يتيح هذا البروتوكول تحديد فيروس زيكا وقياسه كميا دون الاعتماد على تأثير الاعتلال الخلوي. ذلك يعتمد على التعرف على الأجسام المضادة لمكون الفيروس. يمكن أن يساعد استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس في تحديد الأنماط المصلية المختلفة للفيروس في المجموعات السكانية المختلطة.
هذه الطريقة لها مزايا على المقايسات الكلاسيكية لتشكيل البلاك. إنه أسرع وممكن للتطبيقات عالية الإنتاجية عند التقديم باستخدام نظام تصوير آلي لعد الخلايا بسرعة. البروتوكول المقترح قابل للتكيف بدرجة كبيرة.
مع التعديلات المناسبة ، يمكن تطبيق البروتوكول المقترح على أنواع مختلفة من الخلايا والأهداف الفيروسية. ابدأ بزراعة خلايا Vero في دورق زراعة خلايا 75 مربعا = سنتيمترا يحتوي على 12 ملليلترا من DMEM مكملا ب 10٪ FBS واثنين مليمول من L-glutamine. ضع القارورة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لإصابة الطبقة الأحادية للخلية ، استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لإزالة وسط النمو من قارورة زراعة الخلية. باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر ، اشطف القارورة بثلاثة ملليلتر من DPBS مرتين. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من DMEM الخالي من المصل و 20 ميكرولترا من لقاح فيروس زيكا في قارورة زراعة الخلايا.
دع القارورة تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع هزاز لطيف لتشجيع امتصاص الفيروس. في نهاية الحضانة ، باستخدام ماصة مصلية من خمسة ملليلتر ، قم بإزالة لقاح الفيروس المخفف وتجاهله بعناية من قارورة ثقافة الخلية. شطف قارورة ثقافة الخلية مرتين مع ثلاثة ملليلتر من DPBS.
ثم أضف 12 ملليلترا من وسائط الصيانة إلى دورق زراعة الخلايا للحفاظ على الخلايا المصابة. احتضان خلايا فيرو المصابة لمدة ثلاثة أيام في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ثلاثة أيام من الحضانة ، استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لحصاد طاف زراعة الخلايا الذي يحتوي على فيروس زيكا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر.
لتحديد كمية الفيروس ، قم بزرع خلايا Vero في لوحات مخصصة والسماح لها بالنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. قم بإعداد ستة أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 1.5 ملليلتر لكل لوحة لإجراء تخفيف تسلسلي بعشرة أضعاف ، بما في ذلك أنبوب إضافي للتحكم السلبي. لإعداد لوحة 24 بئرا ، أضف 450 ميكرولترا من DMEM الخالي من المصل إلى جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الستة.
لإعداد لوحة 96 بئرا ، قم بتوزيع 135 ميكرولترا من DMEM الخالي من المصل على ستة أنابيب إضافية. لإجراء التخفيف التسلسلي لتجربة لوحة 24 بئرا ، أضف 50 ميكرولترا من مخزون فيروس زيكا إلى أنبوب واحد 10 إلى ناقص يحتوي على 450 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. بالنسبة لتجربة الصفيحة المكونة من 96 بئرا ، أضف 15 ميكرولترا من مخزون فيروس زيكا إلى أنبوب واحد من 10 إلى ناقص يحتوي على 135 ميكرولترا من DMEM الخالي من المصل.
دوامة كل أنبوب لخلط الفيروس والوسط تماما ، مما يضمن توزيعا متساويا لجزيئات الفيروس داخل التخفيف. باستخدام طرف ماصة جديد ، أعد تعليق الأنبوب من 10 إلى ناقص واحد وانقل 50 و 15 ميكرولترا من فيروس زيكا المخفف إلى الأنبوب من 10 إلى ناقص اثنين كتخفيف ثان بعشرة أضعاف للألواح المكونة من 24 و 96 بئرا ، على التوالي. قم بإزالة وتجاهل وسط الحالة لكل بئر من اللوحة المناسبة.
شطف كل بئر مع DPBS مرتين لإزالة أي بقايا. بدءا من أعلى تخفيف ، أضف لقاح الفيروس المخفف بشكل متسلسل إلى الآبار ، مع العمل على أقل تخفيف. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، قم بإزالة معلق الفيروس والتخلص منه من الآبار ، بدءا من أدنى تركيز إلى أعلى.
اغسل الخلايا المصابة باستخدام DPBS مرتين لإزالة أي آثار لتعليق الفيروس. تراكب البئر مع DMEM و 1.5٪ كربوكسي ميثيل سلولوز منخفض اللزوجة. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد الحضانة ، قم بإزالة وتجاهل وسط التراكب وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. بالنسبة للوحة 96 بئرا ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة وسط التراكب والتخلص منه ، وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 60 ميكرولترا من PBS لكل بئر. أضف 4٪ بارافورمالدهيد لإصلاح الخلايا واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
بعد 20 دقيقة ، تخلص من بارافورمالدهايد واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، أضف 3 ، 3'ديامينوبنزيدين بيروكسيديز الركيزة واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد 30 دقيقة ، أوقف التفاعل عن طريق غسل الآبار بالماء.
جفف الألواح في الهواء طوال الليل وانتقل إلى تعداد البؤر. احسب البؤر لكل نسخة مكررة من التخفيف المحدد واحسب متوسط عدد البؤر لكل منها. تم إصلاح خلايا فيرو المصابة في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة.
بالنسبة للوحة 2-well ، لوحظ أول ظهور لبؤر الفيروس بعد 48 ساعة من الإصابة ، على الرغم من أن حجم البؤر كان صغيرا جدا بحيث لا يمكن حسابه بدقة. بعد 96 ساعة بعد الإصابة ، لم تكن هناك علامات على انفصال الخلايا. في 60 ساعة بعد الإصابة ، زاد حجم البؤر إلى المستوى الأمثل للعد.
بعد ذلك ، مع تقدم الوقت ، أصبحت البؤر أكبر وبدأت في الاندماج أو التداخل مع بعضها البعض في شدتها ، وتشكيل مجموعات نمت بمرور الوقت. لذلك ، تشكلت البؤر بعد 60 ساعة من اختيار العدوى لتحديد عيار فيروس زيكا في لوحة 24 بئرا. بالنسبة للوحة 96 بئرا ، ظلت الخلايا سليمة بعد 72 ساعة بعد الإصابة.
لوحظ ظهور بؤر الفيروس لأول مرة بعد 24 ساعة من الإصابة. ومع ذلك ، حتى 36 ساعة بعد الإصابة ، كان حجم البؤر صغيرا جدا. تم تحقيق الحجم الأمثل للبؤر في 48 ساعة بعد الإصابة.
في النقاط الزمنية الأخيرة ، لوحظت بؤر متداخلة أو مدمجة ، وزاد عدد البؤر المتداخلة بمرور الوقت. تشكلت البؤر بعد 48 ساعة من اختيار العدوى لتحديد عيار الفيروس من عزلات فيروس زيكا. أضف DPBS برفق أسفل جانب كل بئر وقم بهز الألواح للخلف وللأمام مرة إلى ثلاث مرات لإزالة الحطام الخلوي والوسائط الزائدة.
ستفيد هذه التقنية الباحثين بشكل كبير في أبحاث زيكا ، ويمكن أيضا تكييفها على نطاق واسع لتحديد كمية الفيروسات الأخرى المهمة سريريا ، مما يجعلها أداة قيمة لمراقبة الفيروسات وتشخيصها.
