تم دعم هذا البحث من خلال منح F31DC017053-01A1 (Lenell، PI) وK23DC014517 (جونسون، PI) من المعهد الوطني للصمم واضطرابات الاتصال الأخرى للمعاهد الوطنية للصحة.

أجريت هذه الدراسة وفقا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة لكلية الطب بجامعة نيويورك.
1. تشريح حنجرة الفئران
<ol><li>قتل الفئران وفقا للبروتوكول المعتمد مؤسسيا. حلق الرقبة البطنية من الفك السفلي إلى المانبوريوم ومسحة مع الكحول لمنع تلوث الفراء في عينات الأنسجة.</li>
	<li>تحت نطاق تشريح مع 10x التكبير استئصال الحنجرة بأكملها عن طريق إنشاء شق الرقبة خط الوسط مع مشرط حتى يتم الكشف عن القصبة الهوائية.</li>
	<li>فصل عضلات الحنجرة البطنية في خط الوسط لفضح الحنجرة باستخدام ملقط وتشريح مقص أو مشرط.</li>
	<li>قطع القصبة الهوائية caudal إلى حلقة القصبة الهوائية الثالثة وجعل rostral شق إلى العظام هيويد لاستئصال الحنجرة كله باستخدام مقص تشريح.</li>
	<li>إزالة أنسجة الحنجرة الخراجية (المريء والغدة الدرقية وعضلات الحنجرة الخراجية) من الحنجرة باستخدام أدوات التشذيب الدقيق (ملاقط ودبابيس وميكروسيسورس) تحت التكبير.</li>
	<li>مع microscissors، تقسيم الحنجرة ظهريا بين الاريتينويدات باستخدام خط الوسط بين عضلات cricoarytenoid الخلفي كمعلم. دبوس الجدران الجانبية للحنجرة لفضح طيات الصوتية ومن ثم تقسيم ventrally من خلال خط الوسط من غضروف الغدة الدرقية بين commissure الأمامي للطيات الصوتية مع microscissors (الشكل 1). ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة اختيارية; يمكن تخطيها للحفاظ على الحنجرة كاملة. يسمح شفط الحنجرة بتقنيات متعددة لاحتواء المناعة باستخدام الجانبين الأيمن والأيساري لنفس الحنجرة بشكل منفصل.</li>
	<li>شطف كل الحنجرة هيمي في محلول الفوسفات العازلة (PBS) ل ~ 10 ق وجافة بدقة مع ممسحة مهمة للحد من تشكيل الكريستال الجليد أثناء التجميد.</li>
</ol>2. إصلاح و / أو فلاش تجميد الأنسجة الحنجرة
ملاحظة: التثبيت قد لا تكون مثالية لكافة بروتوكولات immunostaining. غالبا ما تكون أنسجة الحنجرة طازجة مجمدة بعد تشريحها مباشرة. تخطي الخطوة 2.1 إلى فلاش تجميد الأنسجة الحنجرة دون تثبيت.
<ol><li>لإصلاح الهيمي-larynges وضع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي مليئة 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية في 70 دورة في الدقيقة. نقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وشطف 3x لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني. ثم نقل إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة وتغمر في محلول السكروز 20٪ / 5٪ الجلسرين (~ 18 ساعة أو حتى يغرق الأنسجة) في 4 درجة مئوية. تنبيه: الفورمالديهايد خطر ويجب استخدامه في غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.</li>
	<li>ضع جميع الهيمي-larynges في وضع موحد في قالب التبريد مليئة درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) مركب. لmilarynx، ضع الأنسجة مع السطح المتوسط من أضعاف الصوتية التي تواجه الجزء السفلي من cryomold والجانب الطولي للطية الصوتية موازية للحافة السفلى من افتتاح cryomold. لالحنجرة كله، ضع الأنسجة مع cricoarytenoids الخلفية التي تواجه الجزء السفلي من cryomold والجانب الطولي للطية الصوتية موازية للحافة السفلى من افتتاح cryomold. ملاحظة: اتجاه الحنجرة متسقة داخل مركب أكتوبر أمر بالغ الأهمية ل cryosectioning من أضعاف الصوتية الفئران. بمجرد أن يتم تضمين اللبن وتجميده ، يجب إذابته لتغيير اتجاهه ، وبالتالي إدخال مخاطر تلف الأنسجة من دورات تجميد ذوبان الجليد المتعددة.</li>
	<li>أنسجة التجميد الفلاشي باستخدام الأزوبينتان (2-ميثيل بوتان) المبردة في كوب من الصلب محاط بالنيتروجين السائل. ملاحظة: تصل درجة الحرارة الاثيوبية إلى درجة الحرارة المثلى لتجميد الأنسجة عندما يبدأ الترسب الأبيض في التشكل على جانبي وأسفل الكأس13. يستخدم الإسوبينتان لأنه يحتوي على موصلية حرارية أعلى من النيتروجين السائل ، مما يساعد على منع تكسير كتلة الأنسجة أثناء التجميد السريع. للحصول على وصف أكثر تفصيلا للأنسجة المجمدة في OTC، راجع كومار وآخرون.13.</li>
	<li>التفاف كل قالب في احباط prelabeled ووضعها في كيس التجميد الفردية لمنع الجفاف وتخزينها على الفور على الجليد الجاف حتى نقلها للتخزين في الثلاجة -80 درجة مئوية.</li>
</ol>3. Cryosection الهيلاتريكس في طائرة مقطعية
<ol><li>تعيين درجة حرارة الغرفة في cryostat إلى -20 درجة مئوية، والتي هي في منتصف نطاق درجة الحرارة (15−25 درجة مئوية) الموصى بها لقسم الأنسجة العضلية من قبل دليل الشركة المصنعة.</li>
	<li>تعيين سمك قسم cryostat إلى أقسام سميكة 10 ميكرومتر. ملاحظة: لتحليل الألياف العضلية المقطعية، تعتبر المقاطع السميكة 10 ميكرومترات مثالية للسماح بالتلطيخ الكامل وكثافة التصوير القوية لألياف العضلات المسماة لتحليل كتابة الألياف14,15,16. قد تتطلب بعض البروتوكولات سمك مقطع مختلف اعتمادا على الأهداف العصبية والعضلية.</li>
	<li>نقل الأنسجة إلى غرفة cryostat، إضافة طبقة موحدة من مركب أكتوبر على قرص عينة cryostat (تشاك)، ووضع كتلة الأنسجة المضمنة على رأس مركب أكتوبر على قرص العينة. للحصول على مقاطع عرضية من أضعاف الصوتية لتحليل الألياف العضلية الغدة الدرقية (TA) ، لصق العينة إلى تشاك بحيث الغضروف الغدة الدرقية البطني يواجه شفرة cryostat والغضاريف أريتينويد يواجه قرص العينة. ملاحظة: من المهم ملاحظة أن هذه المعالم غير مرئية في هذه المرحلة، بسبب أن مركب OCT يصبح أبيض ومبهم عند تجميده. هذا النقص في الرؤية هو السبب في أنه من الأهمية بمكان ملاحظة اتجاه الهميلاتريكس خلال مرحلة تجميد الفلاش.</li>
	<li>تقليم مركب أكتوبر عن طريق التقدم رأس العينة من قبل 100 ميكرومتر حتى الجزء البطني من غضروف الغدة الدرقية يظهر.</li>
	<li>ثم تقليم وتتبع 30 مقطع μm من بداية غضروف الغدة الدرقية حتى يتم الكشف عن البربريا الصفيحة, عضلات TA وسيطة, والعضلات TA الجانبية. ملاحظة: يجب تتبع معالم الحنجرة والملاحظة منذ بداية غضروف الغدة الدرقية كل 100 ميكرومتر لضمان عدم انحراف زاوية المقطع. الشكل 2 يمثل مجموعتين من معالم الحنجرة في الطائرة المقطعية العرضية في التكبير 10x.</li>
	<li>بمجرد الوصول إلى عضلة TA المستهدفة ، اجمع مقاطع على الشرائح المشحونة بشكل إيجابي عند 10 ميكرومتر.</li>
	<li>تخزين أقسام في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية للاحتفاظ الرطوبة حتى تكون جاهزة لتكون ملطخة. ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة الثابتة في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى أسبوع واحد اعتمادا على هدف IHC في حين يجب معالجة الأنسجة غير المثبتة على الفور.</li>
</ol>4. Cryosection الهميلاتريكس في الطائرة الطولية
<ol><li>مع غرفة cryostat تعيين مرة أخرى إلى -20 درجة مئوية، تغيير سمك القسم إلى 30 ميكرومتر. ملاحظة: بالنسبة لتحليل NMJ، يمكن استخدام سمك الأنسجة بين 30−60 ميكرومتر لالتقاط العديد من NMJs كاملة داخل عضلات الحنجرة دون تجزئة إما محطة الأعصاب أو لوحة النهاية الحركية11,12,17.</li>
	<li>للحصول على أقسام طيات صوتية طولية لتحليل NMJ لعضلات TA ، قم بلصق العينات على تشاك بحيث يتم توجيه epiglottis نحو شفرة cryostat ويواجه التجويف القصبي لأسفل نحو قرص العينة.</li>
	<li>تقليم مركب أكتوبر عن طريق التقدم رأس العينة من قبل 100 ميكرومتر حتى يظهر غضروف الغدة الدرقية.</li>
	<li>تقليم وتتبع أقسام من 30 ميكرومتر من بداية الغدة الدرقية حتى يتم الكشف عن البربريا الصفيحة والانقسامات الوسيطة والظرية من عضلة TA. ملاحظة: يوصى بخمس مجموعات من معالم الحنجرة في الطائرة الطولية لتتبع تطور عمق الأنسجة نحو عضلة TA المستهدفة. الشكل 3 يمثل معالم الحنجرة في الطائرة الطولية في التكبير 10x.</li>
	<li>بمجرد الوصول إلى عضلة TA المستهدفة ، اجمع المقاطع على الشرائح المشحونة بشكل إيجابي عند 30 ميكرومتر.</li>
	<li>تخزين أقسام في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية للاحتفاظ الرطوبة حتى تكون جاهزة لتكون ملطخة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

إعداد طيات الفئران الصوتية للتحليل العصبي العضلي يمكن أن تقدم مع تحديات مختلفة. ليس فقط عضلات الحنجرة صغيرة ومحاطة الغضاريف، مما يجعل من الصعب استخراج العضلات المستهدفة مباشرة، تم العثور على تباين كبير أيضا بين الحيوانات في عمق المعالم التشريحية الحنجرة. بالنسبة للعضلات بروتوكول مستوى ?...

حنجرة الفئران هو نموذج راسخ للتحقيق في التكيف الهيكلي والوظيفي للحنجرة العصبية العضلية مع التنمية والشيخوخة والمرض والعوامل الدوائية1،2،3،4،5. اتساق الأساليب النسيجية أمر بالغ الأهمية لهذا الخط من العمل، كما أن هناك تعقيدات متعددة تشارك في إعداد العضلات وتحليلها، فضلا عن التحديات المرتبطة حجم الحنجرة، والشكل، وتضاريس العضلات مغلفة داخل الغضاريف الحنجرة1،6،7،8،9،10،11 . نظرا لصغر حجم عضلات الحنجرة الجوهرية للفئران ، فإن التضمين المنهجي والتجميد والتشخيص البردي أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج متسقة ودقيقة. على سبيل المثال، عند تقسيم أضعاف صوت الفئران في الطائرة التاجية، تقع التقاطعات العصبية العضلية (NMJs) لأربعة من عضلات الحنجرة الجوهرية ضمن أقل من 1.8 مم من عمق الأنسجة11. لذلك ، فإن الرصد الدقيق لتشريح العضلات الحنجرة أثناء عملية استئصال الأعصاب أمر حتمي لتحديد القسم (المقاطع) ذات الاهتمام بدقة ومنع الإفراط في استئصال الأنسجة. يمكن أن يؤدي الإفراط في استئصال العضلات المستهدفة إلى تحديد غير دقيق لعدد وتضاريس NMJs11 أو يمكن أن يؤدي إلى تخفيضات إجمالية في حجم العينة إذا تم التخلص من العضلات المستهدفة بسبب ارتباك التوجه التاريخي12. كما يتم تطوير نماذج جديدة لدراسة العضلات الحنجرة والتكيفات الخاصة بهم، إجراءات التشغيل القياسية ضرورية لضمان النتائج دقيقة وموثوق بها، وقابلة للاستنساخ عبر الدراسات.
الهدف من هذه المقالة هو إعداد مفصل للطية الصوتية الفئران للتحليل الطولي والمقطعي الأمثل. يتم وصف الطرق التفصيلية المستخدمة بانتظام في مختبرنا لتحديد معالم العضلات المستهدفة أثناء عملية استئصال التبريد. على الرغم من استخدام أساليب مماثلة في العديد من المختبرات ، يتم توفير تفاصيل أكبر هنا مما هو عليه في الأدبيات لضمان تكرار موثوق ودقيق عند تنفيذه من قبل المحققين المبتدئين. الهدف من هذا البرنامج التعليمي هو توفير منهجية قياسية لتقييم الكيمياء المناعية (IHC) للطية الصوتية الفئران لتحسين الاتساق عبر المختبرات والتحقيقات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane Certified</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>35514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1213101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo Tongs SS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11679123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat blades</td>
			<td>C.L. Sturkey D554X50</td>
			<td>22-210-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Underpads</td>
			<td>Medline</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9996969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS - Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>11999054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostain Moisture Chamber</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>NC9425474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.B148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Troemner</td>
			<td>02-217-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Storage Bags</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>19240093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td>
			<td>Polar Ware</td>
			<td>114231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task wiper</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#8482; 34155</td>
			<td>06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>2261840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Pattern Scissors</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.SAS15RV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

الغرض من هذا البرنامج التعليمي هو وصف إعداد أضعاف الصوتية الفئران لدراسة الهستوكيميائية العصبية والعضلية. يحدد هذا البروتوكول إجراءات تشريح الحنجرة للفئران وتجميد الفلاش والتبريد للطيات الصوتية. تصف هذه الدراسة كيفية طيات صوتية بالتبريد في كل من الطائرات الطولية والمقطعية. الجدة من هذا البروتوكول هو تتبع الحنجرة أثناء عملية استئصال الشعر بالتبريد التي تضمن تحديد دقيق للعضلات الحنجرة الجوهرية ويقلل من فرصة فقدان الأنسجة. وتظهر الأرقام عملية البكاء التدريجية في كلا الطائرتين. تم استئصال 29 فأرا من الهيمي-لالحنجرة وتعقبها من ظهور غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور القسم الأول الذي تضمن الحظيرة الصوتية الكاملة. تم تصور أضعاف الصوتية الكاملة لجميع الحيوانات في كلا الطائرتين. كان هناك تباين كبير في المسافة من مظهر غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور أضعاف الصوتية الكاملة في كلا الطائرتين. لم يكن الوزن مرتبطا بعمق معالم الحنجرة ، مما يشير إلى أن التباين الفردي والعوامل الأخرى المتعلقة بإعداد الأنسجة قد تكون مسؤولة عن التباين العالي في ظهور المعالم أثناء القسمة. هذه الدراسة تفاصيل منهجية ويقدم البيانات المورفولوجية لإعداد حظيرة الفئران الصوتية للتحقيق العصبي العضلي الهسوشية. نظرا للتغير الفردي العالي ، يجب تتبع معالم الحنجرة عن كثب أثناء عملية استئصال الشعر لمنع فقدان الأنسجة والأنسجة. وسيساعد استخدام منهجية متسقة، بما في ذلك إعداد الأنسجة الكافية والوعي بالمعالم داخل حنجرة الفئران، في تحقيق نتائج متسقة عبر الدراسات ومساعدة الباحثين الجدد المهتمين باستخدام الحظيرة الصوتية للفئران كنموذج للتحقيق في الآليات العصبية العضلية الحنجرة.

وكانت النتائج التمثيلية جزءا من تحقيق جار في آثار التمارين الصوتية على الجهاز العصبي العضلي الحنجري. تم وزن وقتل تسعة وعشرين من الذكور فيشر 344/brown النرويج الفئران (12 9 أشهر من العمر، 17 24 شهرا) مع استنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها استئصال الصدر الثنائية.
اتبعت الإجراءات ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة لإعداد طيات صوتية للفئران للدراسة العصبية العضلية الهسكيميائية.

إعداد أضعاف الصوتية الجرذ للتحليلات العصبية والعضلية

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.6K Views.  New York University School of Medicine. يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة لإعداد طيات صوتية للفئران للدراسة العصبية العضلية الهسكيميائية.

Video: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

المورفومترية التحليلات من أقسام الشبكية

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of EEG data and have been widely used to investigate the neural mechanisms in some brain disorders. The goal of this article is to describe the protocol underlying EEG microstate and omega complexity analyses step by step. The main advantage of these two measures is that they could eliminate the reference-dependent problem inherent to traditional spectrum analysis. In addition, microstate analysis makes good use of high time resolution of resting-state EEG, and the four obtained microstate classes could match the corresponding resting-state networks respectively. The omega complexity characterizes the spatial complexity of the whole brain or specific brain regions, which has obvious advantage compared with traditional complexity measures focusing on the signal complexity in a single channel. These two EEG measures could complement each other to investigate the brain complexity from the temporal and spatial domain respectively.

This article describes the protocol underlying electroencephalography (EEG) microstate analysis and omega complexity analysis, which are two reference-free EEG measures and highly valuable to explore the neural mechanisms of brain disorders.

ميكروستاتي وتحليل تعقيد أوميغا المخ الدولة يستريح

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ex vivo preparation of the levator auris longus (LAL) is used because it is a thin muscle that provides easy visualization of the neuromuscular junction for microelectrode impalement at the motor endplate. This method allows for the recording of spontaneous miniature endplate potentials and currents (mEPPs and mEPCs), nerve-evoked endplate potentials and currents (EPPs and EPCs), as well as the membrane properties of the motor endplate. Results obtained from this method include the quantal content (QC), number of vesicle release sites (n), probability of vesicle release (prel), synaptic facilitation and depression, as well as the muscle membrane time constant (&#964;m) and input resistance. Application of this technique to mouse models of human disease can highlight key pathologies in disease states and help identify novel treatment strategies. By fully voltage-clamping a single synapse, this method provides one of the most detailed analyses of synaptic transmission currently available.

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

The protocol described in this paper uses the mouse levator auris longus (LAL) muscle to record spontaneous and nerve-evoked postsynaptic potentials (current-clamp) and currents (voltage-clamp) at the neuromuscular junction. Use of this technique can provide key insights into mechanisms of synaptic transmission under normal and disease conditions.

عضلة رافعة أوريس التحضير لدراسة انتقال الأعصاب الثدييات المشبك في ظروف الجهد

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high morphological and functional plasticity. In numerous nervous system disorders, NMJ is an early pathological target resulting in neurotransmission failure, weakness, atrophy, and even in muscle fiber death. Due to its relevance, the possibility to quantitatively assess certain aspects of the relationship between NMJ components can help to understand the processes associated with its assembly/disassembly. The first obstacle when working with muscles is to gain the technical expertise to quickly identify and dissect without damaging their fibers. The second challenge is to utilize high-quality detection methods to obtain NMJ images that can be used to perform quantitative analysis. This article presents a step-by-step protocol for dissecting extensor digitorum longus and soleus muscles from rats. It also explains the use of immunofluorescence to visualize pre and postsynaptic elements of whole-mount NMJs. Results obtained demonstrate that this technique can be used to establish the microscopic anatomy of the synapsis and identify subtle changes in the status of some of its components under physiological or pathological conditions.

The ability to accurately detect neuromuscular junction components is crucial in evaluating modifications in its architecture because of pathological or developmental processes. Here we present a complete description of a straightforward method to obtain high-quality images of whole-mount neuromuscular junctions that can be used to perform quantitative measurements.

تشريح ألياف العضلات الهيكل العظمي واحد للتحليلات Immunofluorescent ومورفومتري من تقاطعات العضلات العصبية جبل كامل

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

توسيع مجموعة أدوات التصوير في الجسم الحي للنقل المحوري

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. This work describes the preparation of rat sciatic nerves for ex vivo neurophysiology, including buffer preparation, animal procedures, equipment setup and neurophysiological recording. This work provides an overview of the different types of experiments possible with this method. The outlined method aims to provide 6 h of stimulation and recording on extracted peripheral nerve tissue in tightly controlled conditions for optimal consistency in results. Results obtained using this method are A-fibre compound action potentials (CAP) with peak-to-peak amplitudes in the millivolt range over the entire duration of the experiment. CAP amplitudes and shapes are consistent and reliable, making them useful to test and compare new electrodes to existing models, or the effects of interventions on the tissue, such as the use of chemicals, surgical alterations, or neuromodulatory stimulation techniques. Both conventional commercially available cuff electrodes with platinum-iridium contacts and custom-made conductive elastomer electrodes were tested and gave similar results in terms of nerve stimulus strength-duration response.

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

This protocol describes the preparation of rat whole sciatic nerve tissue for ex vivo electrophysiological stimulation and recording in an environmentally-regulated, two-compartment, perfused saline bath.

تحضير العصب الوركي للفئران للفسيولوجيا العصبية خارج الجسم الحي

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...