이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회, 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC 발견 부여)와 사 보이 재단에 의해 지원 되었다. OC에서 NSERC 박사 장학금에 의해 지원 되었다.

모든 실험 동물 보호 위원회 대학교 발 및 동물 관리에 캐나다 위원회의 동물 복지 지침에 따라 수행 했다.
1. 사전 준비 (선택 사항: 1 일을 사전에 준비)
<ol><li>세 가지 유형의 인공 척수 (실제) 솔루션 (일반, 자당 및 복구 솔루션, 1 L 각; 표 1참조)를 준비 합니다. 300 ± 10 mOsm25 솔루션의 osmolality 조정 하 고 실제 자당 근처 빙 점 아래로 냉각 (0-4 ° C). 참고: 낮은 나트륨 절단 솔루션 (실제-자당)를 사용 하 여 급성 조각26의 표면 층에 있는 뉴런의 생존 능력을 유지 도움이 됩니다.</li>
	<li>준비 빨간색 fluorophore (예를 들어, 알 렉 사-594)를 포함 하는 패치 솔루션의 0.75 mL와 녹색 합성 칼슘 표시기 (예를 들어, 오 레 곤 그린 BAPTA-1, 표 1참조). Biocytin 포함 ( 표 1참조)에 기록 된 셀의 임시 게시물 형태학 식별이 필요한 경우 패치 솔루션.</li>
	<li>280 ± 5 mOsm 해결책의 pH를 7.35 ± 0.5 osmolality를 조정 합니다. 항상 솔루션 또는 얼음에 냉장고에서 유지. 참고: 칼슘 표시기의 선택 해야 수 입각 한 동적 범위와 조사 캘리포니아2 + 이벤트의 성격.</li>
	<li>≈ 2 µ m 팁 (3-5 m ω의 저항 피 펫)와 붕 세타-유리 모 세관 (참조 테이블의에서 자극 펫 패치 펫에서 붕 규 산 유리 모 세관 ( 재료의 표참조)를 준비 하는 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여, 재료) 2-5 µ m 팁. 참고: 주어진된 직경 및 모양의 펫을 끌어당기는 설정은 끌어당기는 필 라 멘 트 유형 및 유리의 특정된 유형에 대 한 램프 테스트 결과 따라 결정 됩니다.</li>
</ol>2. hippocampal 슬라이스 준비
<ol><li>Anesthetize 마우스 (P13-20, 스트레인 및 마우스의 성 실험 질문 해결 되 고에 의해 결정 됩니다) isoflurane 흡입 마 취 법 챔버 내의 종이 타월에 배치의 1 mL와 함께. 동물 취 깊이 움직임과 느린 호흡의 부족에 의해 입증으로 때 마 취 법 상공에서 그것을 제거 하 고는 단두대를 사용 하 여 목을 벨.</li>
	<li>코에 두개골의 뒤에서가 위의 작은 쌍으로 피부를 절단 하 여 두개골을 노출 합니다. Bregma 수준에서 구멍을 미니 뼈 rongeurs의 작은 쌍을 사용 합니다. 그런 다음가 위를 사용 하 여 화살 봉합을 따라 꼬리-rostral 컷을 만들기 위해. rongeurs와 뒷면 각 두개골 플랩 리프트 상승 및 바깥쪽 각 반구를 덮고 두개골을 제거 하 파악.</li>
	<li>두뇌 완전히 노출 후 작은 주걱으로 시 신경 약화. 두개골에서 뇌를 제거 하 고 지속적으로 산소, 차가운 실제 자당을 포함 하는 배양 접시에 넣어 (자당 농도 표 1 참조).<ol>
<li>더 오래 된 쥐에서 조직에 필요한 경우는 intracardiac 관류 뇌 추출 전에 차가운 실제 자당의 20 mL 가득 주사기 (25 G) 좋은 품질 슬라이스를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>추출한 동물 두뇌에서 hippocampal 조각을 준비.<ol>
<li>약 2 분에 대 한 뇌 진정 얼음 포장 페 트리 접시에 필터 종이, 필터 종이에 두뇌를 전송 하자. 두 개의 반구를 해 부.</li>
		<li>Vibratome 테이블에 (방향 화관, 횡단, 또는 수평 분할을 얻기 위해 실험 목표에 의해 결정 됩니다) 해 부 반구를 접착제와 차가운 산소 실제 자당 가득 vibratome 트레이에 몰입할. Vibratome 트레이 주위 얼음 배치 또는 vibratome 쿨러를 사용 하 여 300 µ m 약 1 ° C의 온도에서 두꺼운 조각을 확인 합니다.</li>
		<li>37 ° c가 열 산소 실제 복구를 포함 하는 목욕에서 해 마 (반구 당 최대 6 조각)를 포함 하는 조각 축적 무광택 페인트 브러시를 사용 하 여</li>
		<li>적어도 45 분 동안 실제 복구 목욕에서 슬라이스를 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 전체 셀 패치 클램프 기록
<ol><li>목표에서 배치 하는 목욕에서 hippocampal 슬라이스를 설정 (배율: 40 x, 숫자 조리개: 0.8) 레이저 스캔 2 광자 현미경의. 지속적으로 산소 실제 정상에 2.5-3 mL/min의 속도로 30-32 ° C에 온수로 목욕을 perfuse.</li>
	<li>적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 또는 Dodt-SGC 현미경에 사용 하 여 관심의 크기, 모양 및 위치를 사용 하 여 셀을 찾습니다. 참고: 대상된 신경 인구에 따라 유전자 변형 마우스 모델 관심사의 세포를 쉽게 찾으려면 사용할 수 있습니다. 이 경우에,이 단계는 형광 광원의 사용으로 교체하실 수 있습니다.</li>
	<li>(예를 들어, 알 렉 사-594) 빨간 fluorophore를 포함 하는 실제 일반 솔루션에 자극 피 펫을 채우십시오.</li>
	<li>팁의 셀과 같은 지역에 되도록 조각 위에 자극 피 펫 (전기 자극 장치에 연결 된)을 설정 합니다.</li>
	<li>패치 솔루션 패치 피 펫을 채우는 머리 단계에 그것을 연결 후, 설정 조각에는 그것의 팁의 셀 바로 위에.</li>
	<li>3 방향 자 지에 주사기를 맞게 하 고 플라스틱 튜브를 통해 패치 피 펫을 연결. 패치 피펫으로 지속적인 긍정적인 압력 주입 (≈ 0.1 mL) 주사기를 사용 하 여. "가까운" 위치에 있는 자 지를 계속.</li>
	<li>앰프 제어 소프트웨어 모듈을 활성화 하 고 "VC" 버튼을 클릭 하 여 전압 클램프 모드를 전환할. Electrophysiological 신호 수집을 위한 전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어 (예, clampex)를 오픈 하 고 지속적으로 모니터링 하는 데 필요한 사각형 전압 펄스 (5 mV, 10 ms)를 보내 그것을 "막 테스트" 아이콘을 클릭 피 펫 저항 변화입니다.</li>
	<li>오른쪽 상단에 대상된 셀의 될 때까지 패치 피 펫을 낮춥니다. 제작 시 세포 막과 접촉, "열기" 위치로 자 지를 설정 하 여 압력을 제거. 참고: 세포 막과 접촉 감지 때 피 펫 저항에 작은 증가 (≈ 0.2 m ω) 볼은 셀에 작은 들여쓰기는 긍정적인 압력에 의해 발생 하는 고.</li>
	<li>자 지에 적합 해 소프트웨어에서 제공 하는 피 펫 저항 1 GΩ에 도달할 때까지 빈 주사기를 사용 하 여 패치 피 펫에 약간의 부정적인 압력을 적용 됩니다. 데이터 수집 소프트웨어의 ' 막 테스트 ' 창에서 클램프-60 셀 mV.</li>
	<li>부정적인 압력을 적용 하는 셀 열리고 전체 셀 구성 달성 될 때까지 계속 합니다. 이 셀의 검출 (interneuron 유형에 따라 70-500 m ω 1 GΩ)에서 피 펫 저항과 ' 막 테스트 ' 창에 큰 용량 성 과도의 외관에 급격 한 변화를 기반으로 합니다.</li>
</ol>4. 2-광자 캘리포니아2 + 영상
<ol><li>흥분 성의 postsynaptic 응답에 관심이 있으면 추가 GABAA 수용 체 차단 gabazine (10 µ M) 및 GABAB 수용 체 차단 CGP55845 (2 µ M)에서 실제 목욕.</li>
	<li>앰프 제어 소프트웨어 모듈에 "CC" 버튼을 클릭 하 여 패치 구성을 전류 클램프로 설정 하 고 전류를 depolarizing의 체세포 주사에 대 한 응답에서 셀의 발사 패턴 기록 (0.8-1.0 나, 1 s). 지표에 패치 솔루션으로 채워질 셀에 대 한 적어도 30 분을 기다립니다. 참고: 셀의 발사 패턴 및 활성 속성 사용할 수 있습니다 셀의 하위;을 식별 하 예를 들어, 빠른 급상승 셀입니다. 표시기 농도 기록 (문제 해결 참조 표 2 ) 고양이를 시작 하기 전에 보급을 통해 안정화를 위해 중요 하다.</li>
	<li>AP 갖는 고양이<ol>
<li>이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 수집 시작 합니다. 빨간 형광 신호를 사용 하 여 관심사의 모 수석을 찾습니다. 보이는 응답을 보장 하기 위해, AP 역전파의 효율성을 크게 GABAergic 수22거리 거부할 수 있습니다으로 먼저, 근 모 수석 (≤ 50 µ m)를 선택 합니다.</li>
		<li>'직사각형 도구'를 사용 하 여 이미지 수집 소프트웨어에서, 대상된 지역에 확대 하 고 전환 하는 "xt" (라인) 모드. 관심의 수지상 지점에 걸쳐 스캔 위치입니다. 수집 소프트웨어에서 레이저 강도 컨트롤러 2 광자 레이저 phototoxicity을 피하기 위해, 단지 약간 표시 기준 녹색 형광이는 최소한의 전력 레벨에서 설정 합니다.</li>
		<li>전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어 '프로토콜' 창 및 이미지 수집 소프트웨어, 원하는 진폭의 체세포 현재 분사를 포함 하는 원하는 기간의 기록 재판을 만듭니다.<ol>
<li>이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 "시작 기록" 버튼을 클릭 하 고 3-10 회 지속적으로 1-2 미 반복을 위한 형광 이미지 수집을 취득. 단일 검색을 피하기 위해 photodamage 사이 대기 적어도 30 s. 모 수석 따라 여러 지점에서 linescans를 취득 하는 경우 순서 효과 피하기 위해 임의의 순서로 그들을 데리고.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synaptically 갖는 고양이<ol>
<li>빨간 형광 신호를 사용 하 여 관심사의 모 수석을 찾습니다.</li>
		<li>관심 있는 모 수석 위에 조각의 표면에 자극 피 펫을 설정 합니다. 천천히 낮은 자극 피 펫에 운동을 방해 하는 전체 셀 구성 하지 않으려면를 최소화. 위치는 모 수석에서 10-15 µ m에 피 펫입니다.</li>
		<li>Aspiny 모 수석에서 시 냅 스 microdomains의 위치를 시각화 하려면 이미지 수집 소프트웨어에서 전환 하는 'xt' (라인) 모드와 관심의 수지상 지점 따라 라인 위치.</li>
		<li>(의 전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어) '프로토콜' 창에 이미지 수집 소프트웨어, 시험 시작 후 자극 단위는 기록 재판을 만듭니다.</li>
		<li>수집 소프트웨어를 사용 하 여 버튼을 클릭 "시작 기록"를 3-5 번, 1-2 미 반복 수집을 위한 지속적으로 모 수석에 따라 스캔 30 대기 photodamage를 방지 하기 위해 검사 사이 s. 참고: 스캔 길이 갖는 이벤트의 속도 따라 조정 될 수 있다 하지만 photodamage 방지를 최소화 해야 합니다 (문제 해결 참조 표 2 ).</li>
		<li>해결 되 고 특정 질문에 따라 다른 조건 (예를 들면, 자극의 다른 강도/길이, 약리 차단, 등의 도입)에 4.5.5 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>셀 건강 악화의 흔적을 보여줍니다 때 인수를 중지:-45 아래 도발은 mV, 기준선 Ca2 + 레벨, 모 수석 (예를 들어, blebbing, 조각화; 보십시오 표 2 의 형태학 저하의에서 증가 대 한 문제 해결).</li>
		<li>셀의 형태에 예비 정보를 자극 피 펫의 위치 기록을 유지, Z-스택 빨강 채널에 셀의 취득. 수집 소프트웨어를 사용 하 여 'xyz' 모드, 포함 하는 모든 프로세스와 전체 셀을 이미지를 상단 및 낮은 스택 제한을 설정. 1 µ m에서 '스텝 크기'를 설정 하 고 "시작 기록" 버튼을 사용 하 여 스택 수집 시작.</li>
		<li>때 Z-스택 인수 완료, 소프트웨어에서 "최대 투영" 옵션을 사용 하 여 스택의 모든 초점 계획을 입력 해 수집의 품질을 확인 하. 그런 다음, 천천히 조각에서 패치 피펫으로 철회.</li>
		<li>특별 게시 형태 식별에 대 한 슬라이스를 해결 하려면 신속 하 게 무광택 페인트 브러시를 사용 하 여 목욕에서 슬라이스를 제거 하 고 실제 가득 페 트리 접시에 두 개의 필터 논문 사이 장소. 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션으로는 실제를 대체 하 고 밤새 4 ° C 방 또는 냉장고에 있는 요리를 두고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunohistochemistry 포스트 Hoc 기록 된 셀의 형태학 식별
참고: 고정 PFA에서의 1 박 후 조각을 저장할 수 있습니다 나트륨 아 지 드 (0.5%)와 인산 버퍼 (PB)에 최대 1 개월.
<ol><li>Tris 버퍼 염 분 솔루션 (TBS) 트라이 톤 X-100 (0.3%)에 슬라이스를 넣고 4 세척 (5-10 분 마다) 수행.</li>
	<li>TBS-트리톤에는 슬라이스를 넣어 1 시간에 대 한 10% 정상 염소 혈 청 (NGS) 0.3%.</li>
	<li>TBS-트리톤 0.3%는 슬라이스를 넣어 1 %NGS는 Streptavidin 활용 fluorophore (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 546 활용 Streptavidin 1: 200)에 대 한 하룻밤 부 화.</li>
	<li>씻어 4 번 (5-10 분) tbs.</li>
	<li>현미경 슬라이드와 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지에 분할 영역을 탑재 합니다. 완전 한 세포 재건 하려면, Z취득-스택 (단계 크기: 1 µ m) 20 x 목표를 사용 하 여. 알 렉 사-546-활용 된 레이블 이미징, 543 nm 레이저와 515-560 nm 검색 필터를 사용 하 여 설정 합니다.</li>
</ol>6입니다. 고양이의 분석
<ol><li>빨간색과 녹색 채널에서 라인 이미지에 관심 (ROIs) 영역에서 형광 값을 추출 하 고 소음을 줄이기 위해 각 조건에 대해 여러 개의 반복의 값을 평균. 참고: 라인 인수는 모 수석에 따라 수행 될 때 그것은 수지상 microdomains (2-5 µ m)에 해당 하는 수 있습니다, 여러 ROIs에서 데이터를 추출 하 고 따라서 Ca2 + 신호 구획의 연구를 수 있도록.</li>
	<li>각 투자 수익에 대 한 캘리포니아2 + 진폭으로 변화를 표현. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> 참고: 여기 G는 녹색 채널;에서 형광 값 G0 은 녹색 채널에서 기준선 형광 값 사전 자극 기간; R은 빨강 채널18에서 형광 값입니다. 와 2 광자 여기 매우 지역화 된 중요 한 배경 생성 하지 않습니다, 배경 형광의 빼기 필요 하지 않습니다.</li>
</ol>

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<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
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<li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li>
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<li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2%2B+signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li>
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<li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2%2B+signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li>
<li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li>
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<li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+RevNeurosci%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li>
<li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li>
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</ol>

저자는 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 있다.

여기에 나와 있는 메서드는 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 신호 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학의 결합을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 메서드는 두는 로컬 Ca2 + 고도 전기 자극 또는 backpropagating AP 수지상 세그먼트, 및 세포의 체세포 응답에 의해 evoked의 모니터링에 대 한 수 있습니다. 이렇게 하면 수지상 나무의 ?...

뉴런 네트워크 활동의 기여는 주로 수신 시 냅 시스 입력의 동적 특성에 의해 결정 됩니다. 전통적으로, 신경 세포에 시 냅 스 활동을 특성화의 주된 방법 postsynaptic 전류 통로의 축 삭의 전기 자극에 의해 evoked의 체세포 전체 셀 패치 클램프 기록에 의존. 그러나,이 경우1사실 proximally 있는 시 냅 스의 유일한 활동 보고 됩니다. 또한, 시 냅 스 특정 메커니즘을 평가, 녹음 및 특정 위치에 모 수석 신경의 쌍에서 각각의 시 냅 스 및 수지상 통합의 메커니즘을 대상으로 사용 되었습니다. 시 냅 스 생리학의 분야에서 중요 한 돌파구는 광학 및 electrophysiological 기법의 결혼을 통해 달성 되었다. 2 광자 여기 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2PLSM) Ca2 + 이미징 및 optogenetic 도구와 함께 뇌 조각 에서에서 특정 신경 연결에 시 냅 시스 활동의 동적 조직의 엄청난 정보를 계시 할 수 있다 체 외 그리고 vivo에서.
몇 가지 주요 장점 만든 2PLSM 기존의 한 광자 여기 현미경2에서 밖으로 서: (1)의 2 광자 여기 비선형 특성상 형광 초점 볼륨에만 생성 되 고 모든 내보낸된 광자 대표 유용한 신호 (pinhole에 대 한 필요는 없음); (2) 긴 파장, 2PLSM, 사용 침투 분산 조직을 보다 효율적으로; 또한, 흩어져 광자는 2 광자 여기 및 배경 형광; 너무 희석 (3) photodamage 및 phototoxicity 초점 평면으로 제한 됩니다. 따라서, 기존의 confocal 현미경에 비해 2 광자 시스템의 높은 비용에도 불구 하 고는 2PLSM 신경 구조와 기능 두꺼운 살아있는 조직에서의 고해상도 조사 방법의 선택에 남아 있다.
분산 조직에서 2PLSM의 첫 번째 응용 프로그램 구조와 기능 수지상 쪽이3의 이미지를 했다. 캘리포니아2 + 이미지와 함께에서 2PLSM 고립 된 생 화 확 적인 격실으로 그 쪽이 기능을 공개 했다. 두 광자 캘리포니아2 + 곧 이미징 되었다 유용한 도구 그대로 조직5, 개별 시 냅 스의 활동을 보고 많은 신경 종류에 등뼈와 개별 시 냅 스4사이의 일대일 대응 관계입니다, 6,,78. 또한, 2PLSM 기반 Ca2 + 이미징 성공적으로 사용한 단일 칼슘 채널 및 기본 및 시 냅 스 conductances 사이 비선형 상호 작용의 활동을 모니터링 하로 평가 하는 상태 및 활동 의존 하 규칙의 캘리포니아2 + 신경 dendrites5,6,7,8,9,,1011에 신호.
칼슘은 유비 쿼터 스 세포내 두번째 메신저, 그리고 그것의 subcellular spatiotemporal 조직 이온의 레 귤 레이 션을 시 냅 스 강도에 따른 생리 적 반응의 방향을 결정 합니다 채널, 모 수석 등뼈 성장으로 뿐만 아니라 세포 죽음 및 생존 수지상 캘리포니아2 + 고도 여러 통로의 활성화를 통해 발생합니다. 활동 전위 (APs), 모 수석에 backpropagating 전압 개폐 칼슘 채널12 열고 dendrites와 쪽이13에 상대적으로 글로벌 캘리포니아2 + 과도 (고양이)를 생성 합니다. 시 냅 스 전송 postsynaptic 캘리포니아2 +의 활성화와 관련 된-투과 수용 체 (NMDA, 캘리포니아2 +-침투성 AMPA와 kainate),6,,1415고양이 시 냅 스 트리거링. 마지막으로, 특정 조건11,12,,1316에서 모 수석에 supralinear Ca2 + 이벤트를 생성할 수 있습니다.
두 광자 캘리포니아2 + 영상 패치 클램프 electrophysiological 녹음와 함께에서 사용 하 여 합성 캘리포니아2 +-전체 셀 녹음 중 패치 전극을 통해 일반적으로 배달 민감한 형광 표시기 . 캘리포니아2 + 역학의 정량화에 대 한 표준 방법 듀얼 표시기 방법17,18을 기반으로 합니다. 두 fluorophores 잘 분리 된 방출 스펙트럼을 사용 하 여 (예를 들어, 빨간색 캘리포니아2 +의 조합-녹색 Ca2 + 지표, 오 레 곤 그린 BAPTA-1 또는 Fluo-4 등을 구분 하지 않는 염료)에 비해 몇 가지 장점이 고는 단일 표시 방법입니다. 첫째, 캘리포니아2 +-구분 염료는 캘리포니아2 + 이미징 수행할 수 관심 (수지상 지점과 쪽이)의 작은 구조를 찾는 데 사용 됩니다. 둘째, 녹색과 적색 형광 (ΔG/R)에 있는 변화 사이 비율 측정 [캘리포니아2 +], [캘리포니아2 +]017 에서 변동으로 인해 초기 형광의 변화에 크게 민감한은으로 계산 됩니다. , 18. 또한, 형광 변경 절대 캘리포니아2 + 농도19의 점에서 측정 될 수 있다.
급성 조각에서 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 실험을 실행 하는 때 일반적인 관심사 셀 건강 및 일반적으로 사용 하는 높은 레이저 전원 인해 이미지 수집의 안정성 이다. 또한, 캘리포니아2 + 이미징 실험, 거기에서는 섭 동 및 subcellular 캘리포니아2 + 역학의 실질적인 과대평가 대 한 우려 사실은 캘리포니아2 + 지표 역할 높은 모바일 exogenous 캘리포니아2 + 완충기입니다. 따라서, 실험 질문 및 신경 유형, 고양이의 예상된 진폭에 따라 Ca2 + 표시기와 그것의 농도의 선택 합니다.
우리는 캘리포니아2 + 변동 GABAergic 수9,,1011,,2021 의 dendrites의 조사를 위해 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 방법 적응 , 22. 초기 캘리포니아2 + 이미징 연구의 대량 주 신경에서 수행 했다, 금지 수 피라미드 세포20 에 그 고유 기능 캘리포니아2 + 메커니즘의 큰 다양 한 쇼케이스 , 23 , 24. 이러한 interneuron 관련 메커니즘 (예:, 캘리포니아2 + 침투성 AMPA 수용 체) 세포 활동을 조절에 특정 역할을 재생할 수 있습니다. 수지상 캘리포니아2 + 수에서 신호는 추가 조사에 대 한 유혹 대상, 하는 동안 2 광자 캘리포니아2 + 모 수석 세포 이미징 과제가 추가, 모 수석의 더 얇은 직경을 등뼈의 부족에서 특히 높은 생 캘리포니아2 + 바인딩 용량. 우리의 연구 관심 hippocampal 수의 연구에 초점, 다음 프로토콜 다른 신경 인구에 적용 하는 동안 했다 그 문제를 다루는 적응.
이 프로토콜은 상업 confocal 2 광자 현미경, 2 개의 외부, descanned 비 감지기 (NDDs), 전기 광학 변조기 (엄), 및 Dodt 그라데이션 대비 (SGC), 스캔 광학 테이블에 설치는 처형 되었다. 현미경 모드 잠겨 800 Ti:Sapphire multiphoton 레이저와 결합 되었다 (> 3 W, 140 fs 펄스, 80 Hz 반복 속도) nm. 이미징 시스템 온도 제어, 2 개의 micromanipulators와 번역 플랫폼, 컴퓨터 제어 microelectrode 앰프, 디지타이저,는 자극 관류 챔버를 포함 하 여 표준 전기 생리학 장비를 장착 했다 단위, 및 데이터 수집 소프트웨어

<table><tbody><tr><td>Animal Strain: Mouse CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 hydrochloride</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Sodium phosphate monobasic&lt;br/&gt; monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Guanosine (GTP)-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Streptavidin-conjugated Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Patch Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Theta Borosilicate Glass Capillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Imaging Acquisition Software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Temperature Controller TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; MultiClamp 700B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Confocal Translator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; pClamp Data Acquisition Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; A365 Constant Current Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Vibraplane Optical Table</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

칼슘 (캘리포니아2 +) 이미징 신경 모 수석에 세포내 캘리포니아2 + 신호 spatiotemporal 역학 조사 하는 강력한 도구입니다. 캘리포니아2 + 변동 막과 세포내 메커니즘의 다양 한 통해 발생 하 고 시 냅 스가 소성의 유도 및 수지상 흥분의 규칙에 중요 한 역할을 담당할 수 있습니다. 따라서, 수지상 지점에서 서로 다른 유형의 Ca2 + 신호를 기록 하는 기능 모 수석 정보를 통합 하는 방법을 공부 하는 그룹에 대 한 가치가 있다. 두 광자 현미경의 출현이 했다 이러한 연구를 훨씬 쉽게 이미징 산란 등 photodamage 살아있는 조직에 내재 된 문제를 해결 하 여. 또한, 기존의 electrophysiological 기법 2 광자 캘리포니아2 + 이미지의 조합를 통해 수는 로컬 Ca2 + 변동에 녹음과 동시에 신경 모 수석에서 시 냅 스 활동의 조사 소마입니다. 여기, 우리가 GABAergic 금지 수의 dendrites에이 메서드를 사용 하 여 로컬 Ca2 + 과도 (고양이)의 역학을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에서 신경 종류에 신호에 적용할 수 있습니다.

여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 고양이 체세포 현재 분사와 해 마의 CA1 영역에서 oriens/alveus 수의 모 수석에 전기 자극을 갖는 얻은. 여러 점에서 근 모 수석에 걸쳐 linescans 획득 후에 그것의 모양 및 위치에 따라 식별 신경, 패치, 소마 (그림 1A)에서 거리에 주어진. 우리 고양이 소마 증가 (감소 AP 진폭 또는 칼슘 채널 유통, <strong class="xfig"...

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Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K 조회수.  Université Laval. 우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

비디오: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

연구

신경과학

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

생물학

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

행동분석학

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Calcium Imaging in Neurons

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and neurotransmitter release from synaptic vesicles. Within the cell, calcium concentration is highly dynamic due to the presence of pumps that selectively transport these ions in response to a variety of signals. Calcium imaging takes advantage of intracellular calcium flux to directly visualize calcium signaling in living neurons.This video begins with an overview of the key reagents used for this technique, known as calcium indicator dyes. The discussion includes an introduction to the commonly used dye Fura-2 and some basic principles behind how both ratiometric and non-ratiometric calcium indicators work. Next, a typical calcium imaging experiment is presented, from preparing the cells and dye to capturing and analyzing the fluorescent images. Finally, several experimental applications of calcium imaging are provided, such as the study of neuronal network activity and sensory processing.

Calcium Imaging in Neurons Using Fura-2

뉴런의 칼슘 이미징

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and ...