Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de pesquisa em neurociência sobre como o transporte de substrato de transdução de sinal e uma liberação de resíduos ocorrem nos espaços extracelulares cerebrais. A principal vantagem desta técnica é que permite a amostragem e quantificação de grandes moléculas extracelulares no Fluido Intersticial ou ISF de animais acordados livremente. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, remova o cabelo do crânio de um rato anestesiado e use as barras de ouvido e um grampo no nariz para fixar o animal em um adaptador.
Aplique pomada nos olhos do animal e coloque o adaptador no aparelho estereotaxico. Use um bisturi para fazer uma incisão de pele sagiticamente sobre o crânio e anexar uma broca ao manipulador do quadro estereotaxista. Abaixe a broca até que toque suavemente na lambda e reinicie a coordenada DV da broca a zero.
Em seguida, mova a broca para bregma para redefinição das coordenadas AP e ML para zero. Mova a broca de bregma para a coordenada vertical. Abaixe a broca para o crânio e coloque a coordenada DV para zero novamente.
Depois de repetir o procedimento para uma terceira coordenada, faça um orifício de rebarba cuidadosamente na coordenada do alvo, seguido por um segundo orifício no lado contralateral do osso parietal. Insira um parafuso ósseo no segundo orifício e coloque a peça de bloqueio de uma tampa de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro no crânio para que os orifícios de rebarba estejam dentro do círculo. Em seguida, coloque uma cânula guia no braço mais curto do adaptador estereotaxic e aperte a cânula com uma porca de tampa.
Coloque o braço mais longo do adaptador estereotaxico no grampo de eletrodo e fixe o braço no manipulador do aparelho estereotaxico. Gire o conjunto estereotaxic DV no braço manipulador em 12 graus e mova a cânula guia para o orifício da rebarba. Em seguida, abaixe lentamente a cânula guia 1,2 milímetros no cérebro.
Adicione cimento dental à coroa até que a parte metálica da cânula guia, o parafuso ósseo e qualquer crânio exposto estejam cobertos e protegidos e permitam que o cimento seque. Após 12 a 20 minutos, remova o adaptador estereotaxico do grampo de eletrodo, remova a tampa e substitua o adaptador estereotílico por uma sonda falsa. Em seguida, refasten a tampa, solte o mouse do aparelho estereotaxic, e abriga o mouse sozinho em uma gaiola individual.
Antes de configurar a microdiálise, encha uma seringa descartável de um mililitro com água destilada e use um tubo de viton para conectar a seringa à saída de uma sonda de microdiálise. Cubra manualmente os orifícios de ventilação e pressione suavemente o êmbolo da seringa para infundir a sonda com água. Confirme se a água aparece na entrada da sonda e que há vazamento na superfície da membrana de microdiálise.
Para ativar a sonda, submergir as membranas da sonda em 70-100% etanol por dois segundos, seguido por uma segunda infusão de água destilada. Conecte uma agulha de conexão a uma entrada e uma linha de saída e carregue uma seringa descartável de três mililitros com tampão de perfusão recém-preparado. Conecte uma seringa equipada com uma agulha de ponta cega à extremidade da entrada da tubulação e use uma bomba de seringa para encher todo o tubo com tampão de perfusão.
Quando o tubo estiver cheio, substitua a agulha de conexão entre as linhas de entrada e saída com a sonda de microdiálise ativada e a porca da tampa e monte um tubo de rolo na tubulação de saída em uma bomba de rolo. Inicie a bomba de seringa a 10 microliters por minuto e a bomba do rolo em 9,5-9,8 microliters por minuto. Agora coloque a coleira ao redor do pescoço do animal anestoetizado de cânula implantada e remova a porca da tampa e a sonda falsa.
Insira lentamente a sonda de microdiálise através da cânula guia e aperte a porca da tampa. Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola conectada a um sistema de movimento livre e amarre o mouse com a coleira. Após pelo menos uma hora, pare sequencialmente a bomba de rolo e a bomba de seringa, reiniciando as bombas com a bomba de seringa definida para 20% mais rápida que a bomba de rolo e coloque a extremidade livre da tubulação de saída em um coletor de frações refrigerado para coletar o ISF cerebral.
Quando o volume experimental apropriado tiver sido obtido, remova a sonda e manuseie a recuperação do mouse como apenas demonstrado. Consistente com observações anteriores, quando 50 picrotoxinas micromolar é administrada via microdiálise reversa como demonstrado em camundongos C57B6J acordados, observa-se um aumento nos níveis de tau endógeno intersticicial em comparação com os níveis medidos em animais tratados com controle de veículos. Além das administrações de medicamentos, a microdiálise pode ser combinada com outros métodos in vivo, como gravação de EEG ou optogenética, para responder a perguntas adicionais sobre como a atividade neuronal influencia a concentração de substrato no ISF.
