يصف هذا البروتوكول طريقة لفحص آلاف الجينومات بسرعة باستخدام الحيوانات المنوية المحقونة ب F0 CRISPR. هذه التقنية مفيدة في إمكانية الوصول إليها. بدلا من الأساليب المكلفة والمتخصصة القائمة على التسلسل ، تستخدم طريقتنا إنزيمات تقييد تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي الهلامي لفحص حاملات الذكور F0 بحثا عن indels أو تعديلات جينوم محددة.
الجزء الأصعب من هذا الإجراء هو مجرد الحصول على الحيوانات المنوية بسرعة ، لكنه يصبح تقنية جيدة للتخصيب في المختبر إذا عملنا مع الكثير من الأسماك المشوهة ، وبالتالي فهي طريقة سهلة بالنسبة لنا لعبور الأسماك التي تسبب لنا المتاعب. ابدأ بإعداد خزانات تربية لكل من النوع البري وأسماك F0 واحتضان الخزانات طوال الليل. بعد تخدير ذكور الأسماك في اليوم التالي ، استخدم ملعقة مثقوبة لنقلها إلى كومة من المناشف الورقية النظيفة.
لفة السمك بلطف لإزالة الماء الزائد. قم بإزالة أي ماء عن طريق تجفيفه بمنديل مطوي نظيف. باستخدام الملعقة ذات فترة زمنية محددة ، انقل السمك إلى الإسفنج المحضر.
ضع الجانب البطني للأسماك لأعلى وامسح المنطقة المحيطة بالزعانف الشرجية برفق بورق مناديل مطوي نظيف. لجمع الحيوانات المنوية ، استخدم أنبوبا شعريا لتحريك زعانف الحوض برفق بعيدا عن خط الوسط ، مما يؤدي إلى كشف العباءة. ضع الأنبوب الشعري بالقرب من العباءة.
بأصابعك أو زوج من ملقط المرشح ، اضغط برفق على جوانب السمكة من الخياشيم لأسفل. باستخدام العمل الشعري ، اجمع الحيوانات المنوية في الأنبوب وضعها في أنبوب PCR يحتوي على 40 ميكرولترا من محلول هيدروكسيد الصوديوم 50 مللي مولار ، ثم طرد العينة في الأنبوب. بعد تدوير عينات الحيوانات المنوية في جهاز طرد مركزي صغير ، ضع أنابيب PCR في جهاز تدوير حراري.
قم بتشغيل جهاز التدوير عن طريق تسخين العينات لمدة 40 دقيقة عند 95 درجة مئوية متبوعا بالتبريد عند 25 درجة مئوية. بعد إزالة العينات من جهاز الدورة ، قم بتحييد الرقم الهيدروجيني بإضافة 10 ميكرولتر من هيدروكلوريد تريس المولي الواحد من الرقم الهيدروجيني ثمانية. امزج عن طريق استنشاق التعليق ثم الطرد المركزي للعينات.
اضبط جهاز التدوير الحراري على 95 درجة مئوية للتسخين المسبق. وفي غضون ذلك ، قم بإعداد 25 ميكرولترا من خليط تفاعل PCR لكل عينة من الحيوانات المنوية. امزج جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، ثم قم بتدوير العينات.
ضع العينات في جهاز التدوير الحراري المسخن مسبقا واضبط الدورة. للحصول على محلول جل ، قم بتسخين محلول جل الأغاروز بنسبة 4٪ في الميكروويف عن طريق خلط مسحوق الأغاروز وصبغة الجل والمخزن المؤقت TBE. صب محلول الجل في إطار صب هلام وأدخل مشطا على جانب واحد.
بعد تصلب الجل ، قم بإزالة المشط بعناية. ضع الجل في جهاز كهربائي بحيث تكون الآبار أقرب إلى القطب السالب. صب المخزن المؤقت لتشغيل TBE في الحفارة حتى يتم غمر الآبار بالكامل.
ابدأ في تحميل الجل عن طريق سحب خمسة ميكرولترات من سلم الحمض النووي في البئر الأول. قم بتحميل الآبار المتبقية ب 5 إلى 10 ميكرولتر من منتج PCR. قم بتشغيل الجل لمدة 1 ساعة عند 150 فولت لضمان الفصل الكافي للمضخمات.
استخدم جهاز تصوير الهلام لعرض أشرطة الحمض النووي. أظهر تحليل موضع P2ry12 أن amplicon من النوع البري أظهر نطاقا واحدا بطول 250 زوجا أساسيا بينما تم تشغيل الأمبليكونات الذكرية المحقونة F0 التي تحتوي على indels كنطاقات متعددة. أظهر تحليل موضع DNAH10 أن amplicon من النوع البري يعمل كنطاق واحد طويل من 400 زوج أساسي.
تم تشغيل مضخمات الذكور المحقونة F0 التي تحتوي على indels كنطاقات متعددة أو كفرقة واحدة مع انخفاض حركة الهلام. كان لدى الذكر رقم واحد المحقون ب F0 شريط إضافي في المنتج المهضوم ، والذي كان غائبا في منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يجعله أفضل مرشح مؤسس لإنشاء خط طرق متحول. إذا لم تنتج الأسماك الذكور الحيوانات المنوية عند عصرها ، فمن الأفضل إراحة الأسماك لمدة أسبوع والمحاولة مرة أخرى بدلا من الضغط عليها بشدة والمخاطرة بإيذائها.
بمجرد أن يتم تهجين FC أو المؤسس الذكر ، يجب التحقق من تسلسل الأليلات في ذرية F1. يعد تسلسل مضخمات F1 مباشرة وإجراء تحليل الأليل غير المتجانس طريقة سهلة للقيام بذلك.
