ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالدراجات الكيميائية الحيوية للكادميوم والزئبق، مثل كيفية تأثير المتغيرات البيئية المختلفة على توافرها البيولوجي للبكتيريا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر بيانات التوافر البيولوجي شبه في الوقت الحقيقي والخلايا القابلة للحياة بغض النظر عن وجود الأكسجين. عموما سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال لأن هناك العديد من الوقت الخطوات الحساسة التي تتطلب عناية دقيقة جدا إلى التفاصيل.
إثبات الإجراء سيكون بن، طالب غراد من مختبري. وللتحضير للمقايسة، استرجع جهاز الاستشعار الحيوي الزئبقي غير القابل للتكون والمكون من مخزون التبريد ناقص 80 درجة مئوية. لوحة الخلايا على لوحات مرق ليسوجيني تحتوي على 120 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين.
تنمو الثقافات لوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بين 4:30 و 5 ص.m. تلقيح ثقافة في عشرة ملليلتر من LB مع الأمبيسيلين وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة.
في ما بين تسعة وعشرة .m. في صباح اليوم التالي جلب الثقافة وكذلك متوسطة النمو التي أعدت سابقا في غرفة اللاهوائية. ثم إضافة ثمانية ملليلتر من متوسطة النمو الطازجة و 210 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسلين في أنبوب بالش العقيمة.
الآن جمع مليلتر اثنين من ثقافة نمت بين عشية وضحاها ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ملليلتر اثنين. بعد الطرد المركزي في 10، 000 RCF لمدة 90 ثانية، وإزالة عظمى و resuspend في مليلتر من متوسط النمو الطازج. ثم إضافة ثقافة resuspended إلى أنبوب بالش التي تحتوي على ثمانية ملليلتر من متوسط النمو الطازجة ampicillin.
باستخدام تقنية معقمة، ضع سدادة مطاطية بعناية على أنبوب البلش قبل إزالته من غرفة اللاهوائية. ثم ضع الأنبوب في حاضنة وتنمو اللاهوائية في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة. بين ثلاثة وخمسة .m.
جلب أنبوب balch مع الثقافة، أنبوب بالش معقمة جديدة، ومتوسطة النمو في غرفة اللاهوائية. إضافة 100 ميكرولترات من الثقافة إلى 10 ملليلتر من متوسطة النمو الطازجة مع الأمبيسلين في أنبوب األش العقيم. باستخدام تقنية معقمة، ضع سدادة مطاطية بعناية على أنبوب البلش.
قم بإزالة الأنبوب من الغرفة اللاهوائية قبل أن ينمو بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. بين تسعة وعشرة .m في اليوم التالي، نقل الثقافة ومتوسطة النمو مرة أخرى إلى غرفة اللاهوائية.
أضيفي مرة أخرى ثمانية ملليلترات من متوسط النمو و ampicillin في أنبوب بالش معقمة. نقل مليلترين من ثقافة نمت بين عشية وضحاها في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ملليلتر اثنين. بعد الطرد المركزي كما كان من قبل، وإزالة عظمى و resuspend الخلايا في مليلتر اثنين من متوسطة النمو الطازجة.
ثم إضافة ثقافة resuspended إلى أنبوب بالش التي تحتوي على متوسط النمو الطازجة و ampicillin. باستخدام تقنية معقمة، ضع سدادة مطاطية بعناية على أنبوب البلش. أخرجه من الغرفة وينمو لاهوائياً عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
مراقبة نمو الثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي من خلال دوامة الثقافة ثم قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر أو OD600. بعد ثلاثة إلى أربعة ساعات من النمو المتوقع، ينبغي أن تصل الثقافة إلى OD600 من 6. الآن جلب الأنبوب في غرفة اللاهوائية ونقل الثقافة إلى اثنين من ملليلتر أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة.
بعد الطرد المركزي كما كان قبل إزالة نازع الخلية و resuspend كل في مليلترين من متوسط التعرض الطازجة. كرر هذه الخطوة الغسيل مرة واحدة لإزالة أي أثر من متوسطة النمو. الآن الجمع بين كلا أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة من ثقافة الخلية في قارورة PTFE PTFE القياسية سبعة ملليلتر للحصول على مخزون biossor للاستخدام في الفحص التعرض.
قبل البدء في التجربة تحقق من رصد اللاهوائية للتأكد من عدم وجود الأكسجين في غرفة اللاهوائية. تصميم لوحة وفقا ل قالب 96 جيدا. لتشغيل التجارب في التكرارات التقنية من ثلاثة وهذا سيسمح ل32 العلاجات المختلفة، والتي هي أفضل ممثلة مع أربعة في ثمانية شبكة لإعداد قوارير.
إعداد أربعة من ثمانية شبكة وفقا لتخطيط لوحة المقايسة. ثم ضع 7 قوارير PTFE المليمترية في الدرج. يجب التعامل مع القنينات فقط عن طريق التلاعب خارج القارورة.
إضافة حجم متوسط التعرض في كل قارورة المقابلة لكل علاج. إلى كل قارورة إضافة حجم المقابلة من متغير الكيميائية ليتم اختبارها وفقا لتخطيط لوحة. الآن إضافة النترات إلى كل قارورة بحيث يكون التركيز 200 ميكرومولار.
استبعاد هذه الخطوة لفراغات المعالجة biosensor التأسيسية. لإضافة الزئبق إلى القنينات، أولاً خذ مخزون الأربعة إلى ثمانية ميكرومولر واهتز جيداً. تخفيف الحل ومتوسطة التعرض في قارورة PTFE 7 ملليلتر إلى تركيز من 100 إلى 250 نانومولار لصنع محلول الزئبق العامل.
من هذا الحل العامل، إضافة الزئبق إلى قوارير المطلوبة وفقا لتخطيط لوحة. بعد إضافة الزئبق أو الكادميوم يهز لوحة يدويا في حركة مدارية. ويمكن إيقاف التجربة الآن اعتماداً على الوقت اللازم للزئبق أو الكادميوم لكي يُترك في محلول.
عندما يتم استئناف التجربة، الماصات بلطف biosensor الأسهم ذهابا وإيابا لضمان التجانس. ثم إضافة 100 ميكرولتررس من مخزون biosensor إلى كل قارورة وتهز لوحة يدويا كما كان من قبل. الاحماء قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية واقامة تشغيل الحركية لمدة عشر ساعات مع يقرأ كل نقطتين خمس إلى خمس دقائق.
اهتزاز مداري بين القراءات. إعداد المدى لاتخاذ قياسات الفلورانس مع استثارة الفلوريسنس من 440 نانومتر وانبعاث 500 نانومتر. الآن ماص 200 ميكرولترات من كل قارورة PTFE في أربعة من قبل ثمانية شبكة في الآبار المقابلة من لوحة 96 بئر.
الماصات ذهابا وإيابا خمس مرات قبل نقل كل 200 ميكرولترات. بدلاً من تجاهل طرف الماصات، اترك طرف الماصات في قارورة PTFE لتتبع التقدم في الأنابيب. ضع لوحة 96 في علبة قارئ اللوحة.
ثم وضع الغطاء على لوحة 96 جيدا وتبدأ في الفحص. فيما يلي نتائج تمثيلية تظهر بيانات الفلورسنسي المصححة كدالة للوقت. ويظهر الفلور مع تركيزات متزايدة من الزئبق على جهاز الاستشعار الحيوي غير القابل للتكون.
جميع القيم فارغة إلى عدم وجود عنصر تحكم الزئبق. ويمكن تحديد قمم الفلورسنت كمياً لإظهار الإشارة الفلورية كدالة لتركيز الزئبق أو الكادميوم. وبالنسبة لكل من أجهزة الاستشعار البيولوجية غير القابلة للانكات، ينبغي استخدام تركيز الزئبق أو الكادميوم في وسط نطاق أجهزة الاستشعار غير القابلة للحساسية الخطية لاختبار المتغيرات.
وفيما يلي أمثلة على نتيجة غير حاسمة مع الزنك. ونتيجة حاسمة مع المغنيسيوم والمنغنيز على التوافر البيولوجي الزئبق إلى جهاز استشعار الحيوية. النتيجة مع الزنك غير حاسمة لأن الفلورية التأسيسية تتحلل مع fluorescence غير قابل للانحلال مما يدل على سمية.
أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر إدخال تركيزات الكادميوم أو الزئبق حيث سيتم استخدامها لمعايرة جهاز الحساسية البيولوجية. وبعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل النمذجة الحرارية للأنظمة المائية للإجابة على أسئلة إضافية مثل كيف تؤثر أنواع كيميائية معينة من الزئبق أو الكادميوم على توافرها البيولوجي. لا تنس أن العمل مع الكادميوم والزئبق والأحماض القوية مثل حمض الكبريتيك يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
بعد تطورها مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة البيئية لاستكشاف الزئبق اللاهوائي شبه الوقت الحقيقي أو التوافر البيولوجي للكادميوم والميكروبات القابلة للتمالك وراثيا.
