وأيد هذا البروتوكول المنح البحثية "الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين" (#31171066, #81270464) ومركز العلوم الصينية-الألمانية (GZ919).

قد أقرها البروتوكول التجريبي ذكرت هنا "الحيوان الأخلاقية اللجنة من شانغهاي جياوتونغ كلية الطب بجامعة" (# SYXK2013-0050). التشريح كولوريكتوم مع العقدة سليمة والعصبية جذع يأخذ الحد أدنى من 15 دقيقة لشخص تماما من ذوي خبرة في هذا الأسلوب. ولذلك من الضروري للحفاظ الحيوانات ولكن على قيد الحياة تحت التخدير العميق حين إجراء تشريح، ضمان بقاء الأنسجة لتسجيل الكهربية اللاحقة-
 1-إعداد الحل نضح واختبار المركبات <ol><li>ل 5 إعداد حل كريبس: 113 ملم كلوريد الصوديوم، 5.9 ملم بوكل، 1.2 مم نة 2 بو 4 و 1.2 مم MgSO 4، 25 مم ناكو 3، 1.2 مم كاكل 2 ، والجلوكوز 11.5 ملم. تشبع الحل مع 95% س 2 + 5% CO 2 الغاز المخلوط. قبل بارد ~ 500 مل من اﻷوكسيجين كريبس في الثلاجة.</li>
	<li>تحضير مختبرين للأسهم اختبار المركبات (كبخاخات 1 مم في الإيثانول وملم 10 5-هيدروكسيتريبتاميني (5-HT) في المحلول الملحي) حسب الحاجة. تمييع المخزون في كريبس (لتطبيق حمام) وفي المياه المالحة (للإدارة إينترالومينال) بتركيز نهائي مسبق فقط لاستخدام-</li>
</ol> 2. إعداد تسجيل القطب <ol><li>سحب أنابيب مسرى التسجيل من الزجاج القياسية دون خيوط داخلية (1.5 مم القطر الخارجي) استخدام ساحبة كهربائي تقليدية. ضبط إعدادات ساحبة للحرارة وسحب حيث يكون عرقوب أقطاب سحبت بين 20 و 25 مم-</li>
</ol> 3. جمع الأنسجة <ol><li>تخدير الفئران عميقا باستخدام الصوديوم بينتوباربيتال (80 ملغ/كغ، والقائمة). </li> <li>مع ضمان العقم، كشف التجويف البطني عن طريق إجراء شق خط الوسط في جدار البطن باستخدام مشرط. سحب مساريق والأنسجة الأخرى جانبا للكشف كولوريكتوم-</li>
	<li>وضع الحيوان تحت مجهر تشريح. من خلال تشريح دقيق، حدد موقع PG الأيسر وتحديد PN و LSN الانضمام إليها. قطع هذه الأعصاب بضعة ملليمترات بعيداً عن الصفحة 
	ملاحظة: يكمن PG القرب من مفرق القولون والمستقيم. بشكل عام، 3-4 PN من الحبل الشوكي لومبوساكرال ومشروع LSN للتعبئة ( الشكل 1).</li>
	<li>قص عظم الارتفاق لفضح المستقيم. إزالة الأنسجة (أي، المثانة البولية، إلخ.) أعلاه كولوريكتوم؛ احرص على حالها في س.</li>
	<li>التضحية الفئران عن طريق الحقن الوريدي من جرعة زائدة من بينتوباربيتال. قطاع القولون حوالي 3 سم فوق الغرام وإزالة كولوريكتوم من الحيوان باستخدام الملقط.</li>
	نقل <li>كولوريكتوم إلى طبق بتري مليئة يبرد قبل كريبس الحل. قم بإزالة البراز بالتنظيف بلطف القولون. إزالة بقايا المثانة البولية والأنسجة الأخرى بعناية، دون المساس الصفحة</li>
</ol> 4. تشريح الأعصاب الزبائ Colonic <ol><li>مكان القولون في دائرة تسجيل (20 مل) ونتخلل الأنسجة بشكل مستمر مع كاربوجيناتيد الحل كريبس. تعيين معدل التروية في 15 مل/دقيقة</li>
	<li>كانولاتي كولوريكتوم في كلا من طرفي الفم والشرج. بدء ضخ إينترالومينال من القولون مع المحلول الملحي بمعدل 10 مل/ساعة في الفم باتجاه الشرج.</li>
	<li>موقع PG الرئيسية تحت مجهر تشريح. استخدام دبابيس الحشرات لفضح العقدة. مع تشريح دقيق، العثور على فرع جيد للأعصاب المنبثقة من العقدة ويركض نحو القولون ( الشكل 1). قطع العصب قريبة من العقدة. 
	ملاحظة: يوضح الشكل 1 تسجيل من فرع عصب القاصي لصفحة يفترض أن يحتوي العصب على خليط ألياف الزبائ splanchnic الحوض وأسفل الظهر. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء تسجيل من PN و/أو LSN الدانية للصفحة</li>
	<li>قم بتشغيل تدفئة الحمام والحارة الحل كريبس للحفاظ على درجة حرارة الغرفة في 34 ± 0.5 درجة مئوية.</li>
</ol> 5. إعداد "مسرى شفط" <ol><li>تأخذ ماصة زجاجية سحبت مسبقاً (الخطوة 2) وأن تفقد تحت مجهر تشريح. كسر غيض مسرى مع زوج من الملقط حيث أنها متوافقة مع قطر العصب أن يسجل حجم.</li>
	<li>مجسم مشطوف الحواف التلميح بوضعه قريبا من توهج أخف.</li>
</ol> 6. تسجيل الكهربية <ol><li>الاتصال الكهربائي مشطوف الحواف لصاحب القطب. الاتصال حقنه 10 مل بالجانب المنفذ على حامل لتطبيق الضغط السلبي أو الإيجابي على مسرى.</li>
	<li>الاتصال الحامل هيدستاجي بيوامبليفير وجبل هيدستاجي على مناور.</li>
	<li>الانتقال الكهربائي لحمام الأنسجة وملء مسرى مع الحل كريبس بتطبيق الشفط لطيف حتى أنها تجري اتصالات الأسلاك الفضية حامل. ضع طرف قطب كهربائي قريب من نهاية قطع العصب وتطبيق ضغط سالب لامتصاص العصب إلى مسرى. تطبيق الضغط السلبي أكثر بحيث يتم سحبها إلى مسرى ~ 1 مم للعصب وأشكال ختم ضيق.</li>
	<li>بدوره على بيوامبليفير وتعيين عامل التصفية إلى 300 3,000 هرتز. رصد الإشارة على الذبذبات وتسجيل إشارة العصب (معدل أخذ العينات 20 كيلوهرتز) وإشارة الضغط intraluminal (معدل أخذ العينات 100 هرتز) باستخدام جهاز كمبيوتر مع تجهيز بيانات سبايك برامج.</li>
</ol> 7. اختبار حساسية الزبائ Colonic <ol><li>تطبيق منحدر انتفاخ القولون عن طريق إغلاق الصنبور الثلاثية في قنية منفذاً بينما غرس إينترالومينالي باستمرار. مراقبة الضغط إينترالومينال حتى يصل إلى 60 مم زئبق، في الوقت الذي فتح الصنبور الثلاثية في قنية استنزاف.</li>
	<li>كرر هذا الإجراء على فترات منتظمة من المخدرات تطبيق 15 دقيقة إضافية-أو إينترالومينالي لاختبار حساسية الأعصاب الزبائ الكيميائية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+basis+of+visceral+pain:+recent+developments.">Biological basis of visceral pain: recent developments.</a> Pain. 96 (3), 221-225 (2002).</li><li>Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+spinal+distribution+and+neurochemical+phenotype+of+colonic+afferents+in+mouse+and+rat.">Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat.</a> J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).</li><li>Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+mechanisms+contribute+to+mechanosensory+transduction+in+the+rat+colorectum.">Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum.</a> Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+the+Primary+Afferent+Nerves+in+a+Rat+Model+of+Diabetic+Visceral+Hyposensitivity.">Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity.</a> Mol Pain. 11, (2016).</li><li>Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+recordings+of+afferent+fibres+with+receptive+fields+in+the+serosa,+muscle+and+mucosa+of+rat+colon.">In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon.</a> J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).</li><li>Page, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+contributions+of+ASIC+channels+1a,+2,+and+3+in+gastrointestinal+mechanosensory+function.">Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function.</a> Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).</li><li>Hockley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2Y+Receptors+Sensitize+Mouse+and+Human+Colonic+Nociceptors.">P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors.</a> J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).</li><li>Peiris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+visceral+afferent+recordings:+preliminary+report.">Human visceral afferent recordings: preliminary report.</a> Gut. 60 (2), 204-208 (2011).</li><li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum.">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents.">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).</li><li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Functional+Characterization+of+Mouse+Colorectal+Afferent+Endings.">In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings.</a> J Vis Exp. (95), e52310 (2015).</li><li>Nullens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Recording+of+Mesenteric+Afferent+Nerve+Activity+in+Mouse+Jejunal+and+Colonic+Segments.">In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li><li>Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jejunalafferent+nerve+sensitivity+in+wild-type+and+TRPV1+knockout+mice.">Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice.</a> J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).</li><li>Brierley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+chemosensory+function+and+receptor+expression+of+splanchnic+and+pelvic+colonic+afferents+in+mice).">Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice).</a> J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).</li><li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3. r. d., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice.">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li><li>La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+expression+of+transient+receptor+potential+channel+V1,+transient+receptor+potential+channel+A1+and+mechanosensitive+two+pore-domain+K++channels+between+the+lumbar+splanchnic+and+pelvic+nerve+innervations+of+mouse+urinary+bladder+and+colon.">Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon.</a> Neuroscience. 186, 179-187 (2001).</li><li>Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+processing+of+noxious+colonic+input+by+thoracolumbar+and+lumbosacral+dorsal+horn+neurons+in+the+rat.">Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat.</a> J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).</li></ol>

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

البروتوكول المعروضة هنا أسلوب تجريبي بسيط نسبيا لتقييم الخصائص الكهربية من أفيرينتس colonic من الفئران. البروتوكول (من تشريح الأنسجة بإعداد تسجيل العصب) عادة ما يستغرق حوالي 2 ساعة لإكمال. جمع الأنسجة (الخطوة 3) وإعداد مسرى الشفط (الخطوة 5) هي الخطوات الحاسمة. من الأهمية بمكان أن تكون قادراً على...

الجهاز الهضمي (GIT) هو معصب غنية بالاعصاب الزبائ الخارجية التي تنقل الإشارات الحسية من الأمعاء إلى الجهاز العصبي المركزي والتي تساهم في تفاعل القناة الهضمية في الدماغ. استثارة غيرت من هذه أفيرينتس الخارجية، وكذلك المعالجة المركزية غيرت المدخلات الزبائ، يكمن وراء الألم الحشوي وأعراض أخرى لظروف غي، بما في ذلك الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء1. وينقل المعلومات الحسية من كولوريكتوم الدرجة الأولى من خلال ما/هيبوجاستريك و لومبوساكرال/الحوض الأعصاب (PN)2. كان هناك زيادة اهتمام بدراسة الخصائص الكهربية لهذه الألياف الزبائ الأولية في نماذج القوارض من المرض. ومع ذلك، في فيفو التسجيلات الكهربية من أفيرينتس colonic في القوارض تحديا تقنيا ويتطلب قدرا كبيرا من المهارات الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، قد التغييرات الفسيولوجية وحركة الأنسجة والمسكنات أيضا تؤثر على نشاط العصب وحساسية لاختبار المنشطات في فيفو. ولذلك، في السنوات الأخيرة، استخدمت عددا متزايداً من الدراسات في المختبر (السابقين فيفو) الاستعدادات من مختلف الأنواع، بما في ذلك الفئران، الجرذان وخنازير غينيا والبشر، لدراسة آليات توصيل الحسي في colonic أفيرينتس واستثارة غيرت في ظروف المرض. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
وأفيد أساسا نوعين من إعداد colonic السابقين فيفو :9،،من5إعداد "ورقة مسطحة"10 و3،4إعداد "الأنبوب". وكان بروتوكول فيديو لإعداد "ورقة مسطحة" كولوريكتوم موريني المنشورة سابقا11. في هذا البروتوكول، كولوريكتوم الماوس، مع PN) أو سبلانتشنيك الأعصاب القطنية (LSN) المرفقة، المقطوع وسوبيرفوسيد في غرفة لانسجة. كولوريكتوم هو قطع مفتوحة طوليا، ويتم توسيع الحزمة العصبية في حجرة تسجيل مملوءة بزيت البارافين. يتم تسجيل نشاط العصب استخدام قطب البلاتين الايريديوم أحادي القطب. يسمح البروتوكول للتعرف على مجالات تقبلا من ألياف الزبائ الفردية باستخدام التحفيز الكهربائي غير متحيزة. أنه يموضع تطبيق المحفزات الكيميائية، وكذلك تطبيق نماذج مختلفة من التحفيز الميكانيكية (مثل تنسيق المخاطية السبر وتمتد كفافى)، إلى النهايات العصبية الزبائ. لأنه يجب أن تمدد العصب إلى غرفة منفصلة من قاعة النسيج، من الأهمية بمكان للحفاظ على العصب المرفقة طويلة نسبيا؛ تشريح ناجحة للأعصاب يشكل تحديا لأولئك جديدة لهذه المنهجية. في الآونة الأخيرة، نشرت نلينس et al. بروتوكول فيديو للتسجيل في المختبر أفيرينتس المساريقي العلوي في jejunal مورين وشرائح colonic12. في هذا الإعداد "أنبوب"، يتم الاحتفاظ الجزء الغريزي مع مساريق المرفقة سليمة، وبالتالي السماح لانتفاخ متدرج ولومينال داخل وخارج إدارة المواد الكيميائية المختلفة. منذ العصب مساريق يتم تسجيلها باستخدام قطب كهربائي شفط، الذي يمكن وضعه قريبا من الأنسجة، يمكن تسجيل النشاط الزبائ حتى ولو العصب مساريق قصيرة نسبيا. إلا أن العصب مساريق يتكون من المختلطة السكان من ألياف الزبائ تحفيزه والعمود الفقري الذي يعصب الصائم أو ما هيبوجاستريك. أفيرينتس الحوض Lumbosacral يعصب كولوريكتوم، الذي لا يميز في هذا البروتوكول. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتسجيل الكهربية أفيرينتس colonic الفئران باستخدام إعداد كولوريكتوم "أنبوب" مع صفحة سليمة قد يسمح هذا الأسلوب لتوصيف الخصائص الوظيفية قطني سبلانتشنيك (هيبوجاستريك) والحوض أفيرينتس لومبوساكرال.

<table width="889">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:215px;height:40px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:123px;">Shanghai Westang Bio-Tech</td>
			<td style="width:344px;">B558</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capsaicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrode puller</td>
			<td>MicroData Instrument Inc</td>
			<td>PMP107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurolog System (Bioamplifier)</td>
			<td>Digitimer, Ltd</td>
			<td>Neurolog System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">A/D converter</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Micro1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Data processing software</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Spike2 version 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrode holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3SBW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heating bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GR150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Zoom2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cigarette lighter</td>
			<td>any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Insect pins</td>
			<td>home-made from 0.1 mm stainless steel wire</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Three way manipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KITF-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rats</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any strain/sex can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferent fibers in rats

الخلل الوظيفي للأعصاب الحسية colonic متورط في الفسيولوجيا المرضية للعديد من الشروط المشتركة، بما في ذلك الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء ومرض السكري. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتوصيف الخصائص الكهربية من أفيرينتس colonic في الفئران في المختبر . كولوريكتوم، مع العقدة الحوض سليمة (PG) المرفقة، يتم إزالة من الفئران؛ سوبيرفوسيد مع كاربوجيناتيد الحل كريبس في قاعة التسجيل؛ ومقني في نهايات عن طريق الفم والشرج للسماح بانتفاخ. يتم تعريف حزمة الأعصاب دقيقة النابعة من فريق البرمجة، ويتم تسجيل نشاط العصب الزبائ مولتيونيت قطب شفط باستخدام. يتسبب انتفاخ الجزء colonic زيادات تدريجية في تصريف مولتيونيت. ويجري تحليل عنصر الرئيسي التفريق عتبة المنخفضة والعالية-العتبة الألياف الزبائ دينامية واسعة المدى. يمكن دراسة حساسية أفيرينتس colonic الكيميائية من خلال إدارة المركبات اختبار حمام أو إينترالومينال. يمكن تعديل هذا البروتوكول للتطبيق على الأنواع الأخرى، مثل الفئران وخنازير غينيا، ودراسة الاختلافات في الخصائص الكهربية من أفيرينتس ما/هيبوجاستريك ولومبوساكرال/الحوض القولون تنازلي في العادي و الحالات المرضية.

ويمثل الشكل 1 التخطيطي الرسم التوضيحي للإعداد التجريبية لإعداد كولوريكتوم السابقين فيفو "أنبوب"، مع ممثل للصفحة تسجيل من العصبية القاصي يفترض أن يتضمن العصب خليط أفيرينتس سبلانتشنيك الحوض وأسفل الظهر. الأعصاب الزبائ colonic في الأعمال التحضيرية من الف...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats at JoVE.com

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

وظيفة حسية غير طبيعية وراء الألم الحشوي وغيرها من أعراض الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء. ويرد هنا بروتوكولا لتسجيل الكهربية للأعصاب الزبائ colonic في استعداد كولوريكتوم الفئران السابقين فيفو .

في المختبر توصيف الخصائص الكهربية لألياف الزبائ Colonic في الفئران

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

in-vitro-characterization-electrophysiological-properties-colonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

6.8K Views.  Shanghai Jiaotong University School of Medicine. وظيفة حسية غير طبيعية وراء الألم الحشوي وغيرها من أعراض الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء. ويرد هنا بروتوكولا لتسجيل الكهربية للأعصاب الزبائ colonic في استعداد كولوريكتوم الفئران السابقين فيفو .

Video: In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

طريقة عامة لتقييم الحضانة لالتوق السكروز في الجرذان

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

انتقائية للبحث عن المفقودين من ألياف العصب السمعي في الطيور الدهليزي القوقعي الجنينية

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

تسجيل الكهربية في الدماغ سليمة من اسماك الزرد الكبار

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; ماوس الكبار إعداد العضلات العصبية لدراسة خصائص اطلاق Afferents العضلات

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the different organ systems from the periphery towards the central nervous system. As such, the increased activity or &#39;sensitization&#39; of mesenteric afferent nerves has been allocated an important role in the pathophysiology of visceral hypersensitivity and abdominal pain syndromes.
Mesenteric afferent nerve activity can be measured in vitro in an isolated intestinal segment that is mounted in a purpose-built organ bath and from which the splanchnic nerve is isolated, allowing researchers to directly assess nerve activity adjacent to the gastrointestinal segment. Activity can be recorded at baseline in standardized conditions, during distension of the segment or following the addition of pharmacological compounds delivered intraluminally or serosally. This technique allows the researcher to easily study the effect of drugs targeting the peripheral nervous system in control specimens; besides, it provides crucial information on how neuronal activity is altered during disease. It should be noted however that measuring afferent neuronal firing activity only constitutes one relay station in the complex neuronal signaling cascade, and researchers should bear in mind not to overlook neuronal activity at other levels (e.g., dorsal root ganglia, spinal cord or central nervous system) in order to fully elucidate the complex neuronal physiology in health and disease.
Commonly used applications include the study of neuronal activity in response to the administration of lipopolysaccharide, and the study of afferent nerve activity in animal models of irritable bowel syndrome. In a more translational approach, the isolated mouse intestinal segment can be exposed to colonic supernatants from IBS patients. Furthermore, a modification of this technique has been recently shown to be applicable in human colonic specimens.

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.

في المختبر تسجيل من مساريقي وارد آخر الأعصاب في ماوس صائمية وقطاعات القولون

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

حاد<em&gt; في فيفو</em&gt; تسجيلات الكهربية للميكانيات الميدانية المحلية والنشاط متعدد الوحدات من مسار هيبيرديركت في الفئران تخدير

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

لاسلكيه الكهربائية تسجيل الخلايا العصبية من قبل Tetrodes المنقولة في بحريه السباحة الأسماك

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...