Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований неврологии о том, как транспортировка субстрата сигнала трансдукции и очистка отходов происходят во внеклеточных пространствах мозга. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет выборки и количественной оценки больших внеклеточных молекул в интерстициальной жидкости или ISF проснулся свободно движущихся животных. После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша, удалить волосы из черепа обезболивающей мыши и использовать ухо баров и зажим носа, чтобы надежно исправить животное на адаптер.
Нанесите мазь на глаза животного и поместите адаптер на стереотаксис. Используйте скальпель, чтобы сделать разрез кожи sagittally над черепом и прикрепить дрель на манипулятор стереотаксиального кадра. Опустите дрель, пока она мягко касается lambda и сбросить DV координаты сверла до нуля.
Затем перемести бур к брегме для сброса координат AP и ML к нулю. Перемести бур от брегмы к вертикальной координате. Опустите сверло к черепу и установите координаты DV до нуля снова.
После повторения процедуры для третьей координаты, сверлить отверстие заусенцев тщательно в целевой координаты, а затем второе отверстие на контралатеральной стороне теменной кости. Вставьте костной винт во второе отверстие и поместите запирая кусок из 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки крышкой на череп так, что заусенцев отверстия находятся в пределах круга. Затем поместите направляющий канюлю на более короткую руку стереотаксисного адаптера и закрепите канюлю гайкой крышки.
Установите длинную руку стереотаксисного адаптера на зажим электрода и прикрепите руку к манипулятору стереотаксианого аппарата. Поверните стереотаксисную сборку DV на руке манипулятора на 12 градусов и переместив направляющий канюлю в отверстие заусенца. Затем медленно опустите направляющий канюлю на 1,2 миллиметра в мозг.
Добавьте зубной цемент в крону до тех пор, пока металлическая часть направляющий канюли, костной винт и любой открытый череп не будут покрыты и защищены и не позволят цементу высохнуть. Через 12-20 минут снимите стереотаксисный адаптер с электродного зажима, удалите гайку крышки и замените стереотаксисный адаптер манекенным зондом. Затем, refasten крышка гайки, отпустите мышь из стереотаксиса аппарата, и дом мыши в одиночку в отдельной клетке.
Перед настройкой микродиализа заполните одноразовый одноми миллилитровый шприц дистиллированной водой и используйте витонную трубку для подключения шприца к выходу зонда микродиализа. Вручную накройте вентиляционные отверстия и аккуратно угнетайте поршень шприца, чтобы наполнить зонд водой. Подтвердите, что вода появляется в входе зонда и что есть утечка на поверхность мембраны микродиализа.
Чтобы активировать зонд, погрузите мембраны зонда в 70-100% этанола в течение двух секунд, а затем второй дистиллированной воды вливания. Прикрепите иглу соединения к одному входу и одной линии розетки и загрузите одноразовый трехми миллилитровый шприц со свежеприготовленным буфером перфузии. Подключите шприц, оснащенный тупой иглой к входу конца трубки и использовать шприц насос для заполнения всей трубки с перфузии буфера.
Когда трубка полна, заменить связь иглы между врезкой и розетки линий с активированным зондом микродиализа и крышка гайки и смонтировать роликовую трубку в розетку трубки на роликовом насосе. Запуск шприц насоса на 10 микролитров в минуту и ролик насос на 9,5-9,8 микролитров в минуту. Теперь поместите воротник на шею обезболивающего направляющий канюли имплантированных животных и удалить крышку гайки и манекен зонда.
Медленно вставьте зонд микродиализа через направляющий канюлю и закрепите гайку крышки. Затем поместите мышь в клетку, подключенную к свободно движущийся системе, и привязать мышь к воротнику. После по крайней мере один час, последовательно остановить ролик насоса и шприц насоса, перезапуск насосов с шприцем насос установлен на 20% быстрее, чем ролик насоса и место свободный конец розетки трубки на рефрижераторной фракции коллектора для сбора мозга ISF.
Когда соответствующий экспериментальный объем был получен, удалите зонд и обрабатывать восстановление мыши, как только что продемонстрировано. В соответствии с предыдущими наблюдениями, когда 50 микромоляных пикротоксинов вводят с помощью обратного микродиализа, как попродемонстрировано в бодрствующим C57B6J мышей, увеличение интерстициальных эндогенных уровней тау наблюдается по сравнению с уровнями, измеренными у животных, обработанных с управлением транспортным средством. В дополнение к лекарственным администрациям, микродиализа может быть объединена с другими методами in vivo, такими как запись ЭЭГ или оптогенетика, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как нейрональная активность влияет на концентрацию субстрата в ISF.
