تم دعم هذا البحث من خلال منح F31DC017053-01A1 (Lenell، PI) وK23DC014517 (جونسون، PI) من المعهد الوطني للصمم واضطرابات الاتصال الأخرى للمعاهد الوطنية للصحة.

أجريت هذه الدراسة وفقا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة لكلية الطب بجامعة نيويورك.
1. تشريح حنجرة الفئران
<ol><li>قتل الفئران وفقا للبروتوكول المعتمد مؤسسيا. حلق الرقبة البطنية من الفك السفلي إلى المانبوريوم ومسحة مع الكحول لمنع تلوث الفراء في عينات الأنسجة.</li>
	<li>تحت نطاق تشريح مع 10x التكبير استئصال الحنجرة بأكملها عن طريق إنشاء شق الرقبة خط الوسط مع مشرط حتى يتم الكشف عن القصبة الهوائية.</li>
	<li>فصل عضلات الحنجرة البطنية في خط الوسط لفضح الحنجرة باستخدام ملقط وتشريح مقص أو مشرط.</li>
	<li>قطع القصبة الهوائية caudal إلى حلقة القصبة الهوائية الثالثة وجعل rostral شق إلى العظام هيويد لاستئصال الحنجرة كله باستخدام مقص تشريح.</li>
	<li>إزالة أنسجة الحنجرة الخراجية (المريء والغدة الدرقية وعضلات الحنجرة الخراجية) من الحنجرة باستخدام أدوات التشذيب الدقيق (ملاقط ودبابيس وميكروسيسورس) تحت التكبير.</li>
	<li>مع microscissors، تقسيم الحنجرة ظهريا بين الاريتينويدات باستخدام خط الوسط بين عضلات cricoarytenoid الخلفي كمعلم. دبوس الجدران الجانبية للحنجرة لفضح طيات الصوتية ومن ثم تقسيم ventrally من خلال خط الوسط من غضروف الغدة الدرقية بين commissure الأمامي للطيات الصوتية مع microscissors (الشكل 1). ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة اختيارية; يمكن تخطيها للحفاظ على الحنجرة كاملة. يسمح شفط الحنجرة بتقنيات متعددة لاحتواء المناعة باستخدام الجانبين الأيمن والأيساري لنفس الحنجرة بشكل منفصل.</li>
	<li>شطف كل الحنجرة هيمي في محلول الفوسفات العازلة (PBS) ل ~ 10 ق وجافة بدقة مع ممسحة مهمة للحد من تشكيل الكريستال الجليد أثناء التجميد.</li>
</ol>2. إصلاح و / أو فلاش تجميد الأنسجة الحنجرة
ملاحظة: التثبيت قد لا تكون مثالية لكافة بروتوكولات immunostaining. غالبا ما تكون أنسجة الحنجرة طازجة مجمدة بعد تشريحها مباشرة. تخطي الخطوة 2.1 إلى فلاش تجميد الأنسجة الحنجرة دون تثبيت.
<ol><li>لإصلاح الهيمي-larynges وضع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي مليئة 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية في 70 دورة في الدقيقة. نقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وشطف 3x لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني. ثم نقل إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة وتغمر في محلول السكروز 20٪ / 5٪ الجلسرين (~ 18 ساعة أو حتى يغرق الأنسجة) في 4 درجة مئوية. تنبيه: الفورمالديهايد خطر ويجب استخدامه في غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.</li>
	<li>ضع جميع الهيمي-larynges في وضع موحد في قالب التبريد مليئة درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) مركب. لmilarynx، ضع الأنسجة مع السطح المتوسط من أضعاف الصوتية التي تواجه الجزء السفلي من cryomold والجانب الطولي للطية الصوتية موازية للحافة السفلى من افتتاح cryomold. لالحنجرة كله، ضع الأنسجة مع cricoarytenoids الخلفية التي تواجه الجزء السفلي من cryomold والجانب الطولي للطية الصوتية موازية للحافة السفلى من افتتاح cryomold. ملاحظة: اتجاه الحنجرة متسقة داخل مركب أكتوبر أمر بالغ الأهمية ل cryosectioning من أضعاف الصوتية الفئران. بمجرد أن يتم تضمين اللبن وتجميده ، يجب إذابته لتغيير اتجاهه ، وبالتالي إدخال مخاطر تلف الأنسجة من دورات تجميد ذوبان الجليد المتعددة.</li>
	<li>أنسجة التجميد الفلاشي باستخدام الأزوبينتان (2-ميثيل بوتان) المبردة في كوب من الصلب محاط بالنيتروجين السائل. ملاحظة: تصل درجة الحرارة الاثيوبية إلى درجة الحرارة المثلى لتجميد الأنسجة عندما يبدأ الترسب الأبيض في التشكل على جانبي وأسفل الكأس13. يستخدم الإسوبينتان لأنه يحتوي على موصلية حرارية أعلى من النيتروجين السائل ، مما يساعد على منع تكسير كتلة الأنسجة أثناء التجميد السريع. للحصول على وصف أكثر تفصيلا للأنسجة المجمدة في OTC، راجع كومار وآخرون.13.</li>
	<li>التفاف كل قالب في احباط prelabeled ووضعها في كيس التجميد الفردية لمنع الجفاف وتخزينها على الفور على الجليد الجاف حتى نقلها للتخزين في الثلاجة -80 درجة مئوية.</li>
</ol>3. Cryosection الهيلاتريكس في طائرة مقطعية
<ol><li>تعيين درجة حرارة الغرفة في cryostat إلى -20 درجة مئوية، والتي هي في منتصف نطاق درجة الحرارة (15−25 درجة مئوية) الموصى بها لقسم الأنسجة العضلية من قبل دليل الشركة المصنعة.</li>
	<li>تعيين سمك قسم cryostat إلى أقسام سميكة 10 ميكرومتر. ملاحظة: لتحليل الألياف العضلية المقطعية، تعتبر المقاطع السميكة 10 ميكرومترات مثالية للسماح بالتلطيخ الكامل وكثافة التصوير القوية لألياف العضلات المسماة لتحليل كتابة الألياف14,15,16. قد تتطلب بعض البروتوكولات سمك مقطع مختلف اعتمادا على الأهداف العصبية والعضلية.</li>
	<li>نقل الأنسجة إلى غرفة cryostat، إضافة طبقة موحدة من مركب أكتوبر على قرص عينة cryostat (تشاك)، ووضع كتلة الأنسجة المضمنة على رأس مركب أكتوبر على قرص العينة. للحصول على مقاطع عرضية من أضعاف الصوتية لتحليل الألياف العضلية الغدة الدرقية (TA) ، لصق العينة إلى تشاك بحيث الغضروف الغدة الدرقية البطني يواجه شفرة cryostat والغضاريف أريتينويد يواجه قرص العينة. ملاحظة: من المهم ملاحظة أن هذه المعالم غير مرئية في هذه المرحلة، بسبب أن مركب OCT يصبح أبيض ومبهم عند تجميده. هذا النقص في الرؤية هو السبب في أنه من الأهمية بمكان ملاحظة اتجاه الهميلاتريكس خلال مرحلة تجميد الفلاش.</li>
	<li>تقليم مركب أكتوبر عن طريق التقدم رأس العينة من قبل 100 ميكرومتر حتى الجزء البطني من غضروف الغدة الدرقية يظهر.</li>
	<li>ثم تقليم وتتبع 30 مقطع μm من بداية غضروف الغدة الدرقية حتى يتم الكشف عن البربريا الصفيحة, عضلات TA وسيطة, والعضلات TA الجانبية. ملاحظة: يجب تتبع معالم الحنجرة والملاحظة منذ بداية غضروف الغدة الدرقية كل 100 ميكرومتر لضمان عدم انحراف زاوية المقطع. الشكل 2 يمثل مجموعتين من معالم الحنجرة في الطائرة المقطعية العرضية في التكبير 10x.</li>
	<li>بمجرد الوصول إلى عضلة TA المستهدفة ، اجمع مقاطع على الشرائح المشحونة بشكل إيجابي عند 10 ميكرومتر.</li>
	<li>تخزين أقسام في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية للاحتفاظ الرطوبة حتى تكون جاهزة لتكون ملطخة. ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة الثابتة في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى أسبوع واحد اعتمادا على هدف IHC في حين يجب معالجة الأنسجة غير المثبتة على الفور.</li>
</ol>4. Cryosection الهميلاتريكس في الطائرة الطولية
<ol><li>مع غرفة cryostat تعيين مرة أخرى إلى -20 درجة مئوية، تغيير سمك القسم إلى 30 ميكرومتر. ملاحظة: بالنسبة لتحليل NMJ، يمكن استخدام سمك الأنسجة بين 30−60 ميكرومتر لالتقاط العديد من NMJs كاملة داخل عضلات الحنجرة دون تجزئة إما محطة الأعصاب أو لوحة النهاية الحركية11,12,17.</li>
	<li>للحصول على أقسام طيات صوتية طولية لتحليل NMJ لعضلات TA ، قم بلصق العينات على تشاك بحيث يتم توجيه epiglottis نحو شفرة cryostat ويواجه التجويف القصبي لأسفل نحو قرص العينة.</li>
	<li>تقليم مركب أكتوبر عن طريق التقدم رأس العينة من قبل 100 ميكرومتر حتى يظهر غضروف الغدة الدرقية.</li>
	<li>تقليم وتتبع أقسام من 30 ميكرومتر من بداية الغدة الدرقية حتى يتم الكشف عن البربريا الصفيحة والانقسامات الوسيطة والظرية من عضلة TA. ملاحظة: يوصى بخمس مجموعات من معالم الحنجرة في الطائرة الطولية لتتبع تطور عمق الأنسجة نحو عضلة TA المستهدفة. الشكل 3 يمثل معالم الحنجرة في الطائرة الطولية في التكبير 10x.</li>
	<li>بمجرد الوصول إلى عضلة TA المستهدفة ، اجمع المقاطع على الشرائح المشحونة بشكل إيجابي عند 30 ميكرومتر.</li>
	<li>تخزين أقسام في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية للاحتفاظ الرطوبة حتى تكون جاهزة لتكون ملطخة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

إعداد طيات الفئران الصوتية للتحليل العصبي العضلي يمكن أن تقدم مع تحديات مختلفة. ليس فقط عضلات الحنجرة صغيرة ومحاطة الغضاريف، مما يجعل من الصعب استخراج العضلات المستهدفة مباشرة، تم العثور على تباين كبير أيضا بين الحيوانات في عمق المعالم التشريحية الحنجرة. بالنسبة للعضلات بروتوكول مستوى ?...

حنجرة الفئران هو نموذج راسخ للتحقيق في التكيف الهيكلي والوظيفي للحنجرة العصبية العضلية مع التنمية والشيخوخة والمرض والعوامل الدوائية1،2،3،4،5. اتساق الأساليب النسيجية أمر بالغ الأهمية لهذا الخط من العمل، كما أن هناك تعقيدات متعددة تشارك في إعداد العضلات وتحليلها، فضلا عن التحديات المرتبطة حجم الحنجرة، والشكل، وتضاريس العضلات مغلفة داخل الغضاريف الحنجرة1،6،7،8،9،10،11 . نظرا لصغر حجم عضلات الحنجرة الجوهرية للفئران ، فإن التضمين المنهجي والتجميد والتشخيص البردي أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج متسقة ودقيقة. على سبيل المثال، عند تقسيم أضعاف صوت الفئران في الطائرة التاجية، تقع التقاطعات العصبية العضلية (NMJs) لأربعة من عضلات الحنجرة الجوهرية ضمن أقل من 1.8 مم من عمق الأنسجة11. لذلك ، فإن الرصد الدقيق لتشريح العضلات الحنجرة أثناء عملية استئصال الأعصاب أمر حتمي لتحديد القسم (المقاطع) ذات الاهتمام بدقة ومنع الإفراط في استئصال الأنسجة. يمكن أن يؤدي الإفراط في استئصال العضلات المستهدفة إلى تحديد غير دقيق لعدد وتضاريس NMJs11 أو يمكن أن يؤدي إلى تخفيضات إجمالية في حجم العينة إذا تم التخلص من العضلات المستهدفة بسبب ارتباك التوجه التاريخي12. كما يتم تطوير نماذج جديدة لدراسة العضلات الحنجرة والتكيفات الخاصة بهم، إجراءات التشغيل القياسية ضرورية لضمان النتائج دقيقة وموثوق بها، وقابلة للاستنساخ عبر الدراسات.
الهدف من هذه المقالة هو إعداد مفصل للطية الصوتية الفئران للتحليل الطولي والمقطعي الأمثل. يتم وصف الطرق التفصيلية المستخدمة بانتظام في مختبرنا لتحديد معالم العضلات المستهدفة أثناء عملية استئصال التبريد. على الرغم من استخدام أساليب مماثلة في العديد من المختبرات ، يتم توفير تفاصيل أكبر هنا مما هو عليه في الأدبيات لضمان تكرار موثوق ودقيق عند تنفيذه من قبل المحققين المبتدئين. الهدف من هذا البرنامج التعليمي هو توفير منهجية قياسية لتقييم الكيمياء المناعية (IHC) للطية الصوتية الفئران لتحسين الاتساق عبر المختبرات والتحقيقات.

<table><tbody><tr><td>2-Methylbutane Certified</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Tongs SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat blades</td><td>C.L. Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Underpads</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Section Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Bel-Art</td><td>11999054</td><td></td></tr><tr><td>Immunostain Moisture Chamber</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Needle holders</td><td>Assi</td><td>ASSI.B148</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Storage Bags</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Task wiper</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;trade; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Pattern Scissors</td><td>Assi</td><td>ASSI.SAS15RV</td><td></td></tr><tr><td>NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

الغرض من هذا البرنامج التعليمي هو وصف إعداد أضعاف الصوتية الفئران لدراسة الهستوكيميائية العصبية والعضلية. يحدد هذا البروتوكول إجراءات تشريح الحنجرة للفئران وتجميد الفلاش والتبريد للطيات الصوتية. تصف هذه الدراسة كيفية طيات صوتية بالتبريد في كل من الطائرات الطولية والمقطعية. الجدة من هذا البروتوكول هو تتبع الحنجرة أثناء عملية استئصال الشعر بالتبريد التي تضمن تحديد دقيق للعضلات الحنجرة الجوهرية ويقلل من فرصة فقدان الأنسجة. وتظهر الأرقام عملية البكاء التدريجية في كلا الطائرتين. تم استئصال 29 فأرا من الهيمي-لالحنجرة وتعقبها من ظهور غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور القسم الأول الذي تضمن الحظيرة الصوتية الكاملة. تم تصور أضعاف الصوتية الكاملة لجميع الحيوانات في كلا الطائرتين. كان هناك تباين كبير في المسافة من مظهر غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور أضعاف الصوتية الكاملة في كلا الطائرتين. لم يكن الوزن مرتبطا بعمق معالم الحنجرة ، مما يشير إلى أن التباين الفردي والعوامل الأخرى المتعلقة بإعداد الأنسجة قد تكون مسؤولة عن التباين العالي في ظهور المعالم أثناء القسمة. هذه الدراسة تفاصيل منهجية ويقدم البيانات المورفولوجية لإعداد حظيرة الفئران الصوتية للتحقيق العصبي العضلي الهسوشية. نظرا للتغير الفردي العالي ، يجب تتبع معالم الحنجرة عن كثب أثناء عملية استئصال الشعر لمنع فقدان الأنسجة والأنسجة. وسيساعد استخدام منهجية متسقة، بما في ذلك إعداد الأنسجة الكافية والوعي بالمعالم داخل حنجرة الفئران، في تحقيق نتائج متسقة عبر الدراسات ومساعدة الباحثين الجدد المهتمين باستخدام الحظيرة الصوتية للفئران كنموذج للتحقيق في الآليات العصبية العضلية الحنجرة.

وكانت النتائج التمثيلية جزءا من تحقيق جار في آثار التمارين الصوتية على الجهاز العصبي العضلي الحنجري. تم وزن وقتل تسعة وعشرين من الذكور فيشر 344/brown النرويج الفئران (12 9 أشهر من العمر، 17 24 شهرا) مع استنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها استئصال الصدر الثنائية.
اتبعت الإجراءات ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة لإعداد طيات صوتية للفئران للدراسة العصبية العضلية الهسكيميائية.

إعداد أضعاف الصوتية الجرذ للتحليلات العصبية والعضلية

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.6K Views.  New York University School of Medicine. يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة لإعداد طيات صوتية للفئران للدراسة العصبية العضلية الهسكيميائية.

Video: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

الفسيولوجية والمورفولوجية وتوصيف الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية عن طريق التضمين الحركة

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

استهدف التدريب من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في الجرذان المسنين وباركنسونية

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if any, therapies exist that target age-related laryngeal muscle dysfunction. Neurotrophins are involved in muscle innervation and differentiation of neuromuscular junctions (NMJs). It is thought that neurotrophins enhance neuromuscular transmission by increasing neurotransmitter release. The neuromuscular junctions (NMJs) become smaller and less abundant in aging rat laryngeal muscles, with evidence of functional denervation. We explored the effects of NTF4 for future clinical use as a therapeutic to improve function in aging human laryngeal muscles. Here, we provide the detailed protocol for systemic application and direct injection of NTF4 to investigate the ability of aging rat laryngeal muscle to remodel in response to NTF4 application. In this method, rats either received NTF4 either systemically via osmotic pump or by direct injection through the vocal folds. Laryngeal muscles were then dissected and used for histological examination of morphology and age-related denervation.

Here, we present a protocol to describe the use of neurotrophin 4 (NTF4) systemically and directly to remodel rat aging laryngeal muscles.

تحت الجلد نيوروتروفين 4 التسريب باستخدام مضخات التناضحي أو الحقن العضلي المباشر يعزز الشيخوخة الجرذ العضلات الحنجرة

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Developmental Biology

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

زرع الخلايا الشمية مغمد لتقييم الانتعاش وظيفية بعد إصابة العصب المحيطي

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

A نموذج من الفئران اصابات الحبل الشوكي عنق الرحم لدراسة مرحلة ما بعد التقرحي الجهاز التنفسي المرونة العصبية

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Medicine

3D الطباعة من نماذج متعددة الطبقات سيليكون الصوتية أضعاف

Manufacturing Process for Non-Adhesive Super-Soft Vocal Fold Models

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal fold models results in models with undesirable properties, such as stickiness and reproducibility issues. Those vocal fold models are prone to rapid aging, leading to poor comparability across different measurements. In this study, we propose a modification to the manufacturing process by changing the order of layering the silicone material, which leads to the production of non-sticky and highly consistent vocal fold models. We also compare a model produced using this method with a conventionally manufactured vocal fold model that is adversely affected by its sticky surface. We detail the manufacturing process and characterize the properties of the models for potential applications. The outcomes of the study demonstrate the efficacy of the modified fabrication method, highlighting the superior qualities of our non-sticky vocal fold models.&#160;The findings contribute to the development of realistic and reliable vocal fold models for research and clinical applications.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في تصنيع نماذج الطيات الصوتية الاصطناعية للتطبيقات الصوتية والروبوتية

This study demonstrates the manufacturing of non-sticky and super-soft vocal fold models by introducing a specific way to create the vocal fold layers, providing a detailed description of the manufacturing procedure, and characterizing the properties of the models.

عملية التصنيع لنماذج الطيات الصوتية فائقة النعومة غير اللاصقة

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal ...

Engineering

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

في فيفو تقييم الخصائص الميكانيكية و اللزجة من اللسان الجرذ

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Endoscopic Approach for Studying Laryngeal Dysfunction in Rodents

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close&#45;Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to impair laryngeal function, which results in difficulty&#160;breathing (dyspnea), swallowing impairment (dysphagia), and/or voice impairment (dysphonia). Dysphagia, in particular, can lead to aspiration pneumonia and associated morbidity, recurrent hospitalization, and early mortality. Despite these serious consequences, existing treatments for laryngeal dysfunction are largely aimed at surgical and behavioral interventions that unfortunately do not typically restore normal laryngeal function, thus highlighting the urgent need for innovative solutions.
To bridge this gap, we have been developing an experimental endoscopic approach to investigate laryngeal dysfunction in murine (i.e., mouse and rat) models. However, endoscopy in rodents is quite challenging due to their small size relative to current endoscope technology, anatomical differences in the upper airway, and the necessity for anesthesia to optimally access the larynx. Here, we describe a novel transoral laryngoscopy approach that permits close-up, unobstructed video imaging of laryngeal motion in mice and rats. Critical steps in the protocol include precise anesthesia management (to prevent overdosing that abolishes swallowing and/or risks respiratory distress-related mortality) and micromanipulator control of the endoscope (for stable video recording of laryngeal motion by a single researcher for subsequent quantification).
Importantly, the protocol can be performed over time in the same animals to study the impact of various pathological conditions specifically on laryngeal function. A novel advantage of this protocol is the ability to visualize airway protection during swallowing, which is not possible in humans due to epiglottic inversion over the laryngeal inlet that obstructs the glottis from view. Rodents therefore provide a unique opportunity to specifically investigate the mechanisms of normal versus pathological laryngeal airway protection for the ultimate purpose of discovering treatments to effectively restore normal laryngeal function.

This protocol describes a serial transoral laryngoscopy approach for mice and rats that permits close-up, unobstructed video imaging of the larynx during breathing and swallowing using an optimized anesthetic regimen and finely tuned endoscopic manipulation techniques.

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to ...

إعداد أضعاف الصوتية الجرذ للتحليلات العصبية والعضلية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الفسيولوجية والمورفولوجية وتوصيف الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية عن طريق التضمين الحركة

استهدف التدريب من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في الجرذان المسنين وباركنسونية

تحت الجلد نيوروتروفين 4 التسريب باستخدام مضخات التناضحي أو الحقن العضلي المباشر يعزز الشيخوخة الجرذ العضلات الحنجرة

زرع الخلايا الشمية مغمد لتقييم الانتعاش وظيفية بعد إصابة العصب المحيطي

A نموذج من الفئران اصابات الحبل الشوكي عنق الرحم لدراسة مرحلة ما بعد التقرحي الجهاز التنفسي المرونة العصبية

عملية التصنيع لنماذج الطيات الصوتية فائقة النعومة غير اللاصقة

عملية التصنيع لنماذج الطيات الصوتية فائقة النعومة غير اللاصقة

عملية التصنيع لنماذج الطيات الصوتية فائقة النعومة غير اللاصقة

في فيفو تقييم الخصائص الميكانيكية و اللزجة من اللسان الجرذ

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close-Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing