ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم آثار المناعة الموجودة من قبل ضد فيروس حمى الضنك على عدوى فيروس زيكا، باستخدام مصل المريض البشري الفعلي والخلايا المناعية الأساسية للإنسان. إن استخدام عينات مصل المرضى البشريين الفعلية والخلايا الأولية البشرية يوفر نظرة أعمق على تعزيز الجسم المضاد لفيروس زيكا بواسطة سيرا والأجسام المضادة قبل جهاز المناعة. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على قدرة الأجسام المضادة داخل دم المريض على تعزيز عدوى الفيروس في الخلايا البشرية الأخرى.
من المهم التأكد من أن مستويات العدوى الفيروسية عالية بما يكفي للكشف ولكنها منخفضة بما يكفي لعدم إرهاق الخلايا أو التدخل في تفسير البيانات. تبدأ بذر ثلاث مرات عشر إلى الخلايا الرابعة في 100 ميكرولترات من خلية ثقافة المتوسطة في بئر في العقيمة، أسفل 96-جيدا لوحة. عندما تم مطلي جميع الخلايا، ضع لوحة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ وجعل 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من عينات مصل الدم ذوبان الإنسان في المتوسطة خال من المصل.
تأكد من الحفاظ على تخفيف الأمصال وعامل التخفيف ثابت لجميع الأمصال قبل المناعة قبل إضافة التخفيفات إلى حلول الفيروسات والخلايا. بعد ذلك، ذوبان فيروس زيكا سلالات الأسهم حل في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل نقل الأسهم بسرعة إلى الجليد. إضافة 0.1 تعدد من حجم معادل العدوى من فيروس زيكا إلى aliquots المصل ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة للسماح للأجسام المضادة لفيروس حمى الضنك لتشكيل مجمعات مع فيروس زيكا.
في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في البئر وإضافة 50 ميكرولترات من مجمع المناعة لكل بئر. بعد الحضانة ساعتين، وإزالة المتوسطة وغسل الآبار مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في بئر لإزالة تماما المجمعات المناعية وأي فيرات غير مرتبط. ثم تغذية الخلايا مع 100 ميكرولترات لكل بئر من خلية ثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقرة الجنينية.
ثم ارجع الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة. بعد يومين من العدوى، وغسل الخلايا مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة في بئر قبل إضافة 250 ميكرولترات من العازلة تحلل الخلية مع 10٪ بيتا mercaptoethanol إلى كل بئر. الماصات صعودا وهبوطا خمس مرات على الأقل مع الخدش لتسريع عملية تحلل ونقل الخلايا إلى أنابيب معقم المسمى 1.5 ملليلتر.
إضافة حجم متساو من الإيثانول 70٪ إلى كل أنبوب وماصة حل lysate صعودا وهبوطا أربع إلى خمس مرات. عندما تكون التعليقات الواضحة، قم بنقل كل حل إلى أعمدة تسمى أساس السيليكا في أنبوبين جمع مليلتر للطرد المركزي. تجاهل التدفق من خلال حفظ الأعمدة في نفس أنابيب جمع وإضافة 700 ميكرولترات من غسل العازلة 1 إلى كل عمود للطرد المركزي الثاني.
بعد التخلص من التدفق من خلال، شطف الأعمدة مرتين أكثر مع 500 ميكرولترات من غسل العازلة اثنين في غسل. بعد الغسيل الثاني، قم بنقل الأعمدة إلى أنابيب جمع ميليلتر جديدة للطرد المركزي. إضافة 30 ميكرولترات من 42 درجة مئوية RNase-المياه الخالية إلى مركز كل عمود للطرد المركزي واستعادة الجيش الملكي النيبالي مائل.
بالنسبة للتفاعل الكمي في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة أو تحليل QRTPCR إضافة ميكرولتر واحد من الجينات محددة إلى الأمام وعكس التمهيديات من 10 مخزون micromolar جنبا إلى جنب مع 0.25 ميكرولترات من مزيج النسخ العكسي لكل رد فعل. لاحظ أن القرّاءات التي تتعرف على المواد الوراثية لفيروس زيكا ستكتشف الجينات الفيروسية وتسمح بالتعرف الكمي للعدوى. المقبل، إضافة 12.5 ميكرولترات من SYBR الأخضر ميكس تليها 25 ميكرولترات من المياه إلى كل رد فعل إضافة 15 ميكرولترات من ماجستير ميكس في كل بئر من 96 جيدا QPCR لوحة.
عند استخدام ماجستير ميكس، إضافة 100 نانوغرام من عينة RNA إلى مزيج والميصة ميكس ماجستير في الآبار الفردية من لوحة QRTPCR. لاحظ أنه يجب تشغيل العينات في ثلاث ية على نفس لوحة QRTPCR. ثم قم بتشغيل العينات على جهاز PCR كمي وفقاً للبارامترات الموضحة في الجدول.
النقر على علامة التبويب منحنى الذوبان في برنامج النظام لمراقبة منحنى الذوبان. سوف منحنى تذوب تظهر ذروة واحدة في جميع العينات لجين معين لتأكيد وجود أمبيركون واحد فقط. للحصول على أفضل النتائج، استخدم 0.5 درجة مئوية زيادة في درجة الحرارة بين الخطوات والحد الأدنى من وقت عقد 10 ثوان في بروتوكول منحنى تذوب.
ثم انقر فوق علامة التبويب بيانات القياس الكمي للحصول على دورة كمية لكل عينة وتصدير البيانات إلى جدول بيانات لمزيد من تحليل القياس الكمي. يمكن تصنيف عينات المصل البشري إلى ثلاث مجموعات مختلفة: تأكيد عدوى فيروس حمى الضنك العينات، وأكد الأجسام المضادة لفيروس حمى الضنك العينات، وصحية سيرا مع أي فيروس حمى الضنك تحييد الأجسام المضادة أو RNA. بعد 48 ساعة من العدوى، يوضح تحليل QRTPCR أن معظم السراجة التي تحتوي على فيروس حمى الضنك من نوع المصل من واحد إلى أربعة أجسام مضادة قادرة على تعزيز تكرار فيروس زيكا على مختلف المستويات.
وتوجد أعلى زيادة في تترُض فيروس زيكا في الضامة المعالجة بفيروس حمى الضنك المحتوي على الـ sera الذي يحتوي على نوعين وأربعة أجسام مضادة مقارنة بالنمط المصلي الأول وثلاثة أجسام تظهر تحريضًا أقل نسبيًا لفيروس زيكا. من المهم الحفاظ على بيئة معقمة، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، والحفاظ دائما على عينات مصل الفيروس المذاب والكواشف QPCR على الجليد. ويمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لدراسة تعزيز تعتمد على الأجسام المضادة من الفيروسات الفلافية الأخرى مثل فيروس الحمى الصفراء، وفيروس حمى الضنك، أو فيروس غرب النيل باستخدام لوحة من مصل المرضى.
هذه التقنية ستكون مفيدة للغاية لتنفيذ دراسات تعزيز تعتمد على الأجسام المضادة في المستقبل في حقول arbovirus أو الفيروسات. يجب استخدام مستوى السلامة الحيوية السليم اثنين من معدات الحماية الشخصية في جميع الأوقات وينبغي أن تكون جميع النفايات الفيروسية تطهيرها في 10٪ التبييض لمدة 30 دقيقة قبل التخلص منها.
