Vorremmo ringraziare Chuck Kimmel per l'orientamento, John Dowd aiuto nello sviluppo di questa strategia di allevamento, Macie Walker per il suo lavoro nel perfezionare la macchia scheletrica e Charline Walker e Bonnie Ullmann per zebrafish utili consigli. Questo lavoro è stato supportato da K99/R00 DE024190 a JTN.

tutti gli esperimenti descritti nel presente protocollo sono stati completati in conformità e rispetto dell'Università del Colorado e la University of Oregon istituzionale Animal Care e uso comitati (IACUC).
 1. preparare il brodo non selezionati a partire <ol><li>identificare portatori eterozigoti dell'allele del mutante di interesse da pinna clip 11 e genotipizzazione uno stock di animali pieno-fratello germano di un metodo di scelta, come KASP 12 , 13 , 14. Questo protocollo è stato effettuato con il ceppo mef2ca b1086 zebrafish.</li>
	<li>Genotipizzazione KASP 
	Nota: Il primer specifico Allele per KASP è progettato dalla società che fornisce i reagenti (Vedi Tabella materiali). Per ottenere la concentrazione di colorante (ROX) 6-carbossi-X-rodamina corretta per la specifica macchina PCR in tempo reale visitare il sito Web aziendale.
	<ol><li>Luogo il tessuto di coda di zebrafish in 50 µ l di tampone di lisi (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, tensioattivo non ionico di 0,3%, 0,3% Octylphenyl-polietilenglicole). Aggiungere 10 µ l di proteinasi K 10 mg/mL per pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti e digest in un termociclatore a 55 ° C per 2-5 h seguita da una fase di inattivazione di 94 ° C 20 min. Refrigerare il prodotto di lisi dopo digestione. Nota: Lisi prodotti possono essere utilizzati con successo per diversi mesi dopo la preparazione. Quando il tessuto è stato lisato utilizzando 50 mM NaOH, le reazioni di KASP erano infruttuosi. Questi risultati suggeriscono che il metodo di NaOH di preparazione di DNA genomico non è compatibile con KASP.</li>
		<li>Quantificare il DNA genomic usando uno spettrofotometro. Diluire il modello di DNA genomico utilizzando acqua di grado di biologia molecolare, in modo che ogni reazione contiene circa 20-30 ng. 
		Nota: Quantificare 4 o 5 campioni, li, quindi preparare diluizioni per tutti i campioni sulla base della media. Quando si utilizza questo protocollo per tessuto adulto coda, spesso è sufficiente una diluizione di 1: 100. Non è necessaria la quantificazione precisa della concentrazione di DNA.</li>
		<li>Aggiungi 0,14 µ l di primer KASP mescolare e 5 µ l di master KASP mescolare per campione su ghiaccio in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e mescolare bene prima brevemente centrifugazione per raccogliere contenuti nella parte inferiore del tubo. 
		Nota: Mix master KASP è calore e luce sensibile, tenere scorte sul ghiaccio ed eviti la luce diretta.</li>
		<li>Pipettare 5 µ l di primer/master mescolare la soluzione nei pozzetti di una piastra PCR 96 pozzetti ottico adatto per la macchina PCR in tempo reale in uso.</li>
		<li>Pipettare 5 µ l di diluito (circa 5-7 ng / µ l) esempi di modelli di DNA in ogni bene e aspirare con una pipetta per mescolare.</li>
		<li>Aggiungere 5 µ l di acqua priva di nucleasi di 3 pozzi per servire come modello di no controlli (NTC) e aggiungere 5 µ l di tipo selvaggio omozigotico confermato diluito, eterozigotico e omozigotico modello DNA mutante per controlli positivi.</li>
		<li>Posto un sigillo di film otticamente chiaro sopra il piatto, verificando che il film è completamente sigillato su ciascun pozzetto.</li>
		<li>Centrifugare brevemente la piastra a 600 x g per raccogliere il contenuto nella parte inferiore e per rimuovere le bolle dal mix. 
		Nota: Tenere la piastra su ghiaccio e scudo dalla luce fino al momento di procedere.</li>
		<li>Utilizzare il programma ciclismo illustrato nella tabella 1 per eseguire la reazione principale di KASP.</li>
		<li>Mostra il grafico a dispersione risultante prodotto da computer analysis. Una reazione successo mostrerà 4 distinti raggruppamenti di punti sul terreno ( Figura 3): tre raggruppamenti corrisponde al genotipo e un raggruppamento di NTCs vicino all'origine di esempio. I controlli positivi dovrebbero separare con il raggruppamento di campione appropriato.</li>
		<li>Se il programma del computer non riconosce la trama possono essere raggruppamenti come corrispondenti ai genotipi specifici, ulteriori set di ciclismo necessaria (tabella 2). Ripetere il programma aggiuntivo fino a quando il computer riconosce raggruppamenti stretti dal genotipo.</li>
		<li>Esportare i risultati della genotipizzazione in un file di foglio di calcolo per analisi e uso più facile.</li>
	</ol></li> <li>Gli animali eterozigoti identificati insieme sul sistema acqua principale della casa.</li></ol>
 2. the primo Round di progenie segnando <ol><li>Croce Pairwise heterozygotes di pari livello <ol><li>dopo gli animali recupero dalla clip pinna, impostare intercrosses pairwise. Utilizzare divisori affinché gli embrioni sono sincroni 16.</li>
		<li>Raccogliere gli embrioni e tenere le coppie parentali isolate in gabbie di allevamento.</li>
		<li>Monitor adulti isolati in modo che pesci aggressivi possono essere separati o fornito con coperchio (pesce tagliuzzato reti lavoro ben). Dovrebbero essere alimentati con pesce e loro acqua cambiata seguendo linee guida IACUC mentre in acqua statica.</li>
	</ol></li> <li>Embrione allevamento <ol><li>palco e sollevare gli embrioni di zebrafish alle larve sotto condizioni standard 17.</li>
		<li>Raccogliere fenotipico selvaggio-tipo animali usando una pipetta di vetro il giorno 5 o 6 quando la vescica natatoria è gonfiata nel 75% della frizione. Posto fenotipici tipi selvatici nel vivaio di registrazione di cui i genitori hanno reso loro. 
		Nota: Con alleli mutanti che sono recessivo letale, che è vero per molti mutanti scheletrici, mutanti omozigoti non forma vesciche natatorie 18 , 19. Pertanto, fenotipici tipi selvatici possono essere facilmente individuabile dal mutante di pari livello basati su gonfiato vesciche natatorie.</li>
	</ol></li> <li>Alcian blu/alizarina rosso della cartilagine e dell'osso colorazione <ol><li>anestetizzare le larve che non gonfiano loro vesciche natatorie utilizzando 0,17 g/L tricaina-S media dell'embrione. Raccogliere gli animali in provette per microcentrifuga da 1,5 mL con un bicchiere di wide-bore pipetta Pasteur. Aggiungere non più di 100 larve per tubo.</li>
		<li>Rimuovere l'embrione acqua da ciascuna provetta e difficoltà animali in 1 mL di 2% paraformaldeide in PBS 1X per provetta. 
		Attenzione: Acquosa PFA è infiammabile e causerà grave irritazione cutanea e oculare. Indossare adeguati dispositivi di protezione personale come guanti e occhiali di protezione e lavarsi accuratamente le mani dopo l'uso.</li>
		<li>Rock per 1h; fissazione più altera la macchiatura dell'osso. Controllare i tubi regolarmente durante questo e tutti i passaggi successivi a dondolo affinché nessun larve hanno diventare bloccati al lato o raggruppati nella parte inferiore del tubo.</li>
		<li>Rimuovere il fissativo da tubi usando una pipetta di vetro, aggiungere 1 mL di etanolo al 50% e rock per 10 min.</li>
		<li>Preparare fresco macchiatura soluzione aggiungendo 20 µ l di 0,5% rosso alizarina per 1 mL di Alcian premix (0,04% Alcian blu/10mm MgCl 2 / 80% di etanolo). Eliminare l'etanolo di 50%, aggiungere 1 mL di soluzione per ogni tubo e roccia di colorazione durante la notte. Le larve possono rimanere nella macchia fino a 5 giorni.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di macchia dai tubi e aggiungere 1 mL di 80% etanolo/10mm MgCl 2 soluzione ad ogni provetta. Rock le provette per almeno 1 h; risciacquo pernottamento può produrre una più chiara macchia blu di Alcian.</li>
		<li>Rimuovere l'80% etanolo/10mm MgCl 2 soluzione dai tubi e aggiungere 1 mL di etanolo al 50%; rock per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di etanolo 50% dai tubi e aggiungere 1 mL di etanolo al 25% e rock per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di etanolo al 50% dai tubi e aggiungere 1 mL di preparato fresco 3% H 2 O 2 /0.5% soluzione sbiancante di KOH. Lasciare il tappi aperto e lasciare che i tubi di stare in un rack di micro-tubo per circa 10 minuti o fino a quando una debole colorazione marrone può essere visto nella parte superiore della soluzione. 
		Nota: Uno strato di forma di bolle in cima la soluzione. Attenta temporizzazione è necessario a questo punto, come sopra lo sbiancamento si tradurrà in un povero macchia double.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione sbiancante e aggiungere 1 mL di 25% glycerol/0.1% KOH; rock per 10 min a 1 h.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di KOH glycerol/0.1% 25% dai tubi, aggiungere 1 mL di soluzione KOH glycerol/0.1% 50% in ogni provetta, roccia per 10 min a tutta la notte.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione KOH glycerol/0.1% 50% dai tubi e nuovamente aggiungere 50% glycerol/0.1% soluzione di KOH in ogni provetta. A dondolo durante la notte vi aiuterà a rimuovere le bolle d'aria che può accumularsi all'interno di larve. Archivio macchiato scheletrici preparazioni a 4 ° C quando non in uso.</li>
	</ol></li> <li>Fenotipo segnando <ol><li>Punteggio macchiato prole mutante per la penetranza del fenotipo selezionato. In Nichols et al. 1 mutanti sono stati segnati per qualsiasi occorrenza dell'osso ectopico. 
		Nota: Poiché i genitori di zebrafish sono in acqua statica e la macchia di colore rosso di alizarina può scomparire col tempo, è importante segnare gli scheletri in pochi giorni di completare la preparazione scheletrica.</li>
		<li>Penetranza è la proporzione di un genotipo che ha un fenotipo. Calcolare la percentuale penetranza dalla seguente formula: % penetranza = (mutanti con fenotipo) / (numero totale di mutanti) × 100</li></ol></li></ol> 3. Selezione della famiglia <ol><li>Scegli due alta penetranza e due famiglie di penetranza bassa per la prossima generazione. Oltre a penetranza, è importante considerare la fecondità e vigore quando si sceglie quali famiglie di propagare; vedere la discussione per maggiori dettagli su questo.</li>
	<li>Dare ogni coppia genitoriale un identificatore stock sub: famiglia,01,,02, ecc</li>
	<li>Casa parentale coppie sul sistema principale con diversi sesso misto &#39; compagno &#39; pesce. Compagno pesce può essere qualsiasi linea di zebrafish con permanente, evidenti caratteristiche distintive, come struttura alterata pigmentazione o fin. 
	Nota: Mentre molti ricercatori mantenere con successo solo allevamento coppie in un serbatoio, i risultati favorevoli sono visti da alloggiamento coppie con parecchi pesci compagno. Questo passaggio facoltativo consente allevamento coppie di animali per essere tenuti nelle scuole più grandi e facilmente recuperate in modo da può essere attraversati più volte se necessario. Coppie dei genitori possono essere attraversate più volte per generare famiglie numerose pieno di pari livello; attendere almeno una settimana prima ripetizione attraversando la stessa coppia genitoriale.</li>
	<li>Abbattere le famiglie larvale dal punto 2.2.2. che non sono stati selezionati per la prossima generazione.</li>
	<li>Etichettare i serbatoi che contengono le larve di pari livello di selvaggio-tipo da famiglie selezionate con la penetranza dai loro fratelli germani mutante e sollevare fino all'età adulta come normale.</li>
	<li>La prossima generazione avrà almeno quattro famiglie di pieno-sibling, due per la linea verso l'alto e due per la linea verso il basso.</li>
	<li>Quando le larve raggiungono la maturità sessuale, ripetere il protocollo partendo dal punto uno con la nuova generazione.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca.">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism,+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+(HDR).">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li><li>Cox, S. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Allevamento selettivo svela sottigliezze della funzione del Gene
Lo spostamento di fenotipi mutanti per essere più o meno gravi di allevamento selettivo è un modo semplice per acquisire nuove conoscenze in funzione del gene. Quando confrontato con i metodi standard di allevamento non selezionato, il protocollo qui presentato può produrre una comprensione più completa dei fenotipi mutanti. In particolare, tramite la generazione di ceppi che sono gravi, può essere rivelata ...

Zebrafish è un sistema potente modello per comprendere lo sviluppo scheletrico. Con ceppi mutanti di zebrafish, biologi possono decifrare la funzione del gene durante skeletogenesis. Tuttavia, zebrafish fenotipi mutanti scheletrico possono presentare con penetranza variabile1,2,3,4 che può ostacolare l'analisi evolutiva e genetiche. Lo scopo di questo metodo è triplice. In primo luogo, generando linee mutanti di zebrafish che costantemente producono fenotipi gravi consente studi evolutivi a valle come registrazione time-lapse trapianto e5 6. Questi tipi di studi possono essere paralizzati dal tentativo di studiare fenotipi che si manifestano solo in modo incoerente. In secondo luogo, l'inbreeding zebrafish ceppi può diminuire variazione background genetico, favorendo così la riproducibilità e consistenza sperimentale. Ad esempio, corso tutti in situ analisi di ibridazione su uno sforzo selettivamente inbred possono ridurre la variabilità confondenti e rafforzare le conclusioni. In terzo luogo, generando gravi e lievi ceppi rivelerà tutta la serie fenotipica che può derivare da una mutazione particolare.
A prima vista, l'allevamento selettivo di mutanti letali sembra impossibile. Come può una razza per penetranza quando gli animali che sono segnati per la selezione sono morti? Fortunatamente, metodi di allevamento selettivo di selezione della famiglia, in particolare progenie test, hanno dimostrato efficacia in allevamento programmi per molti anni7,8. Questi programmi sono utilizzati principalmente per l'allevamento selettivo per tratti che presenti solo in uno dei due sessi, come la produzione di latte delle vacche o produzione di uova nelle galline. I maschi di queste specie non possono essere segnati direttamente, ma loro progenie sono segnati e quindi viene assegnato un valore ai genitori. Prendendo in prestito da questa strategia, il protocollo presentato qui coinvolge segnando la prole mutante fissa e macchiata da una coppia di zebrafish che sono eterozigoti per un gene mutante di interesse. La penetranza di un fenotipo nella prole mutante letale omozigotico è assegnata ai genitori quando si decide quali individui produrrà la prossima generazione in linea. Troviamo che questo metodo è un efficace mezzo di spostamento penetranza in zebrafish mutanti scheletrica letale1.
Simile ad altri studi, questo protocollo di allevamento selettivo prende sotto criteri di considerazione come la nidiata, sopravvivenza della prole, normale sviluppo di embrioni e di rapporto del sesso9. Tuttavia, questi fattori sono considerati nel contesto di uno sfondo mutante con l'obiettivo di trasferire la penetranza mutante. Pertanto, il presente protocollo estende precedenti paradigmi di allevamento selettivo, offrendo un metodo per rafforzare analisi mutante inerente allo sviluppo, nonché di aumentare l'omogeneità di fondo.
Questo protocollo richiede vasta genotipizzazione, quindi è importante sviluppare un protocollo affidabile, rapido genotipizzazione in anticipo. Ci sono molti genotipizzazione protocolli disponibili10,11, tuttavia troviamo il KASP genotipizzazione12,13,14 è più veloce, costo più efficiente e più affidabile rispetto ai metodi basato sulla fenditura di enzima di restrizione di sequenze amplificate10. Di conseguenza, includiamo un protocollo KASP in questo lavoro. Inoltre, ci concentriamo sui fenotipi mutanti scheletrici in questo protocollo e includono una procedura per colorazione modificate da precedenti protocolli15Alcian blu/alizarina rossa.
Il metodo qui descritto è una strategia semplice per letale mutante penetranza di spostamento verso l'alto o verso il basso. Mentre questo protocollo si concentra sui fenotipi mutanti scheletrici, crediamo che sarà una strategia utile per allevamento di tutte le linee di zebrafish mutanti. Infatti, l'utilità di questa strategia di allevamento probabile si estende di là di zebrafish. Prevediamo che questo protocollo può essere modificato per spostare penetranza in una vasta gamma di organismi. Lo spostamento di penetranza letale progenie test può aiutare a spingere in avanti il progresso di qualsiasi genetista inerente allo sviluppo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Paraformaldehyde, pelleted, solid</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Co.</td>
			<td style="width:119px;">18501</td>
			<td style="width:167px;">Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Acros Organics</td>
			<td>223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS, Aqueous</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">190 proof Ethanol</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcian Blue, solid</td>
			<td style="width:125px;">Anatech Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">867</td>
			<td>Must be from Anatech</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alizarin Red, solid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5533-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP263500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium hydroxide,&#160; solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P250 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StepOnePlus Real-time PCR Machine</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL)</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microseal &#39;B&#39; seal</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP Master Mix, High ROX</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td>KBS-1016-022</td>
			<td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP By Design Primer Mix</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td style="width:119px;">KBS-2100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris HCl, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP153 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP337 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nonidet P40</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:125px;">Western Chemicals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T100 Thermal Cycler</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Controlled Drop Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td>13-678-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for DNA quantitation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

Fenotipi mutanti di zebrafish sono spesso in modo incompleto con liquidi penetranti, solo che si manifesta in alcuni mutanti. Fenotipi interessanti che compaiono in modo incoerente possono essere difficili da studiare e possono portare a risultati di confondimento. Il protocollo descritto qui è un paradigma di allevamento semplice per aumentare e diminuire la penetranza nei mutanti scheletrica letale zebrafish. Perché mutanti letali non possono essere selettivamente allevati direttamente, la strategia di allevamento selettivo classico di progenie test è impiegata. Questo metodo include anche protocolli per Kompetitive Allele specifico PCR (KASP) genotipizzazione zebrafish e colorazione zebrafish larvale della cartilagine e dell'osso. Applicare la strategia di allevamento descritta qui può aumentare la penetranza di un fenotipo scheletrico interessante consentendo ulteriori risultati riproducibili in applicazioni a valle. Inoltre, diminuendo la penetranza mutante attraverso questa strategia di allevamento selettivo può rivelare i processi di sviluppo che richiedono più fondamentalmente la funzione del gene mutato. Mentre lo scheletro in particolare è considerato qui, proponiamo che questa metodologia sarà utile per tutte le linee mutanti di zebrafish.

Questo protocollo è una tecnica di allevamento a lungo termine utile per mutanti di comprensione zebrafish scheletrico (Figura 1). Allevamento selettivo di progenie test dovrebbe produrre un cambiamento in generale penetranza sia verso il basso e verso l'alto in poche generazioni (Figura 2). Nel nostro lavoro precedente, due turni di allevamento selettivo ha guidato la penetranza media verso il basso dal 17% al 3%<sup class="xre...

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Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

L'obiettivo del presente protocollo è di alterare la penetranza dei fenotipi mutanti scheletrici letale in zebrafish allevamento selettivo. Mutanti letali non possono essere coltivate all'età adulta e si sono allevati, pertanto questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio e selezione penetranza attraverso più generazioni di progenie test.

Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

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7.5K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. L'obiettivo del presente protocollo è di alterare la penetranza dei fenotipi mutanti scheletrici letale in zebrafish allevamento selettivo. Mutanti letali non possono essere coltivate all'età adulta e si sono allevati, pertanto questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio e selezione penetranza attraverso più generazioni di progenie test.

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell&#39;embrione del mouse dalla citometria del flusso

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolamento delle pericelle di tipo I e II di muscoli scheletrici del mouse

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Esecuzione di Xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...