هذا العمل كان يدعمها مجلس المعاهد الكندية للبحوث الصحية والعلوم الطبيعية والبحوث الهندسية (منحة اكتشاف الأموال) و "مؤسسة سافوي". وأيد قائد زمالة دكتوراه من الأموال.

جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة حماية الحيوان من جامعة لافال، والمجلس الكندي للعناية بالحيوان الرفق بالحيوان.
1-أولى إعداد (اختياري: إعداد يوم 1 مقدما)
<ol><li>إعداد ثلاثة أنواع من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام) الحل (كل من عادي، السكروز وحلول الاسترداد، 1 L؛ انظر الجدول 1). ضبط أوسمولاليتي الحلول ل موسم ± 10 30025 وبارد قام-السكروز وصولاً إلى نقطة بالقرب من تجميد (0-4 درجة مئوية). ملاحظة: استخدام حل قطع منخفضة الصوديوم (قام-السكروز) يساعد في الحفاظ على بقاء الخلايا العصبية في الطبقات السطحية لشرائح الحادة26.</li>
	<li>إعداد 0.75 مل من التصحيح-الحل الذي يحتوي على فلوروفوري أحمر (مثلأليكسا-594) ومؤشر أخضر كالسيوم اصطناعية (مثلاً، ولاية أوريغون الأخضر باتا-1؛ انظر الجدول 1). وتشمل بيوسيتين (انظر الجدول 1) في التصحيح-الحل إذا كان مطلوب وظيفة المخصصة تحديد الخلايا مسجل المورفولوجية.</li>
	<li>ضبط osmolality الحل إلى 280 ± 5 موسم ودرجة الحموضة إلى 7.35 ± 0.5. يبقى الحل في الثلاجة أو على الجليد في جميع الأوقات. ملاحظة: اختيار مؤشر الكالسيوم ينبغي أن تستند إلى نطاق ديناميكي وطبيعة التحقيق Ca2 + الأحداث.</li>
	<li>باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي، إعداد الماصات التصحيح من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية (انظر الجدول للمواد) مع تلميح 2 ميكرومتر ≈ (مقاومة ماصة MΩ 3-5) والتحفيز الماصات من البورسليكات الزجاج ثيتا الشعيرات الدموية (انظر الجدول من المواد) مع تلميح 2-5 ميكرومتر. ملاحظة: سيتم تحديد إعدادات ساحبة جعل الممصات قطر معين والشكل حسب نوع خيوط ساحبة ونتائج اختبار الانحدار لنوع معين من الزجاج.</li>
</ol>2. إعداد الشريحة هيبوكامبال
<ol><li>تخدير الماوس (P13-20؛ والسلالة والجنس من الماوس تتحدد بمسألة تجريبية تعالج) مع 1 مل إيسوفلوراني توضع على منشفة ورقية داخل دائرة الخدر لاستنشاق. عند عمق تخديره الحيوان، كما يدل على ذلك انعدام الحركة والتنفس البطيء، إزالته من غرفة التخدير وقطع رأس باستخدام مقصلة.</li>
	<li>كشف الجمجمة بقطع الجلد مع زوج صغيرة من مقص من الجزء الخلفي الجمجمة إلى الآنف. استخدام زوج صغيرة من العظم ميني رونجيورس جعل ثقب على مستوى بريجما. ثم استخدام المقص لجعل قطع والذيلية إلى روسترال على طول خياطة السهمي. مع رونجيورس فهم الجزء الخلفي من كل رفرف الجمجمة ورفع إلى أعلى وإلى الخارج لإزالة الجمجمة تغطي كل نصف الكرة الأرضية.</li>
	<li>بعد تماما يتعرض الدماغ، تتقلص الأعصاب البصرية مع ملعقة صغيرة. إزالة الدماغ من الجمجمة، ووضعه في طبق بتري تحتوي على استمرار السكروز قام اﻷوكسيجين، الباردة (انظر الجدول 1 لتركيز السكروز).<ol>
<li>إذا كان مطلوباً الأنسجة من الفئران الأكبر سنا، أداء نضح إينتراكاردياك استخدام المحاقن (25 غ) مليئة 20 مل سكروز قام المثلج قبل استخراج الدماغ للحصول على شرائح ذات نوعية جيدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد شرائح هيبوكامبال من الدماغ الحيواني المستخرج.<ol>
<li>واسمحوا البرد الدماغ لحوالي 2 دقيقة ضع قطعة من ورق الترشيح على طبق بيتري "معبأة الجليد"، نقل المخ على الورق عامل التصفية. تشريح نصفي.</li>
		<li>الصق في نصفي الكرة الأرضية تشريح (الاتجاه يحدده الهدف التجريبية للحصول على شرائح مستعرضة، أو الأفقي coronal،) على جدول فيبرتوم وتزج أنه في علبة فيبرتوم مليئة قام اﻷوكسيجين المثلج-السكروز. جعل 300 ميكرون الشرائح سميكة عند درجة حرارة حوالي 1 درجة مئوية باستخدام فيبرتوم برودة أو بوضع الثلج حول علبة فيبرتوم.</li>
		<li>باستخدام فرشاة طلاء مسطحة، تتراكم الشرائح المحتوية على الحصين (تصل إلى 6 شرائح كل نصف الكرة الأرضية) في حمام يحتوي على استرداد قام اﻷوكسيجين تسخينها إلى 37 درجة مئوية.</li>
		<li>تترك الشرائح في الحمام قام-الإنعاش لمدة 45 دقيقة على الأقل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية
<ol><li>تعيين شريحة هيبوكامبال في مكان في حمام المتمركزة في إطار الهدف (التكبير: 40 ×، الفتحة العددية: 0.8) مجهر مسح ليزر اثنين-فوتون. نتخلل الحمام باستمرار مع اﻷوكسيجين العادي قام ساخنة في 30-32 درجة مئوية بمعدل 2.5-3 مل/دقيقة.</li>
	<li>استخدم التباين التدخل التفاضلية الأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) أو مجهرية SGC دودت إلى موقع خلية للاهتمام باستخدام حجم، وشكله، وموقف. ملاحظة: اعتماداً على السكان المستهدفين العصبية، ويمكن استخدام نموذج الفأر وراثيا بسهولة تحديد موقع الخلايا التي تهم. وفي هذه الحالة، يمكن أن يكون محل هذه الخطوة باستخدام مصدر ضوء الفلورسنت.</li>
	<li>ملء ماصة تحفيز مع حلاً قام عادي الذي يحتوي على فلوروفوري أحمر (مثلأليكسا-594).</li>
	<li>تعيين ماصة التحفيز (متصلة بوحدة تحفيز كهربائي) على رأس الشريحة حيث يكون الطرف في المنطقة ذاتها كالخلية للفائدة.</li>
	<li>بعد ملء الماصة التصحيح مع تصحيح الحل وإرفاقها إلى مرحلة رأس، وضعه على الشريحة حيث يكون طرفها مباشرة فوق الخلية للفائدة.</li>
	<li>تناسب حقنه محبس الحنفية الثلاثية وتوصيله إلى التصحيح-الماصة من خلال أنبوب بلاستيكي. الضغط الإيجابي المستمر بحقن ماصة التصحيح (≈ مل 0.1) استخدام المحاقن. الاحتفاظ محبس الحنفية في موقف "إغلاق".</li>
	<li>تنشيط وحدة برمجيات التحكم مكبر للصوت، وقم بالتبديل إلى وضع المشبك الجهد عن طريق النقر فوق الزر "الرأسمالي". فتح برنامج اقتناء البيانات الكهربية (مثلاً، كلامبيكس) للحصول على الإشارات الكهربية وانقر على أيقونة "اختبار الغشاء" لأنها باستمرار إرسال نبضة جهد مربعة (5 mV، 10 مللي ثانية)، التي ضرورية لمراقبة التغيرات في المقاومة ماصة.</li>
	<li>أقل ماصة التصحيح حتى والحق في أعلى الخلية المستهدفة. عند إجراء الاتصال مع غشاء الخلية، إزالة الضغط عن طريق تحويل في محبس الحنفية إلى موقف "فتح". ملاحظة: الاتصال مع غشاء الخلية يتم الكشف عن عند زيادة صغيرة في المقاومة ماصة (≈ 0.2 MΩ) وينظر ويسببه الضغط الإيجابي المسافة بادئة صغيرة في الخلية.</li>
	<li>تطبيق ضغط سلبي طفيف على ماصة التصحيح باستخدام حقنه فارغة تركيبها في محبس الحنفية حتى تصل مقاومة ماصة المقدمة من البرنامج إلى 1 GΩ. في إطار '"اختبار الغشاء"' برنامج اقتناء البيانات، المشبك الخلية عند-60 أم.</li>
	<li>مواصلة تطبيق الضغط السلبي حتى يتم فتح الخلية ويتحقق تكوين كامل الخلية. الكشف عن هذه الخلية الدولة يستند إلى التغير المفاجئ في المقاومة ماصة (من 1 GΩ إلى MΩ 70-500 تبعاً لنوع إينتيرنيورون) وظهور العابرين بالسعة الكبيرة في نافذة '"اختبار الغشاء"'.</li>
</ol>4-اثنين-فوتون Ca2 + تصوير
<ol><li>إذا كانت مهتمة في الردود بوستسينابتيك ضادات، إضافة جابازيني مانع مستقبلات GABAA (10 ميكرون) ومانع مستقبلات GABAب CGP55845 (2 ميكرومتر) في الحمام قام.</li>
	<li>في مكبر للصوت برامج وحدة التحكم، تعيين تكوين التصحيح الحالية-المشبك بالنقر فوق الزر "نسخة" وتسجيل نمط الخلية إطلاق النار ردا على حقن جسدية من ديبولاريزينج الحالي (0.8-1.0 غ، 1 s). انتظر 30 دقيقة على الأقل للخلية تكون مليئة بالمؤشرات الحالية في حل التصحيح. ملاحظة: الخلية نمط إطلاق النار وخصائص نشطة يمكن استخدامها لتحديد النوع الفرعي للخلية؛ مثلخلايا النتوءات سريعة. من المهم تركيز المؤشر لتحقيق الاستقرار من خلال نشر قبل البدء في تسجيل القطط (انظر الجدول 2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).</li>
	<li>أ فب-أثارت القطط<ol>
<li>ابدأ باستخدام صورة اقتناء برامج الحصول على الصور. قم بتحديد موقع تغصن الاهتمام باستخدام إشارة حمراء الأسفار. لضمان استجابة مرئية، اختر أولاً، تغصن الدانية (≤ 50 ميكرومتر) كفاءة AP backpropagation قد تراجع إلى حد كبير مع المسافة في جابايرجيك إينتيرنيورونس22.</li>
		<li>باستخدام 'أداة مستطيلة' في صورة اقتناء البرمجيات، التكبير والتصغير في المنطقة المستهدفة، وقم بالتبديل إلى "xt" وضع (linescan). وضع المسح الضوئي عبر فرع الجذعية للفائدة. مع وحدة تحكم كثافة الليزر في اقتناء البرمجيات، تعيين الليزر اثنين-فوتون على مستوى الحد أدنى من سلطة حيث fluorescence الأساس الأخضر مرئياً قليلاً فقط، لتجنب الضيائية.</li>
		<li>في برنامج اقتناء الكهربية البيانات 'بروتوكول' الإطار والصورة اقتناء البرمجيات، إنشاء محاكمة تسجيل المدة المطلوبة تتضمن حقنه الحالية جسدية من السعة المطلوبة.<ol>
<li>استخدام برنامج اقتناء الصور، انقر فوق الزر "بدء تشغيل السجل" والحصول على الأسفار بشكل مستمر لتكرار س. 1-2 الحصول على الصورة 3-10 مرات. الانتظار على الأقل 30 ثانية بين مسح واحد لتجنب د. إذا كان الحصول على لينيسكانس في نقاط متعددة على طول تغصن، أخذها في ترتيب عشوائي لتجنب آثار النظام.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>أثارت سينابتيكالي القطط<ol>
<li>قم بتحديد موقع تغصن الاهتمام باستخدام إشارة حمراء الأسفار.</li>
		<li>تعيين ماصة التحفيز على سطح الشريحة أعلاه تغصن من الفائدة. انخفاض ببطء ماصة التحفيز في مكانها، التقليل من الحركة لتجنب الإخلال بتكوين كامل الخلية. موقف الماصة في 10-15 ميكرون من تغصن.</li>
		<li>تصور موقع ميكرودومينس متشابك في أسبيني dendrites، في صورة اقتناء برامج التحول إلى 'xt' وضع (linescan) وضع خط طول الفرع الجذعية للفائدة.</li>
		<li>في نافذة 'بروتوكول' (من برنامج اقتناء البيانات الكهربية) وبرنامج اقتناء الصور، قم بإنشاء محاكمة تسجيل الذي يقوم بتشغيل وحدة التحفيز بعد بدء المحاكمة.</li>
		<li>باستخدام البرمجيات، واقتناء انقر فوق الزر "بدء تشغيل السجل" للمسح الضوئي على طول تغصن باستمرار لاكتساب تكرار س. 1-2 3-5 مرات، الانتظار 30 ثانية بين مسح لمنع د. ملاحظة: يمكن تعديلها تبعاً لحركية الحدث مقولة طول المسح الضوئي، ولكن ينبغي التقليل من منع د (انظر الجدول 2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).</li>
		<li>كرر الخطوة 4.5.5 في ظروف مختلفة (مثلاً، كثافة/طول مختلفة من التحفيز، وإدخال مانع الدوائية، و ما إلى ذلك) اعتماداً على مسألة محددة يجري تناولها.</li>
		<li>التوقف عن شراء عند الخلية يظهر علامات على تدهور الصحة: depolarization أدناه-45 mV، الزيادة في الأساس Ca2 + مستوى، تدهور المورفولوجية dendrites (مثلاً، بلبينغ، تجزئة؛ انظر الجدول 2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).</li>
		<li>للحصول على معلومات أولية عن مورفولوجيا للخلية والاحتفاظ بسجل لموقع ماصة التحفيز واكتساب Z-كومة من الخلية في القناة الحمراء. استخدام برنامج اقتناء في 'xyz' الوضع، تعيين حدود المكدس العلوية والسفلية الصورة الخلية بأكملها مع كافة العمليات المدرجة. تعيين 'حجم الخطوة' في 1 ميكرومتر، والشروع في اقتناء المكدس باستخدام الزر "بدء تشغيل السجل".</li>
		<li>عندما Z-اقتناء مكدس كامل، استخدم الخيار "الإسقاط كحد أقصى" في البرنامج إلى ركب جميع خطط التنسيق من المكدس والتحقق من نوعية حيازة. ثم تتراجع ببطء ماصة التصحيح خارج الشريحة.</li>
		<li>لإصلاح الشريحة لتحديد الخصائص المورفولوجية وظيفة المخصص ، بسرعة إزالة الشريحة من حمام استخدام فرشاة طلاء مسطحة، ووضعه بين ورقتي التصفية، في طبق بتري مملوءة قام. استبدال قام بحل بارافورمالدهيد (PFA) 4% وترك الطبق في غرفة 4 درجات مئوية أو الثلاجة بين عشية وضحاها.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5-إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد الخلايا مسجل المورفولوجية الوظيفة المخصصة
ملاحظة: بعد ليلة 1 للتثبيت في منهاج عمل بيجين، الشريحة يمكن تخزينها في المخزن المؤقت للفوسفات (PB) مع أزيد الصوديوم (0.5%) لمدة تصل إلى شهر واحد.
<ol><li>وضع الشريحة في تريس مخزنة المحلول الملحي (تبس) مع Triton X-100 (0.3 في المائة)، وأداء يغسل 4 (5-10 دقيقة كل).</li>
	<li>وضع الشريحة في تبس-تريتون 0.3% مع 10% مصل الماعز العادي (خ ع) ح 1.</li>
	<li>وضع الشريحة في تبس-تريتون 0.3% مع 1% خ ع و fluorophore Streptavidin مترافق (مثلاً، Streptavidin مترافق أليكسا فلور 546، 1: 200) لليلة وضحاها الحضانة.</li>
	<li>أغسل 4 مرات (5-10 دقيقة) في tbs.</li>
	<li>تحميل الشرائح على شرائح المجهر والصورة باستخدام مجهر [كنفوكل]. لإعادة إنشاء خلية كاملة، اكتساب Z-المكدس (الخطوة الحجم: 1 ميكرومتر) استخدام هدفا 20 x. بالنسبة للتصوير على تسمية أليكسا-546-مترافق، تعيين استخدام ليزر نانومتر 543 والكشف عن 515-560 نانومتر تصفية.</li>
</ol>6-تحليل القطط
<ol><li>استخراج القيم الأسفار من مناطق الاهتمام (رويس) في الصور linescan من قنوات الأحمر والأخضر ومتوسط قيم يكرر متعددة لكل شرط للحد من الضوضاء. ملاحظة: عند اقتناء linescan على طول تغصن, من الممكن استخراج بيانات من رويس المتعددة، التي قد تتوافق مع ميكرودومينس الجذعية (2-5 ميكرومتر)، ومما يسمح دراسة لتجزئة Ca2 + إشارة.</li>
	<li>لكل عائد الاستثمار، التعبير عن التغيرات التي حدثت في Ca2 + السعة ك: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> ملاحظة: هنا ز قيمة الأسفار من قناة الأخضر؛ ز0 هو قيمة الأسفار الأساس من قناة الأخضر خلال فترة ما قبل التحفيز؛ R هي قيمة الأسفار من القناة الحمراء18. اثنين-فوتون الإثارة العالية مترجمة ولا يؤدي إلى إنشاء خلفية كبيرة، طرح الأسفار الخلفية غير مطلوب.</li>
</ol>

<ol><li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li>
<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
<li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li>
<li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li>
<li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li>
<li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li>
<li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li>
<li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li>
<li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2%2B+signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li>
<li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2%2B+signaling+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li>
<li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thespread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+release+of+Ca2%2B+from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li>
<li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca%282%2B%29+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites%3A+contribution+of+Ca2%2B-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li>
<li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones%3A+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li>
<li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li>
<li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5(2004).</li>
<li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10777761">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/225093837_Functional_compartmentalisation_and_regulation_of_postsynaptic_Ca2_transients_in_inhibitory_interneurons">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li>
<li>Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+%28IS3%29+cells+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li>
<li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2%2B+signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li>
<li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li>
<li>Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons%3A+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259(2012).</li>
<li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+RevNeurosci%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li>
<li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li>
<li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+two-photon+uncaging%3A+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li>
<li>Salomé, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li>
<li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li>
</ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية أو غيرها تضارب في المصالح.

الأسلوب هو موضح أدناه يوضح كيف يمكن استخدام المزيج من اثنين-فوتون Ca2 + تصوير والتصحيح-المشبك الكهربية لدراسة الجذعية Ca2 + إشارات في dendrites العصبية في الدماغ الحادة شرائح. يسمح هذا الأسلوب للرصد لكلا المحلية Ca2 + المرتفعات أثارت قبل AP التحفيز أو باكبروباجاتينج الكهربائية في ق...

المساهمة من خلية إلى نشاط الشبكة يتحدد إلى حد كبير بالطابع الدينامي للمدخلات متشابك التي يتلقاها. تقليديا، يعتمد الأسلوب السائد لوصف النشاط متشابك في الخلايا العصبية على تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية جسدية من تيارات بوستسينابتيك أثارت قبل التحفيز الكهربائي لمحاور عصبية مرور. ومع ذلك، يقال صدق النشاط الوحيد لنهايات بروكسيمالي يقع في هذه الحالة1. وبالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت لتقييم الآليات الخاصة بالمشبك، تسجيلات من أزواج من الخلايا العصبية ومن dendrites في موقع معين لاستهداف نقاط الاشتباك العصبي للفائدة وآليات التكامل الجذعية، على التوالي. وقد تحقق إنجازا كبيرا في مجال الفسيولوجيا متشابك عن طريق أج تقنيات الضوئية والكهربية. اثنين-فوتون الإثارة الليزر الفحص المجهري (2PLSM) في تركيبة مع Ca2 + تصوير وأدوات أوبتوجينيتيك يمكن أن تكشف عن تفاصيل هائلة لمنظمة دينامية النشاط متشابك في الاتصالات العصبية محددة في الدماغ شرائح في المختبر و في فيفو.
العديد من المزايا الرئيسية التي 2PLSM تبرز من الفحص المجهري الإثارة التقليدية، واحد-فوتون2: (1) نظراً لطابع غير خطية للإثارة اثنين-فوتون، يتم إنشاؤها الأسفار فقط في حجم الاتصال، وتمثل جميع الفوتونات المنبعثة إشارات مفيدة (لا حاجة للثقب)؛ (2) أطول الأطوال الموجية، المستخدمة في 2PLSM، اختراق الأنسجة ونثر أكثر كفاءة؛ وبالإضافة إلى ذلك، الفوتونات متناثرة مخفف جداً لإنتاج اثنين-فوتون الإثارة والأسفار الخلفية؛ (3) د ولالضيائيه محدودة أيضا إلى المستوى البؤري. ولذلك، يظل 2PLSM على الرغم من ارتفاع تكاليف نظم 2-فوتون بالمقارنة مع التقليدية [كنفوكل] المجاهر، أسلوب الاختيار للتحقيق ذات الدقة العالية لهيكل الخلايا العصبية ووظيفتها في الأنسجة الحية سميكة.
وكان أول تطبيق ل 2PLSM في الأنسجة ونثر صورة هيكل ووظيفة العمود الفقري الجذعية3. وكشفت 2PLSM في تركيبة مع Ca2 + تصوير تلك الوظيفة الأشواك كالمقصورات البيوكيميائية معزولة. إذ يوجد في العديد من أنواع الخلايا العصبية وجود تناظر رأس برأس بين العمود الفقري ونهايات فردية4، اثنين-فوتون Ca2 + التصوير قريبا أصبح أداة مفيدة الإبلاغ عن نشاط نهايات الفردية في أنسجة سليمة5، 6،،من78. وعلاوة على ذلك، على أساس 2PLSM Ca2 + التصوير استخدمت بنجاح لرصد نشاط قنوات الكالسيوم واحد والتفاعلات غير الخطية بين كوندوكتانسيس الذاتية ومتشابك، فضلا عن تقييم الدولة والنشاط-تعتمد على تنظيم Ca2 + إشارات في dendrites العصبية5،،من67،،من89،10،11.
الكالسيوم رسول ثانية داخل الخلايا في كل مكان، وفي تنظيم الزمانية المكانية سوبسيلولار يحدد اتجاه ردود الفعل الفسيولوجية، من التغيرات في قوام متشابك لتنظيم أيون القنوات، النمو تغصن والعمود الفقري، كما كذلك موت الخلية والبقاء على قيد الحياة. Ca2 + المرتفعات الجذعية تحدث عن طريق تفعيل مسارات متعددة. فتح قنوات الكالسيوم الجهد عن طريق بوابة12 إمكانات العمل (الجزائرية)، باكبروباجاتينج إلى dendrites، وإنتاج العالمية نسبيا Ca2 + العابرين (القطط) في dendrites والاشواك13. ويرتبط انتقال متشابك مع التنشيط من كاليفورنيا بوستسينابتيك2 +-مستقبلات نفاذية (نمدا، Ca2 +-نفاذية امبا وكينيت)، أحداث متشابك القطط6،،من1415. وأخيراً، يمكن أن تتولد سوبرالينير Ca2 + الأحداث في dendrites تحت بعض الظروف11،12،،من1316.
اثنين-فوتون Ca2 + تصوير في تركيبة مع التصحيح-المشبك التسجيلات الكهربية توظف Ca الاصطناعية2 +-مؤشرات الفلورسنت الحساسة، التي تقدم عادة من خلال مسرى التصحيح أثناء تسجيلات كامل الخلية . ويستند أسلوب قياسي للتحديد الكمي لديناميات Ca2 + 17،الأسلوب المزدوج المؤشر18. يستخدم fluorophores اثنين مع المنفصلين عن ذويهم أيضا انبعاثات الأطياف (مثلاً، وهو مزيج من كاليفورنيا الأحمر2 +-صبغة غير حساسة مع الأخضر Ca2 + المؤشرات، مثل ولاية أوريغون الأخضر باتا-1 أو 4 قطع) ومزايا عديدة مقارنة الأسلوب مؤشر واحد. أولاً، Ca2 +-يستخدم صبغة غير حساسة لتحديد هياكل صغيرة للفائدة (فروع الجذعية والاشواك) حيث سيتم تنفيذ Ca2 + تصوير. ثانيا، يتم حساب النسبة بين التغير في الأسفار الأخضر والأحمر (ΔG/R) كتدبير من [Ca2 +]، التي إلى حد كبير حساس للتغيرات في الأسفار الأساس نتيجة لتقلبات في [Ca2 +[017 , 18-وعلاوة على ذلك، يمكن معايرة fluorescence التغييرات من حيث المطلق Ca2 + تركيزات19.
قلق عام عند تشغيل اثنين-فوتون Ca2 + تصوير التجارب في شرائح الحاد هو صحة الخلية والاستقرار لاقتناء الصورة بسبب الليزر عالية الطاقة المستخدمة عادة. بالإضافة إلى ذلك، في Ca2 + تجارب التصوير، هناك قلق حول اضطراب والمبالغة في تقدير كبير من Ca2 + ديناميات سوبسيلولار يرجع ذلك إلى حقيقة أن Ca2 + المؤشرات بمثابة الكثيري خارجية Ca2 + المخازن المؤقتة. وبالتالي، يعتمد اختيار Ca2 + المؤشر وتركيزه على نوع الخلايا العصبية، السعة المتوقعة للقطط، وفيما يتعلق بمسألة تجريبية.
علينا تكييف طريقة اثنين-فوتون Ca2 + تصوير للتحقيق من Ca2 + التقلبات في dendrites جابايرجيك إينتيرنيورونس9،،من1011،،من2021 , 22-في حين أن الجزء الأكبر من أوائل Ca2 + التصوير دراسات أجريت في الخلايا العصبية الرئيسية، إينتيرنيورونس المثبطة عرض مجموعة كبيرة ومتنوعة من Ca2 + الآليات الوظيفية التي تختلف عن تلك الموجودة في الخلايا الهرمية20 , 23 , 24-هذه الآليات إينتيرنيورون على حدة (مثلاً، Ca2 + نفاذية امبا مستقبلات) قد تؤدي أدواراً محددة في تنظيم نشاط الخلية. بينما الجذعية Ca2 + إشارات في إينتيرنيورونس هدفا مغريا لإجراء مزيد من التحقيقات، اثنين-فوتون Ca2 + التصوير في dendrites من هذه الخلايا يطرح تحديات إضافية، من أرق قطره dendrites وعدم وجود الأشواك إلى مرتفعة بوجه خاص Ca2 + ربط قدرات ذاتية. كمصالح لدينا أبحاث تركز على دراسة إينتيرنيورونس هيبوكامبال، البروتوكول التالية، في حين تنطبق على مختلف قطاعات السكان العصبية، تم تكييفها للتعامل مع تلك التحديات.
تم تنفيذ هذا البروتوكول مع مجهر اثنين-فوتون [كنفوكل] تجارية، مزودة بكاشفات الخارجية، غير ديسكانيد اثنين (المواظبة) والكهربائية-البصرية المغير (الانتخابات)، ودوت المسح تباين التدرج (SGC)، ومثبتة على طاولة بصرية. المجهر اقترن بليزر مولتيفوتون Ti:Sapphire وضع تأمين 800 نانومتر (> 3 ث، خ نبضات 140، معدل الرسوب 80 هرتز). تم تجهيز نظام التصوير مع تلاعب الكهربية قياسية، بما في ذلك دائرة التروية مع التحكم في درجة الحرارة، منصة ترجمة مع ميكرومانيبولاتورس اثنين، مكبر للصوت ميكروليكترودي الكمبيوتر التي تسيطر عليها، وجهاز الالتقاط رقمي، وحفز وحدة، واقتناء البيانات والبرمجيات.

<table><tbody><tr><td>Animal Strain: Mouse CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 hydrochloride</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Sodium phosphate monobasic&lt;br/&gt; monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Guanosine (GTP)-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Streptavidin-conjugated Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Patch Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Theta Borosilicate Glass Capillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Imaging Acquisition Software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Temperature Controller TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; MultiClamp 700B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Confocal Translator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; pClamp Data Acquisition Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; A365 Constant Current Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Vibraplane Optical Table</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

تصوير الكالسيوم (Ca2 +) أداة قوية للتحقيق في ديناميات الزمانية المكانية Ca2 + الإشارات داخل الخلايا في الخلايا العصبية dendrites. يمكن أن يحدث من خلال مجموعة متنوعة من آليات داخل الخلية والغشاء Ca2 + تقلبات وتلعب دوراً حاسما في تحريض اللدونة متشابك والتنظيم لاستثارة الجذعية. ومن ثم فالقدرة على تسجيل أنواع مختلفة من Ca2 + إشارات في فروع الجذعية قيماً لمجموعات دراسة كيفية دمج dendrites المعلومات. ظهور مجهرية اثنين-فوتون جعلت هذه الدراسات أسهل بكثير عن طريق حل المشاكل الملازمة للتصوير في الأنسجة الحية، مثل نثر الخفيفة ود. وعلاوة على ذلك، من خلال مجموعة من التقنيات الكهربية التقليدية مع اثنين-فوتون Ca2 + التصوير، فمن الممكن للتحقيق المحلي Ca2 + التقلبات في الخلايا العصبية dendrites جنبا إلى جنب مع تسجيلات النشاط متشابك في سوما. هنا، نحن تصف كيفية استخدام هذا الأسلوب لدراسة ديناميات محلية Ca2 + العابرين (القطط) في dendrites جابايرجيك إينتيرنيورونس المثبطة. الأسلوب يمكن تطبيقها أيضا على دراسة الجذعية Ca2 + إشارات في مختلف أنواع الخلايا العصبية في الدماغ الحادة شرائح.

باستخدام بروتوكول المعروضة هنا، حصلنا على القطط أثارت طريق الحقن الحالية جسدية والتحفيز الكهربائي في dendrites oriens/ألفيس إينتيرنيورونس في منطقة CA1 الحصين. بعد الترقيع خلية، حدد استناداً إلى الشكل والموقف، اكتسبنا لينيسكانس عبر تغصن الدانية في نقاط متعددة في ضوء المسافات من...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

نحن نقدم طريقة الجمع بين تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية واثنين-فوتون التصوير لتسجيل Ca2 + العابرين في dendrites العصبية في الدماغ الحادة شرائح.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  Université Laval. نحن نقدم طريقة الجمع بين تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية واثنين-فوتون التصوير لتسجيل Ca2 + العابرين في dendrites العصبية في الدماغ الحادة شرائح.

Video: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

في فيفو 2 فوتون التصوير الكالسيوم في طبقة 2 / 3 من الفئران

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biology

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

أسلوب التصوير الكالسيوم في تطوير شبكات القشرية

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

التصوير الطولي اثنين من الفوتون من CA1 فرس النهر الأورسيال في الفئران الحية

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Behavior

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

متعددة الفوتون بين الخلايا التصوير الصوديوم جنبا إلى جنب مع بوساطة الأشعة فوق البنفسجية Uncaging البؤري من الغلوتامات في الخلايا العصبية الهرمية CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Calcium Imaging in Neurons

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and neurotransmitter release from synaptic vesicles. Within the cell, calcium concentration is highly dynamic due to the presence of pumps that selectively transport these ions in response to a variety of signals. Calcium imaging takes advantage of intracellular calcium flux to directly visualize calcium signaling in living neurons.This video begins with an overview of the key reagents used for this technique, known as calcium indicator dyes. The discussion includes an introduction to the commonly used dye Fura-2 and some basic principles behind how both ratiometric and non-ratiometric calcium indicators work. Next, a typical calcium imaging experiment is presented, from preparing the cells and dye to capturing and analyzing the fluorescent images. Finally, several experimental applications of calcium imaging are provided, such as the study of neuronal network activity and sensory processing.

Calcium Imaging in Neurons Using Fura-2

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and ...