Name: a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum at JoVE.com

وأيد المشروع وصف الأموال من جامعة "العلوم الصحية" خدمات أونيفورميد لجيم. آراء أو التأكيدات الواردة في هذا التقرير هي تلك الخاصة المؤلفين ولا أن يكون تفسيرها كما الرسمية أو التي تعكس آراء وزارة الدفاع، وجامعة "العلوم الصحية" خدمات أونيفورميد أو أي وكالة أخرى تابعة للولايات المتحدة الحكومة.
وجف إجراء جميع التجارب، وتحليل البيانات؛ ججم صممت وأشرفت الدراسة؛ وكتب وجو وجيم الورق.

تم الحصول على عينات مصل الدم تستخدم للتدليل على البروتوكول الموصوفة هنا من macaques الريسوسي التي كانت السياسات الاتحادية ورعايتهم وفقا للدولة المحلية، ومساكن في اقتران للتقييم والاعتماد لرعاية الحيوانات المختبرية الدولية (آآلاك)-المعتمدة مرفق. جميع التجارب على الحيوانات تم استعراضها والموافقة عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية وعينات تم الحصول عليها من خلال أنسجة بروتوكول مشاركة.
1-يوم 1
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات الموضحة أدناه في السلامة الاندفاق الصفحي عقيمة خزانة تستخدم لزراعة الأنسجة في مختبر BSL-2.
<ol><li>ذوبان الجليد عينات المصل في درجة حرارة الغرفة ونقل 100 ميليلتر من كل عينة مصل الدم إلى أنبوب عقيمة. إلغاء تنشيط الحرارة لمدة 30 دقيقة في 56 درجة مئوية في حمام مائي أو ثيرموميكسير قابل لضبط درجة حرارة. جعل تخفيف المسلسل إذ تتراوح بين 1:1 1:1,000 الباردة ربمي-10 (ربمي مع 10% مصل بقرى الجنين) باستخدام عينة المصل.</li>
	<li>نقل 10 ميكروليتر من عينة المصل المخفف متسلسل لكل بئر من صفيحة الخامس-أسفل 96-جيدا العقيمة. وتشمل مجموعتين من مراقبة الآبار، ربمي-10 مع رفبس فقط ودون عينة المصل، وربمي-10 فقط بدون رفبس ودون عينة المصل. قم بإعداد كل عينة المصل وضوابط ربمي-10 في تريبليكاتيس.</li>
	<li>إزالة الضنك-1، رفبس 2 و 3 و 4 من الثلاجة-80 درجة مئوية وذوبان الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية. نقل رفبس المذابة فورا الجليد. الحصول على رفبس ميليلتر 170 تقريبا لكل عينة المصل (10 ميليلتر من الآبار رفبس x 3 لكل تخفيف المصل (1:1، 01:10، 1: 100، 1:1، 000) و 10 ميليلتر من الآبار رفبس x 3 لكل ربمي-10 مع RVP فقط التحكم في الآبار).</li>
	<li>"الماصة؛" 10 ميليلتر من رفبس إلى كل من 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة تتضمن عينة المصل وإلى ربمي-10 مع رفبس (لا مصل) مراقبة الآبار. لا تقم بإضافة رفبس إلى ربمي-10 فقط (لا عينة المصل ولا RVP) الآبار. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 – 10 مرات. إضافة 10 ميليلتر الباردة ربمي-10 بدلاً من رفبس لكل 10-ربمي الباردة فقط (لا عينة المصل ولا RVP) التحكم في الآبار.</li>
	<li>نقل 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة إلى حاضنة واحتضان اللوحة ل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO2. بينما هو حضانة الخامس-أسفل لوحة 96-كذلك، تنظيف السطح للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع الإيثانول 70% وتشغيل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>إزالة قارورة T75 المتلاقية تماما من الخلايا K562 من الحاضنة وخلط الخلايا أيضا استخدام بيبيت عقيمة 5 مل ونقل 5 مل خلايا إلى أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل. ملاحظة: الاحتفاظ في ربمي-10 خلايا K562 وسوبكولتوريد في/mL61 x 10.</li>
	<li>حساب عدد الخلايا عن طريق إزالة 10 ميليلتر الخلايا من أنبوب مخروطي العقيمة 15 مل وتخلط مع 10 ميليلتر تريفان الأزرق. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير لتحديد العدد الإجمالي للخلايا في الأنبوب المخروطية 15 مل.</li>
	<li>الطرد المركزي 15 مل المخروطية مع الخلايا في ز x ~ 1,200 لمدة 10 دقائق، وصب المادة طافية، وريسوسبيند الخلايا في 10 ربمي الحارة بتركيز 80,000 الخلايا/30 ميليلتر من وسائل الإعلام (2.66 × 106 خلايا/mL).</li>
	<li>إزالة 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة من الحاضنة (الخطوة 1، 6) ونقل 30 ميليلتر من الخلايا K562 لكل بئر من 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة، ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 – 10 مرات. نقل 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة إلى حاضنة واحتضان اللوحة عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO2.</li>
	<li>بعد حضانة ح 1، إزالة 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة من حاضنات وأجهزة الطرد المركزي في ز x ~ 1,200 لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي، صب وسائط الإعلام من الآبار عن طريق تحويل اللوحة رأسا إلى حاوية تحتوي على التبييض 10%.</li>
	<li>غسل الخلايا في كل بئر من خلال ريسوسبيندينج لهم في 125 ميليلتر من 10 ربمي الحارة ومزيج دقيق مع ماصة الطرد المركزي اللوحة في x ~ 1,200 ز 5 دقيقة صب وسائط الإعلام عن طريق تحويل اللوحة رأسا إلى حاوية تحتوي على التبييض 10%. كرر هذه الخطوة يغسل مرتين.</li>
	<li>بعد الغسيل، إضافة 100 ميليلتر الحار ربمي-10 لكل مزيج جيدا، صعودا وهبوطاً مع بيبيت، واحتضان لوحة ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO2.</li>
</ol>2-يوم 3
<ol><li>إزالة 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة تحتوي على 100 ميليلتر من الخلايا ووسائل الإعلام/جيدا من الحاضنة ونقلها إلى مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. استخدام الأقنية ماصة، مزيج محتويات كل جيدا ونقل الخلايا ووسائل الإعلام إلى 96 جيدا U-أسفل لوحة أو إلى المسمى قبل 5 مل أنابيب البولي بروبلين.</li>
	<li>أشطف كل بئر في الخامس-أسفل لوحة 96-جيدا مع 100 ميليلتر من 1% بارافورمالدهيد (PFA) في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ونقل إلى الآبار كل منهما في 96 جيدا U-أسفل لوحة أو أنابيب البولي بروبلين المسمى 5 مل من الخطوة 2.1 الاستسلام نهائي تركيز من 0.5% PFA/بئر أو أنبوب. مزيج دقيق باستخدام ماصة الأقنية تغطية اللوحة مع رقائق الألومنيوم والسماح لها الجلوس في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إصلاح الخلايا.</li>
	<li>إعداد cytometer تدفق (انظر الجدول للمواد على سبيل المثال) عن طريق تشغيل أونستاينيد K562 الخلايا في معايرة الجانب ومبعثر إلى الأمام جنبا إلى جنب مع الإعدادات الأسفار. قناة fluorescence الوحيد المطلوب هو FL1، كالتجارة والنقل من الأسفار فقط المنبعثة من الخلايا. اكتساب ~ 30، 000 – 50,000 الخلايا من كل عينة. ملاحظة: يمكن استخدام أي تدفق سيتوميتير قادر على قراءة صف واحد للحصول على البيانات، والخلايا المصابة مع رفبس فقط سوف تنبعث منها الفلورية الخضراء بسبب وجود بروتينات فلورية خضراء، وهناك حاجة إلى لا قناة أخرى من الأسفار.</li>
</ol>3-بيانات التحليل
<ol><li>
تحليل البيانات التي يحصل عليها من شأن cytometer التدفق باستخدام أي برنامج تحليل التدفق الخلوي (انظر الجدول للمواد).
	<ol>
<li>مجموعة البوابة الأولى استناداً إلى منتدى التعاون الأمني-أ (الأمام مبعثر – منطقة) مقابل منتدى التعاون الأمني-ح (المبعثر إلى الأمام – الارتفاع) تضمين الخلايا المفردة واستبعاد السيارات-فلوري doublets من تحليل12. ثم، بوابة الخلايا عن طريق بوابة القميص استناداً إلى التعاون بين بلدان الجنوب-أ (الجانب مبعثر – منطقة) مقابل منتدى التعاون الأمني-أ لاستبعاد أي حطام أوتوفلوريسسينت.</li>
		<li>تحليل SSC-أ مقابل منتدى التعاون الأمني ببوابات الخلايا للتعبير عن التجارة والنقل استناداً إلى مقابل SSC-أ بروتينات فلورية خضراء-ألف. تحديد النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا لتمييع كل من عينات المصل والتحكم بوضع بوابة حول التجارة والنقل + الخلايا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحديد متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + خلايا لكل تمييع عينة المصل ومراقبة الآبار بقسمة إجمالي النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في ثلاث آبار 3.</li>
	<li>حساب إضعاف-تعزيز الإصابة بقسمة متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في عينات مصلية لتمييع كل مقسوماً على متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في ربمي-10 مع رفبس (لا عينة المصل) مراقبة الآبار.</li>
	<li>الرسم البياني إضعاف-تعزيز المحور (ص) مقابل إضعاف المحور (س)، وإجراء تحليل إحصائي استخدام ANOVA تليها اختبار توكي وظيفة مخصصة لمقارنات متعددة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques.">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).</li><li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity,+cross-reactivity,+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection.">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li><li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes.">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).</li><li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562.">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li><li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+K562+cell+line,+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia.">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li><li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever.">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li><li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection.">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li><li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity.">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li><li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans.">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li><li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro.">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li><li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies.">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive,+memory-derived+plasmablasts.">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus.">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

فلافيفيروسيس مثل DENV وزيكف حصة أدلة هامة على التماثل في كلا البروتينات الهيكلية وغير الهيكلية على توليد الأجسام المضادة التي كروسريكت13،14مع بعضها البعض. أظهرت هذه الردود جسم تحسن لتعزيز الإصابة في المختبر مع النمط المصلي المسيطر مغايرة أو أخرى سواء ?...

جسم تعتمد تعزيز (ADE) العدوى هي عملية موجبة جسم جزئيا تحسن الاستجابات الناجمة عن النمط المصلي المسيطر فيروس يعزز الإقبال على النمط المصلي المسيطر آخر للفيروس، مما يؤدي إلى زيادة النسخ المتماثل الفيروسية وفريميا. تم توثيق ADE على نطاق واسع في حالات العدوى بالفيروس (DENV) حمى الضنك التي يكثر فيها اللقاح الرئيسية الأربعة. في مجموعة فرعية مرضى، يرتبط ADE بحمى الضنك النزفية (الدنك). ونحن قد أظهرت مؤخرا أن عدوى فيروس (زيكف) زيكا الناجمين عن مستويات مرتفعة إلى حد كبير من DENV جسم تحسن الاستجابات التي تسبب ADE DENV في المختبر والمرجح أن ساهمت في تعزيز DENV فيريميا في فيفو1 , 2-جسم تعزيز تعتمد فحوصات أداة قيمة لتقييم قدرة الأجسام المضادة تعزيز الثانوي عدوى الفيروسات ذات الصلة وتقدم أفكاراً قيمة في الآلية المرضية للالتهابات مصفر وتبلغ تطوير اللقاحات.
هنا يستخدم تحليل ووصف رفبس DENV جنبا إلى جنب مع خلايا K562 التي عادة غير مسموح به للإصابة. رفبس يتم النسخ المتماثل هيكلياً سليمة غير كفء DENV الفيروسية جزيئات ترميز ريبليكون بروتين sub-الجينوم فلورية خضراء (التجارة والنقل) التي يتم التعبير عنها بعد جولة واحدة من النسخ المتماثل3. على هذا النحو، الخلايا التي تصاب رفبس فلوريسسي الأخضر ويمكن الكشف سهولة استخدام التدفق الخلوي أو الفحص المجهري. رفبس المستخدمة في هذا التحليل تم الحصول عليها من مصادر تجارية. ومع ذلك، يمكن إنشاء مكافحة الفيروسات الأخرى والمستخدمة في التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة. ومن ناحية أخرى، هي خلايا K562 إلى التعبير عن مستقبلات FcγIII لوكيميا خلية خط ربط منطقة Fc من الأجسام المضادة، ويصاب حضور دون تحييد تركيزات من جسم4،5.
فحوصات ADE قد استخدمت على نطاق واسع في الدراسات التحقيق في عوامل الخطر للضنك الشديد وتحديد آليات في المختبر ADE6،،من78. والرزن ADE الموصوفة هنا بسرعة وسهولة استخدامها لتحديد قدرة المصل زيادة الإصابة في المختبر باستخدام رفبس والتدفق الخلوي، بالمقارنة مع فحوصات أخرى تستخدم حاليا، التي تتطلب أما البت في تشكيل اللوحة الوحدات (بفو) في الخلايا فيرو أو تلطيخ جسم من إصابة الخلايا6،،من78،9،10،11، كلاهما مضيعة للوقت والعمل مكثفة.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS in RPMI-10</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>MP biomedicals</td><td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M in RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&amp;times;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x in RPMI-10</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM in RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile V-bottom plates</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Non-sterile U-bottom plates</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>A high throughput alternative to FACS tubes</td></tr><tr><td>5mL, sterile, serological pipette</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL sterile pipette tips</td><td>Denville</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL sterile pipette tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL multichannel pipette</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL multichannel pipette</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% formadehyde</td><td>Tousimis</td><td>&amp;nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>An alternative to a waterbath for heat inactivation</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Flow cytometry analysis software</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II flow cytometer</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum

لقد ثبت تعزيز الإصابة يتوقف جسم تلعب دوراً كبيرا في نشوء المرض حمى الضنك الفيروسية. الاختبارات التقليدية التي تقيس قدرة الأجسام المضادة أو مصل لتعزيز الإصابة في خطوط الخلايا غير مسموح به يعتمد على استخدام إخراج الفيروسية في وسائط الإعلام تليها اللوحة فحوصات لتحديد حجم الإصابة. في الآونة الأخيرة، قد درست هذه فحوصات الإصابة بالفيروسات (DENV) حمى الضنك في خطوط الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي. وقد كلا النهجين هذه القيود التي تحد من استخدام هذه التقنيات على نطاق واسع. وهنا، يمكننا وصف مقايسة بسيطة في المختبر استخدام حمى الضنك فيروس مراسل الفيروسية جسيمات (رفبس) التي تعبر عن البروتينات الفلورية الخضراء والخلايا K562 لفحص الأجسام المضادة تعتمد تعزيز (ADE) الإصابة DENV استخدام مصل الدم التي تم الحصول عليها من ريسوس ماكاكويس 16 أسبوعا بعد الإصابة بفيروس زيكا (زيكف). هذا الأسلوب هو موثوق بها وينطوي على الحد الأدنى من التلاعب بالخلايا ولا تنطوي على استخدام النسخ المتماثل يعيش فيروس المختصة ويمكن أن يؤديها في شكل إنتاجية عالية للحصول على قراءات كمية استخدام التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، هذا التحليل يمكن تكييفها بسهولة لفحص الأجسام المضادة تعتمد تعزيز (ADE) العدوى مصفر الأخرى مثل فيروس الحمى الصفراء (يفف)، فيروس "التهاب الدماغ الخيلي الياباني" (جيف)، فيروس غرب النيل (WNV) التي تتوفر فيها رفبس إلخ. سهولة إعداد التحليل، تحليل البيانات، وتفسير النتائج يجعل قابلية عالية لمعظم المختبرات إعدادات.

الأمصال من 4 الريسوسي macaques تم جمعها 16 أسبوعا بعد الإصابة مع زيكف، واختبار لقدرتها على تعزيز DENV-1، 2 و 3 و 4 من العدوى في الخلايا K562. وكان الحيوانات ذروة فيريميا ~ 1 × 105 نسخ الحمض النووي الريبي زيكف/مل من البلازما يوم 3 بعد الإصابة التي انخفضت إلى المستويات التي كانت فيها ا...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum at JoVE.com

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

يمكننا وصف بروتوكول سهلة وبسيطة لقياس تعزيز جسم تعتمد الإصابة بواسطة Zika المصل النقاهة فيروس حمى الضنك فيروس "مراسل الجسيمات الفيروسية" باستخدام.

قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

8.7K Views.  Uniformed Services University. يمكننا وصف بروتوكول سهلة وبسيطة لقياس تعزيز جسم تعتمد الإصابة بواسطة Zika المصل النقاهة فيروس حمى الضنك فيروس "مراسل الجسيمات الفيروسية" باستخدام.

Video: A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

متعدد التضخيم متحاور على أساس منهاج التشخيصية للكشف عن زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Biochemistry

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و<em&gt; في المختبر</em&gt; وقائية تأثير الانترفيرونات

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

التحديد الكمي لتعزيز تعتمد على جسم مضاد الفيروس Zika في خلايا الإنسان الأولية

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

عزل وتقدير كمية لفيروس زيكا من أجهزة متعددة في الماوس

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

انتشار الفيروس والقياس اللوني القائم على الخلايا

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture plate wells embedded with electrodes. The technology can be used to monitor the consequences of Zika virus (ZIKV) infection and adherent cell replication in real time, as this virus is highly cytopathogenic. It is a straightforward assay that does not require the use of labels or invasive methods and has the benefit of providing real-time data. The kinetics of ZIKV infection are highly dependent on the employed cell line, virus strain, and multiplicity of infection (MOI), which cannot be easily studied with conventional endpoint assays. Furthermore, the CEI assay can also be used for the evaluation and characterization of antiviral compounds, which can also have dynamic inhibitory properties over the course of infection. This methods article gives a detailed explanation of the practical execution of the CEI assay and its potential applications in ZIKV research and antiviral research in general.

Here, we demonstrate the use of cell-based electrical impedance (CEI) as a very easy and straightforward method to study Zika virus infection and replication in human cells in real time. Furthermore, the CEI assay is useful for the evaluation of antiviral compounds.

منصة المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلايا لتقييم مثبطات فيروس زيكا في الوقت الحقيقي

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture ...

An In Vitro Assay for Screening Interferons as Potent Inhibitors of Zika Virus Growth

Source: Contreras, D. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54767">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates an in vitro assay for screening interferons with antiviral activity against the Zika virus, a human pathogen. Within the host cell, the Zika virus undergoes multiplication upon internalization, infecting neighboring cells and creating distinct zones or viral plaques. Type I interferon, acting as an antiviral agent, hinders virus multiplication, thereby preventing the formation of viral plaques in the host cell monolayer.

اختبار في المختبر لفحص الإنترفيرون كمثبطات قوية لنمو فيروس زيكا

1. Screening Cytokine Library against Zika Virus Infection

	Seed naive Vero cells at 1 x 105 cells per well using a 12-well plate. Once the cells are ...

قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video