يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث علم الأعصاب حول كيفية نقل الركيزة في مجال نقل الإشارات وإزالة النفايات في المساحات خارج الخلية في الدماغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بأخذ العينات والتخصيم للجزيئات الكبيرة خارج الخلية في السائل الخلالي أو ISF للحيوانات المستيقظة التي تتحرك بحرية. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع و إصبع، إزالة الشعر من الجمجمة من الماوس تخدير واستخدام أشرطة الأذن ومشابك الأنف لتأمين إصلاح الحيوان على محول.
تطبيق مرهم على عيون الحيوان ووضع محول على جهاز stereotaxic. استخدام مشرط لجعل شق الجلد على مرجمة وإرفاق الحفر على المتلاعب من الإطار stereotaxic. خفض الحفر حتى يلامس بلطف لامدا وإعادة تنسيق DV من الحفر إلى الصفر.
ثم، نقل الحفر إلى bregma لإعادة تعيين إحداثيات AP وML إلى الصفر. نقل الحفر من bregma إلى الإحداثي العمودي. خفض الحفر إلى الجمجمة وتعيين تنسيق DV إلى الصفر مرة أخرى.
بعد تكرار الإجراء لإجراء ثالث، حفر حفرة دبر بعناية في إحداث الهدف، تليها ثقب الثاني على الجانب contralateral من العظام الجدارية. أدخل برغيًا عظميًا في الحفرة الثانية ووضع قطعة القفل من غطاء أنبوب microcentr microcentuge 1.5 ملليلتر على الجمجمة بحيث تكون ثقوب البور داخل الدائرة. المقبل، ووضع cannula دليل على الذراع أقصر من محول stereotaxic وربط كانولا مع الجوز غطاء.
تعيين الذراع أطول من محول stereotaxic على المشبك القطب وأرفق الذراع على المتلاعب من جهاز stereotaxic. تدوير الجمعية ستيريو DV على ذراع المتلاعب من قبل 12 درجة ونقل قنية دليل إلى حفرة دبر. ثم، ببطء خفض كانولا دليل 1.2 ملليمتر في الدماغ.
إضافة أسمنت الأسنان إلى التاج حتى يتم تغطية الجزء المعدني من قنية الدليل، والمسمار العظمي، وأي جمجمة مكشوفة وتأمينها والسماح للأسمنت بالجفاف. بعد 12 إلى 20 دقيقة، قم بإزالة محول الالكابر من المشبك الكهربائي، وإزالة الجوز الغطاء، واستبدال محول stereotaxic مع مسبار وهمية. ثم، refasten الجوز قبعة، والإفراج عن الماوس من جهاز stereotaxic، ومنزل الماوس وحده في قفص الفردية.
قبل إعداد التحليل المجهري ، املأ حقنة واحدة قابلة للغسيل مع الماء المقطر واستخدم أنبوب viton لتوصيل الحقنة بمأخذ مسبار غسيل الكلى الدقيق. تغطية يدويا ثقوب تنفيس والاكتئاب بلطف المكبس حقنة لبث المسبار بالماء. تأكد من أن الماء يظهر في مدخل المسبار وأن هناك تسرب على سطح غشاء التحليل الدقيق.
لتنشيط المسبار، غمر أغشية المسبار في 70-100٪ الإيثانول لمدة ثانيتين، تليها ضخ الماء المقطر الثاني. إرفاق إبرة اتصال إلى مدخل واحد وخط منفذ واحد وتحميل حقنة ثلاثة ملليلتر المتاح مع عازلة التسريب الطازجة. قم بتوصيل حقنة مجهزة بإبرة حادة النهاية إلى نهاية مدخل الأنبوب واستخدم مضخة حقنة لملء الأنبوب بأكمله بمخزنة النفخ.
عندما يكون الأنبوب ممتلئًا، استبدل إبرة التوصيل بين خطوط المدخل ومنافذ التوصيل بمسبار التحليل الدقيق المنشط وجوز الغطاء وثب أنبوب الأسطوانة في أنبوب المنفذ على مضخة الأسطوانة. بدء ضخ حقنة في 10 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة ومضخة الأسطوانة في 9.5-9.8 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة. الآن وضع طوق حول عنق قنية دليل تخدير زرع الحيوانات وإزالة الجوز غطاء ومسبار وهمية.
أدخل ببطء مسبار غسيل الكلى من خلال cannula دليل وربط الجوز الغطاء. ثم، ضع الماوس في قفص متصل بنظام حر الحركة وربط الماوس مع ذوي الياقات البيضاء. بعد ساعة واحدة على الأقل، وقف متتالية المضخة الدوارة ومضخة حقنة، وإعادة تشغيل المضخات مع مضخة حقنة تعيين إلى 20٪ أسرع من مضخة الأسطوانة ووضع نهاية حرة من أنابيب منفذ على جامع جزء المبرد لجمع الدماغ ISF.
عندما تم الحصول على وحدة التخزين التجريبية المناسبة، إزالة التحقيق ومعالجة الانتعاش الماوس كما أظهرت للتو. بما يتفق مع الملاحظات السابقة، عندما يتم إعطاء 50 بيكروسومين ميكرومولار عن طريق التحليل المجهري العكسي كما هو موضح في الفئران C57B6J مستيقظا، لوحظ زيادة في مستويات تاو الداخلية بين الخلالي مقارنة بمستويات تقاس في الحيوانات تعامل مع التحكم في السيارة. بالإضافة إلى إدارات الأدوية، يمكن الجمع بين التحليل الدقيق مع طرق أخرى في الجسم الحي مثل تسجيل EEG أو optogenetics للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية تأثير نشاط الخلايا العصبية تركيز الركيزة في ISF.
