ونود أن أشكر كيميل تشاك للتوجيه ووكر Macie لعملها في إتقان وصمة عار الهيكل العظمى، ووكر تشارلين ودوود جون للحصول على مساعدة في وضع هذه الاستراتيجية تربية أولمان بوني لمشورة مفيدة الزرد. وأيد هذا العمل DE024190 K99/R00 إلى جتن.

وأنجزت جميع التجارب المبينة في هذا البروتوكول وفقا والامتثال من جامعة كولورادو وجامعة "ولاية أوريغون رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجان (إياكوك)-
 1-إعداد "الأوراق المالية غير محددة ابتداء من" <ol><li>تحديد الناقلين متخالف من اليل طافرة من اهتمام زعنفة مقطع 11 والتنميط بمخزون حيوانات كامل-الأخوة بأسلوب الاختيار، مثل الصناعية 12 ، ، من 13 14. وأجرى هذا البروتوكول مع سلالة mef2ca b1086 الزرد.</li>
	<li>التنميط الصناعية 
	ملاحظة: تم تصميم الإشعال اليل محددة للصناعية بالشركة التي توفر والكواشف (انظر الجدول للمواد). للحصول على تركيز صبغ (روكس) 6-الكربوكسيل-س-والرودامين المناسبة لجهاز PCR الوقت الحقيقي معين بزيارة موقع الشركة.
	<ol><li>مكان الأنسجة ذيل الزرد في 50 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (10 ملم تريس (pH 8.3)، 50 مم بوكل، مجكل 1.5 مم 2، 0.3% الفاعل غير الأيونية، 0.3% أوكتيلفينيل-البولي إيثيلين جليكول). إضافة 10 ميليلتر من 10 ملغ/مل ك بروتيناز الواحدة وكذلك لوحة بكر 96-جيدا وهضم في cycler حرارية في 55 درجة مئوية ح 2-5 تليها خطوة المنظمة 94 درجة مئوية 20 دقيقة. بردت المنتج تحلل بعد الهضم. ملاحظة: يمكن استخدام منتجات تحلل بنجاح لعدة أشهر بعد الإعداد. عندما تم تفكيك النسيج باستخدام 50 مم هيدروكسيد الصوديوم، وردود الفعل الصناعية لم تنجح. وتوحي هذه النتائج أن طريقة هيدروكسيد الصوديوم المجينية الحمض النووي إعداد غير متوافق مع الصناعية-</li>
		قياس <li>في الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تمييع قالب الحمض النووي الجينوم باستخدام البيولوجيا الجزيئية الصف المياه حيث أن كل رد يحتوي على ما يقرب من 20-30 نانوغرام. 
		ملاحظة: تحديد حجم العينات 4 أو 5، وتجمع لهم، ثم إعداد تخفيف لجميع العينات على أساس المتوسط. عند استخدام هذا البروتوكول للأنسجة ذيل الكبار، كثيرا ما يكفي إضعاف 1: 100. التحديد الكمي الدقيق لتركيز الحمض النووي ليس مطلوباً-</li>
		<li>الإضافية 0.14 ميكروليتر من التمهيدي الصناعية مزيج و 5 ميليلتر من الأصول الرأسمالية الصناعية مزيج كل عينة على الجليد إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة ومزيج جيد من قبل سينتريفوجينج بإيجاز لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب. 
		ملاحظة: الصناعية الرئيسية مزيج الحرارة والضوء حساسة، والاحتفاظ بالأوراق المالية على الجليد وتجنب الضوء المباشر-</li>
		<li>بيبيت 5 ميليلتر من التمهيدي/ماجستير مزيج الحل في آبار صفيحة بكر البصري 96-كذلك مناسبة للجهاز PCR الوقت الحقيقي تستخدم.</li>
		<li>بيبيت 5 ميليلتر من المخفف (حوالي 5-7 نانوغرام/ميليلتر) عينات الحمض النووي القالب إلى كل جيدا ونضح مع ماصة لخلط-</li>
		<li>إضافة 5 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لآبار 3 لتكون بمثابة قالب لا يتحكم (المجلس الوطني الانتقالي) وإضافة 5 ميليلتر المخففة المؤكدة متماثل البرية نوع، قالب الحمض النووي متحولة متخالف ومتماثل لعناصر إيجابية-</li>
		<li>ضع ختم فيلم واضح بصريا على لوحة ضمان أن الفيلم الكامل مختومة في كل بئر-</li>
		<li>الطرد المركزي باختصار اللوحة في 600 x ز لجمع المحتويات في الجزء السفلي وإزالة فقاعات من المزيج. 
		ملاحظة: الاحتفاظ صفيحة الجليد ودرع من الضوء حتى على استعداد للمضي قدما-</li>
		<li>استخدام برنامج ركوب الدراجات في الجدول 1 للقيام برد فعل الصناعية الرئيسية-</li>
		عرض <li>مؤامرة مبعثر الناتجة التي تنتجها الكمبيوتر تحليل. سوف تظهر رد فعل ناجح 4 مجموعات متميزة من النقاط على الأرض ( الشكل 3): ثلاثة عينة التجمعات المقابلة للنمط الوراثي، وتجميع NTCs القرب من الأصل واحد. يجب فصل عناصر إيجابية مع تجميع عينة ملائمة.</li>
		<li>إذا لم يتعرف البرنامج الحاسوبي على الأرض قد يكون المجموعات كالمقابلة للأنماط الجينية المحددة، ركوب الدراجات مجموعات إضافية المطلوبة (الجدول 2). كرر البرنامج الإضافي حتى يتعرف الكمبيوتر التجمعات ضيق بالنمط الوراثي.</li>
		<li>تصدير نتائج التنميط إلى ملف جدول بيانات لسهولة الاستخدام والتحليل-</li>
	</ol></li> <li>بيت الحيوانات متخالف المحددة معا في نظام المياه الرئيسي.</li></ol>
 2-"أول جولة من ذرية التهديف" <ol><li>بيرويس الصليب heterozygotes الأخوة <ol><li>بعد استرداد الحيوانات من قصاصة زعنفة، إعداد إينتيركروسيس العشوائية. استخدم الفواصل للتأكد من الأجنة متزامن 16-</li>
		<li>جمع الأجنة والحفاظ على أزواج الوالدين معزولة في تربية أقفاص.</li>
		<li>رصد الكبار معزولة بحيث يمكن فصل الأسماك العدوانية أو توفير الغطاء (الأسماك تمزيقه شبكات عمل جيد). يجب أن تكون تغذية الأسماك وتغير المياه الخاصة بهم في أعقاب IACUC المبادئ التوجيهية أثناء وجوده في المياه الساكنة.</li>
	</ol></li> <li>تربية الجنين <ol><li>المرحلة ورفع الأجنة الزرد لليرقات تحت الظروف القياسية 17-</li>
		<li>جمع الحيوانات البرية من نوع فينوتيبيكالي باستخدام ماصة زجاجية يوم 5 أو 6 عندما يتم تضخم المثانة السباحة في 75 في المائة مخلب. ضع المظهرية الأنواع البرية في الحضانة تسجيل الآباء التي حققت لهم. 
		ملاحظة: مع المسخ الآليلات المتنحية المميتة، وينطبق على العديد من طفرات الهيكل العظمى، التي تفشل طفرات متماثل بشكل أكياس السباحة 18 ، 19. ولذلك، يمكن بسهولة تمييز المظهرية البرية أنواع من أشقائهم متحولة استناداً إلى تضخم السباحة قرب.</li>
	</ol></li> <li>السيان الأزرق/الأليزارين "الأحمر" الغضاريف والعظام تلطيخ <ol><li>تخدير اليرقات عدم تضخيم بهم قربه السباحة 0.17 غرام/لتر تريكيني باستخدام-S في وسائل الإعلام الجنين. جمع الحيوانات إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب مع زجاج على نطاق تحمل بيبيت باستور. إضافة اليرقات لا يزيد عن 100 كل أنبوبة.</li>
		إزالة الماء الجنين من كل أنبوبة <li>وإصلاح الحيوانات في 1 مل بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني 1 x كل أنبوب. 
		تنبيه: منهاج العمل المائية القابلة للاحتراق وسوف يسبب تهيج العين والجلد خطيرة. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة مثل القفازات وحماية العين، وغسل اليدين جيدا بعد استخدام.</li>
		<li>روك ح 1؛ ويضعف التثبيت أطول تلطيخ العظام. فحص الأنابيب بانتظام خلال هذا وقد تصبح عالقة إلى الجانب جميع الخطوات هزاز اللاحقة لضمان لا اليرقات أو تجمعت في الجزء السفلي من الأنبوب.</li>
		<li>إزالة مثبت من أنابيب استخدام ماصة زجاجية، أضف 1 مل من الإيثانول 50%، والصخور للحد الأدنى 10</li>
		<li>تحضير الطازجة تلطيخ الحل بإضافة 20 ميليلتر من 0.5% بريمكس "الأليزارين الأحمر" كل 1 مل السيان (0.04% السيان الأزرق/10 مم مجكل 2/الإيثانول 80%). إزالة 50% إيثانول، أضف 1 مل من تلطيخ الحل لكل أنبوب، والصخور بين عشية وضحاها. يمكن أن تبقى اليرقات في وصمة عار لمدة 5 أيام-</li>
		إزالة الحل وصمة عار من الأنابيب <li>وإضافة 1 مل من 80 ٪ الإيثانول/10 مم مجكل 2 الحل لكل أنبوبة. روك أنابيب لح 1 على الأقل؛ الشطف بين عشية وضحاها يمكن أن تنتج وصمة الأزرق السيان أكثر وضوحاً.</li>
		<li>إزالة 80 ٪ الإيثانول/10 مم مجكل 2 الحل من الأنابيب وإضافة 1 مل إيثانول 50%؛ والصخور للحد الأدنى 5</li>
		<li>إزالة الحل الإيثانول 50% من الأنابيب وإضافة 1 مل من الإيثانول 25% والصخور للحد الأدنى 5</li>
		<li>إزالة الحل الإيثانول 50% من الأنابيب وإضافة 1 مل طازج 3 ٪ ح 2 س 2 /0.5% كوه تبيض الحل. اترك فتح الأغطية واسمحوا الأنابيب الوقوف على حامل أنبوب الجزئي لحوالي 10 دقيقة أو حتى يمكن أن ينظر إليه تلون بني باهتة في الجزء العلوي من الحل- 
		ملاحظة: طبقة من شكل فقاعات على رأس الحل. تبيض سيؤدي إلى توقيت غير مطلوب في هذه الخطوة، كما أكثر حذراً في وصمة ضعف فقراء.</li>
		<li>إزالة الحل تبيض وإضافة 1 مل من 25% glycerol/0.1% كوه؛ روك لمدة 10 دقائق إلى حاء – 1</li>
		<li>إزالة الحل كوه glycerol/0.1% 25% من الأنابيب، وإضافة 1 مل محلول 50% glycerol/0.1% كوه لكل أنبوبة، روك لمدة 10 دقائق بين عشية وضحاها.</li>
		إزالة الحل كوه glycerol/0.1% 50% من الأنابيب <li>وإضافة 50% glycerol/0.1% كوه الحل مرة أخرى لكل أنبوبة. التأرجح بين عشية وضحاها سوف تساعد على إزالة فقاعات الهواء التي يمكن أن تتراكم داخل اليرقات. مخزن الملون الاستعدادات الهيكل العظمى عند 4 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستخدام.</li>
	</ol></li> <li>التهديف النمط الظاهري <ol><li>نقاط الملون ذرية متحولة بينيترانسي من النمط الظاهري المحدد. في نيكولز وآخرون كانت حققت طفرات 1 عن أي تواجد للعظام خارج الرحم. 
		ملاحظة: نظراً لأن الوالدين الزرد في المياه الساكنة ووصمة عار "الأليزارين الأحمر" يمكن أن تتلاشى مع مرور الوقت، من المهم أن نقاط هياكل عظمية في غضون أيام قليلة من الانتهاء من إعداد الهيكل العظمى-</li>
		<li>بينيترانسي هو نسبة الوراثي الذي يحتوي النمط الظاهري. حساب بينيترانسي المئة بالصيغة التالية: بينيترانسي % = (طفرات مع النمط الظاهري)/(إجمالي عدد من طفرات) × 100</li></ol></li></ol> 3. اختيار الأسرة بينيترانسي <ol><li>اختر اثنين عالية وأسرتين penetrance منخفضة للجيل القادم. بالإضافة إلى بينيترانسي، من المهم النظر في خصوبة وحيوية عند اختيار الأسر التي للنشر؛ انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل حول هذا.</li>
	<li>يعطي كل زوج الأبوية معرفاً أسهم فرعية: الأسرة،.01.02، إلخ</li>
	<li>البيت أزواج الوالدين على النظام الأساسي مع الجنس المختلط عدة &#39; رفيق &#39; الأسماك. رفيق الأسماك يمكن أن يكون أي خط الزرد مع السمات المميزة الدائمة، واضحة، مثل تغيير الهيكل تصبغ أو fin. 
	ملاحظة: في حين تبقى العديد من الباحثين بنجاح فقط تربية أزواج في خزان، تعتبر نتائج إيجابية بالإسكان أزواج مع عدة رفيق الأسماك. هذه الخطوة اختيارية يسمح تربية أزواج من الحيوانات يجب أن يوضع في المدارس الكبرى واسترجاعها بسهولة حيث أنها يمكن أن تكون مرارا وتكرارا عبرت حسب الحاجة. يمكن عبروا أزواج الوالدين مرارا وتكرارا لتوليد الأسر الكبيرة كاملة-المشابهة؛ الانتظار قبل تكرار عبور زوج الأبوية نفس أسبوع واحد على الأقل.</li>
	<li>إعدام عائلات اليرقات من الخطوة 2.2.2. التي اختيرت لا للجيل القادم-</li>
	<li>تسمية الدبابات المحتوية على اليرقات الأخوة البرية من نوع من الأسر المختارة مع بينيترانسي من أشقائهم متحولة ورفع إلى مرحلة البلوغ بشكل طبيعي-</li>
	<li>الجيل القادم سوف يكون الأسر كامل-الأخوة مالا يقل عن أربعة، اثنان للخط التصاعدي واثنان للخط النزولي.</li>
	<li>عندما تصل اليرقات إلى مرحلة النضج الجنسي، كرر البروتوكول بدءاً من خطوة واحدة مع الجيل الجديد-</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca.">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism,+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+(HDR).">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li><li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest.">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).</li><li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton.">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li><li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy.">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190 (2014).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progeny+test+and+individual+performance+as+indicators+of+an+animal's+breeding+value.">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li><li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).</li><li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating.">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li><li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis.">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).</li><li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping:+the+KASP+assay.">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li><li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+Kompetitive+Allele+Specific+PCR+(KASP):+overview+of+the+technology+and+its+application+in+crop+improvement.">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li><li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+high+throughput+and+cost+effective+SNP+genotyping+platforms+in+soybean.">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I:+branchial+arches.">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li><li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+ways+to+lose+your+bladder:+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes.">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li><li>Mrakov&#269;i&#269;, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbreeding+depression+in+the+Zebra+fish+Brachydanio+rerio+(Hamilton+Buchanan).">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li><li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+inbreeding+depression.">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li><li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish.">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish.">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).</li><li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FishFace:+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution.">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).</li><li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton.">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li><li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development.">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

الوراثي، يكشف عن الخفايا وظيفة الجينات
التحول تعمل متحولة أن تكون أكثر أو أقل حدة بالانتقاء الوراثي طريقة مباشرة لاكتساب رؤى جديدة في وظيفة الجينات. بالمقارنة مع الأساليب القياسية لتربية غير محددة، يمكن أن تسفر عن البروتوكول المعروضة هنا فهم كثير أكثر اكتمالا لت?...

الزرد نظام نموذج قوي لفهم التنمية الهيكل العظمى. مع سلالات متحولة الزرد، يمكن فك علماء البيولوجيا وظيفة الجينات أثناء سكيليتوجينيسيس. ومع ذلك، يمكن أن يقدم الزرد تعمل متحولة الهيكل العظمى مع متغير بينيترانسي1،2،3،4 التي يمكن أن تعيق تحليلات الخلقية والوراثية. والغرض من هذا الأسلوب ثلاثة إضعاف. أولاً، توليد خطوط متحولة الزرد التي تنتج دائماً تعمل شديدة تمكن الدراسات الإنمائية المتلقين للمعلومات مثل تسجيل الوقت الفاصل بين5 وزرع6. يمكن أن تكون شلت هذه الأنواع من الدراسات بمحاولة دراسة تعمل فقط المجاهرة بشكل غير متسق. ثانيا، يمكن إنقاص التهجين سلالات الزرد اختلاف الخلفية الوراثية، وبالتالي تعزيز الاتساق التجريبية وإمكانية تكرار نتائج. على سبيل المثال، أداء جميع في الموقع التهجين تحليلات على السلالة الفطرية بشكل انتقائي واحد يمكن الحد من تقلب التباس وتعزيز النتائج. ثالثا، سوف تكشف توليد سلالات شديدة وخفيفة المظهرية السلسلة بأكملها التي يمكن أن تنتج عن طفرة خاصة.
للوهلة الأولى، يبدو من المستحيل الوراثي من طفرات مميتة. كيف يمكن لسلالة واحدة ل penetrance عند الحيوانات التي هي سجل للتحديد ميتة؟ لحسن الحظ، أساليب لتربية انتقائية حسب الأسرة التحديد، التحديد ذرية الاختبار، قد أثبتت فعالية في تنمية الثروة الحيوانية البرامج للعديد من السنوات7،8. وتستخدم هذه البرامج أساسا للانتقاء الوراثي للصفات التي موجودة فقط في جنس واحد، مثل إنتاج الحليب في الأبقار أو إنتاج البيض في الدجاج. الذكور من هذه الأنواع لا يمكن أن يكون سجل مباشرة، ولكن سجل ذرياتهم وثم يتم تعيين قيمة للآباء والأمهات. الاقتراض من هذه الاستراتيجية، يتضمن البروتوكول المعروضة هنا النقاط الثابتة والملون المسخ نسل من زوج من الزرد التي متخالف لجينة متحولة للفائدة. يتم تعيين بينيترانسي من النمط الظاهري في ذرية متحولة قاتلة متماثل للآباء والأمهات عند البت فيها الأفراد سوف تنتج الجيل التالي في السطر. أننا نجد أن هذا الأسلوب وسيلة فعالة لتحويل penetrance في الزرد طفرات الهيكل العظمى القاتلة1.
مماثلة لغيرها من الدراسات، يأخذ هذا البروتوكول الوراثي تحت النظر في معايير مثل حجم مخلب، بقاء النسل، والتطور الطبيعي للأجنة، ونسبة الجنس9. ومع ذلك، هذه العوامل جميعا نظرت في سياق خلفية متحولة بهدف تحويل penetrance متحولة. ولذلك، يمتد هذا البروتوكول السابق الوراثي نماذج بتوفير طريقة لتعزيز التحليلات متحولة التنموية، فضلا عن زيادة تجانس الخلفية.
يتطلب هذا البروتوكول التنميط واسعة النطاق، حيث أنه من المهم وضع بروتوكول الوراثي السريع، ويمكن الاعتماد عليها في وقت مبكر. هناك كثير من التنميط البروتوكولات المتوفرة10،11، ومع ذلك نجد الصناعية التنميط12،،من1314 أسرع وتكلفة أكثر كفاءة وأكثر موثوقية من أساليب استناداً إلى انشقاق إنزيم التقييد لتضخيم تسلسل10. ولذلك، نقوم بتضمين بروتوكول الصناعية في هذا العمل. بالإضافة إلى ذلك، نركز على الهيكل العظمى تعمل المسخ في هذا البروتوكول وتشمل إجراء السيان الأزرق/الأليزارين الأحمر تلطيخ معدلة من البروتوكولات السابقة15.
الأسلوب الموصوفة هنا وضع استراتيجية واضحة لتحويل penetrance متحولة قاتلة إلى الأعلى أو إلى الأسفل. بينما يركز هذا البروتوكول على الهيكل العظمى تعمل متحولة، ونعتقد أنها ستكون استراتيجية مفيدة لتربية جميع خطوط الزرد المسخ. وفي الواقع، فائدة هذه الاستراتيجية تربية يحتمل يمتد إلى أبعد من الزرد. ونتنبأ بأنه يمكن تعديل هذا البروتوكول إزاحة penetrance في طائفة واسعة من الكائنات الحية. تحويل penetrance القاتلة عن طريق اختبار ذرية يمكن أن تساعد في دفع التقدم المحرز في أي الوراثة التنموية.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde, pelleted, solid</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, solid</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, Aqueous</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 proof Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue, solid</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>Must be from Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin Red, solid</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide,&amp;nbsp; solid</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-time PCR Machine</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; seal</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, High ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, solid</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>potassium chloride, solid</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>for DNA quantitation</td></tr></tbody></table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

وغالباً ما تعمل متحولة الزرد الاختراق غير كامل، يظهر فقط في بعض طفرات. تعمل المثيرة للاهتمام التي تظهر غير متسق يمكن أن يكون من الصعب على الدراسة، ويمكن أن يؤدي إلى التباس النتائج. بروتوكول الموصوفة هنا نموذج تربية مباشرة الزيادة والنقصان penetrance في طفرات مميتة الزرد الهيكل العظمى. لأنه لا يمكن بشكل انتقائي ولدت طفرات مميتة مباشرة، وتستخدم الاستراتيجية الكلاسيكية الوراثي لاختبار ذرية. ويشمل هذا الأسلوب أيضا بروتوكولات الزرد التنميط كومبيتيتيفي اليل محددة بكر (الصناعية) والمصبوغة الزرد اليرقات الغضاريف والعظام. تطبيق استراتيجية تربية الموصوفة هنا يمكن أن تزيد في بينيترانسي النمط الظاهري الهيكل العظمى للاهتمام تمكين المزيد من النتائج استنساخه في تطبيقات المتلقين للمعلومات. وباﻹضافة إلى ذلك، تناقص penetrance متحولة من خلال هذه الاستراتيجية الوراثي يمكن أن تكشف عن العمليات الإنمائية الأكثر حاسمة تتطلب وظيفة الجينات المتحولة. بينما على وجه التحديد يعتبر الهيكل العظمى هنا، فإننا نقترح أن هذه المنهجية ستكون مفيدة لجميع خطوط متحولة الزرد.

هذا البروتوكول أسلوب تربية طويلة الأمد مفيدة لفهم الزرد طفرات الهيكل العظمى (الشكل 1). تربية انتقائية عن طريق اختبار ذرية ينبغي أن تسفر عن تحول في بينيترانسي عموما كل التنازلي والتصاعدي في بضعة أجيال (الشكل 2). في عملنا السابق، قاد جولتين من...

Watch this Scientific Journal Video about Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing at JoVE.com

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

والهدف من هذا البروتوكول لتغيير بينيترانسي لقاتله تعمل متحولة الهيكل العظمى في الزرد بالانتقاء الوراثي. طفرات قاتلة لا يمكن أن ينمو إلى مرحلة البلوغ، وولدت أنفسهم، ولذلك يصف هذا البروتوكول وسيلة لتتبع وتحديد penetrance عبر أجيال متعددة من ذرية الاختبار.

تحويل الزرد الفتاكة Penetrance متحولة الهيكل العظمى بذرية اختبار

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

7.5K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. والهدف من هذا البروتوكول لتغيير بينيترانسي لقاتله تعمل متحولة الهيكل العظمى في الزرد بالانتقاء الوراثي. طفرات قاتلة لا يمكن أن ينمو إلى مرحلة البلوغ، وولدت أنفسهم، ولذلك يصف هذا البروتوكول وسيلة لتتبع وتحديد penetrance عبر أجيال متعددة من ذرية الاختبار.

Video: Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Genetics

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

نموذج الزرد من ورم أرومي عصبي

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Cancer Research

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

فحص الحيوانات المنوية للعزل السريع لتعديلات الخط الجرثومي في الزرد

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

الجينوبة والقياس الكمي للتهجين في الموقع تلطيخ في حمار وحشي

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Biochemistry

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biology

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

تحرير قاعدة فعال بدون PAM لنمذجة الزرد للأمراض الوراثية البشرية باستخدام zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...