appearance of landmarks during sectioning. This study details a methodology and presents morphological data for preparing the rat vocal fold for histochemical neuromuscular investigation. Due to high individual variability, laryngeal landmarks should be closely tracked during cryosectioning to prevent oversectioning tissue and tissue loss. The use of a consistent methodology, including adequate tissue preparation and awareness of landmarks within the rat larynx, will assist with consistent results across studies and aid new researchers interested in using the rat vocal fold as a model to investigate laryngeal neuromuscular mechanisms.

This protocol describes methods used to prepare rat vocal folds for histochemical neuromuscular study.

Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Neurowissenschaften

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Biologie

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative prognostic factor for several other disorders such as cardiovascular disease and cancer. Excessive lipid infiltration decreases muscle mass and strength. It also results in lipotoxicity and insulin resistance depending on total intramyocellular lipid content, lipid droplet (LD) morphology, and subcellular distribution. Fiber type (oxidative vs glycolytic) is also important, since oxidative fibers have a greater capacity to utilize lipids. Because of their crucial implications in pathophysiology, in-depth studies on LD dynamics and function in a fiber type-specific manner are warranted.
Herein, a complete protocol is presented for the quantification of intramyocellular lipid content and analysis of LD morphology and subcellular distribution in a fiber type-specific manner. To this end, serial muscle cryosections were stained with the fluorescent dye Bodipy and antibodies against myosin heavy chain isoforms. This protocol enables the simultaneous processing of different muscles, saving time and avoiding possible artifacts and, thanks to a personalized macro created in Fiji, the automatization of LD analysis is also possible.

Increasing evidence indicates that excessive infiltration of lipids inside skeletal muscle results in lipotoxicity and diabetes. Here, we present a complete protocol, including tissue processing, staining with Bodipy, image acquisition, and analysis, to quantify the size, density, and subcellular distribution of lipid droplets in a fiber-type specific manner.

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

Medizin

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Kryogene Probenladung in ein magisches Winkel-Spinning-Kernspinresonanzspektrometer, das die Zelllebensfähigkeit bewahrt

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Regulating Temperature in the Lab: Preserving Samples Using Cold

Preservation of laboratory samples, specimens, and reagents using extreme cold is routinely performed in biomedical research labs. This video will discuss some of the methods for keeping laboratory samples cold and will explain the correct cooling method to use for each experimental requirement.
For example, cooling agents, such as ice and dry ice, are typically used when keeping samples cold during experiments. This video discusses the physical properties of the most commonly used cooling agents, as well as safety precautions for working with them.
When it comes to keeping samples cold in between experiments, cooling equipment, including laboratory grade refrigerators and freezers can be used to preserve samples for extended period of time. Also discussed in this video are types of samples and reagents that can be stored in the commonly-available laboratory cooling equipment.
Finally, the concept of cryopreservation is introduced as a process through which tissues, cells, and biomolecules are cooled to sub-zero temperatures, thereby effectively stopping all sample-degrading biological activity. Several methods of cryopreservation are discussed that minimize or eliminate the formation of damaging ice crystals.

Preserving Samples Using Cold: Cooling Agents and Instruments, and Cryopreservation

Temperaturregulation im Labor: Proben mit Kälte konservieren

Preservation of laboratory samples, specimens, and reagents using extreme cold is routinely performed in biomedical research labs.  This video will ...

Lehre

JoVE Science Education

Grundlegende Biologie

Allgemeine Laborverfahren

Snap Freezing of Muscle Tissue for Sectioning: A Protocol to Obtain Ultrathin Sections of Rapidly Frozen Murine Muscle Tissue

Source: Bonetto, A. et al. <a href="https://www.jove.com/video/54893" target="_blank">The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes the procedure for snap freezing muscle tissue and obtaining its thin sections. The technique can help study cancer-related cachexia in colon cancer mouse models.