Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el ciclo biogeoquímico del cadmio y el mercurio, como cómo las diferentes variables ambientales afectan su biodisponibilidad a las bacterias. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece datos de biodisponibilidad casi en tiempo real y células viables independientemente de la presencia de oxígeno. Generalmente los individuos nuevos en este método tendrán problemas porque hay muchos pasos sensibles al tiempo que requieren una atención muy meticulosa al detalle.
Demostrando el procedimiento estará Ben, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para prepararse para el ensayo, recupere el biosensor inducible de mercurio y el biosensor expresado constitutivamente de un crio de menos 80 grados Celsius. Ina las células en placas de caldo de Lysogeny que contengan 120 microgramos por mililitro de ampicilina.
Cultivar los cultivos de placas en una incubadora a 37 grados Centígrados durante la noche. Entre las 4:30 y las 5 p.m. inocular un cultivo en diez mililitros de LB con ampicilina y crecer durante la noche a 37 grados centígrados con temblores a 220 rpm.
Entre las nueve y diez .m a la mañana siguiente trae la cultura, así como el medio de crecimiento previamente preparado a la cámara anaeróbica. A continuación, añadir ocho mililitros de medio de crecimiento fresco y 210 microgramos por mililitro de ampicilina en un tubo de balch estéril.
Ahora recoger dos mililitros de la cultura cultivada durante la noche y transferir en un tubo de micro centrífuga de dos mililitros. Después de centrifugar a 10.000 RCF durante 90 segundos, retire el sobrenadante y resuspend en dos mililitros de medio de crecimiento fresco. A continuación, agregue el cultivo resuspendido al tubo de la bala que contiene ocho mililitros de medio de crecimiento fresco y ampicilina.
Con una técnica estéril, coloque cuidadosamente un tapón de goma en el tubo de la bala antes de retirarlo de la cámara anaeróbica. A continuación, coloque el tubo en una incubadora y crezca anaeróbicamente a 37 grados centígrados con temblores a 220 rpm. Entre las tres y las cinco de la .m.
llevar el tubo de la bala con el cultivo, un nuevo tubo de balch estéril, y el medio de crecimiento en la cámara anaeróbica. Añadir 100 microlitros del cultivo a 10 mililitros de medio de crecimiento fresco con ampicilina en el tubo de alfarradora estéril. Usando una técnica estéril, coloque cuidadosamente un tapón de goma en el tubo de la bala.
Retire el tubo de la cámara anaeróbica antes de cultivarlo durante la noche a 37 grados Celsius con agitación a 220 rpm. Entre las nueve y diez a.m. al día siguiente, transferir la cultura y el medio de crecimiento de nuevo a la cámara anaeróbica.
Añadir de nuevo ocho mililitros de medio de crecimiento y ampicilina en un tubo de bala estéril. Transfiera dos mililitros del cultivo cultivado durante la noche a un tubo de micro centrífuga de dos mililitros. Después de la centrifugación como antes, retire el sobrenadante y resusppend las células en dos mililitros de medio de crecimiento fresco.
A continuación, agregue el cultivo resuspendido al tubo de la bala que contiene el medio de crecimiento fresco y la ampicilina. Usando una técnica estéril, coloque cuidadosamente un tapón de goma en el tubo de la bala. Retirarlo de la cámara y crecer anaeróbicamente a 37 grados Celsius con agitación a 220 rpm.
Monitorear el crecimiento del cultivo utilizando un espectrofotómetro mediante el vórtice del cultivo y luego medir la densidad óptica en 600 nanómetros o OD600. Después de tres a cuatro horas de crecimiento esperado, la cultura debe alcanzar un OD600 de 6. Ahora traiga el tubo en la cámara anaeróbica y transfiera el cultivo en dos tubos de micro centrífuga de dos mililitros.
Después de la centrifugación como antes, retire el sobrenadante y resusppend cada paladar celular en dos mililitros de medio de exposición fresco. Repita este paso de lavado una vez para eliminar cualquier rastro del medio de crecimiento. Ahora combine ambos tubos de micro centrífuga de cultivo celular en un vial estándar de PTFE de siete mililitros para obtener el stock de biosensores para su uso en el ensayo de exposición.
Antes de comenzar el experimento, compruebe el monitor anaeróbico para asegurarse de que no hay oxígeno en la cámara anaeróbica. Diseñe el diseño de la placa de acuerdo con una plantilla de 96 pozos. Para ejecutar experimentos en réplicas técnicas de tres esto permitirá 32 tratamientos diferentes, que se representa mejor con una cuadrícula de cuatro por ocho para configurar los viales.
Configure la cuadrícula de cuatro por ocho de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo. A continuación, coloque los viales estándar de PTFE de siete mililitros en la bandeja. Los viales solo deben manipularse manipulando el exterior del vial.
Añadir el volumen medio de exposición en cada vial correspondiente a cada tratamiento. A cada vial añadir el volumen correspondiente de la variable química a probar de acuerdo con el diseño de la placa. Ahora agregue nitrato a cada vial para que la concentración sea de 200 micromolares.
Excluya este paso para los espacios en blanco de tratamiento de biosensores constitutivos. Para añadir mercurio a los viales, primero tome el material de cuatro a ocho micromolares y agite bien. Diluir la solución y el medio de exposición en un vial de PTFE de siete mililitros a una concentración de 100 a 250 nanomolares para hacer una solución de mercurio en funcionamiento.
A partir de esta solución de trabajo, agregue mercurio a los viales necesarios de acuerdo con la disposición de la placa. Después de añadir el mercurio o el cadmio, agite manualmente la placa en un movimiento orbital. El experimento puede estar en pausa ahora dependiendo del tiempo necesario para que el mercurio o el cadmio se especifiquen en solución.
Cuando se reanude el experimento, pipetee suavemente el stock de biosensores de ida y vuelta para garantizar la homogeneidad. A continuación, añada 100 microlitros del stock de biosensores a cada vial y agite manualmente la placa como antes. Calienta el lector de placas a 37 grados centígrados y configura una carrera cinética durante diez horas con lecturas cada dos puntos cinco a cinco minutos.
Un temblor orbital entre lecturas. Configure la carrera para tomar mediciones de fluorescencia con una excitación de fluorescencia de 440 nanómetros y una emisión de 500 nanómetros. Ahora pipeta 200 microlitros de cada vial de PTFE en la rejilla de cuatro por ocho en los pozos correspondientes de la placa de 96 pozos.
Pipetear de ida y vuelta cinco veces antes de transferir cada 200 microlitros. En lugar de desechar la punta de la pipeta, deje la punta de la pipeta en el vial de PTFE para realizar un seguimiento del progreso del pipeteo. Coloque la placa de 96 pozos en la bandeja del lector de placas.
A continuación, coloque la tapa en la placa de 96 pozos y comience el ensayo. Aquí hay resultados representativos que muestran los datos de fluorescencia corregidos en función del tiempo. La fluorescencia se muestra con concentraciones crecientes de mercurio al biosensor inducible.
Todos los valores están en blanco para el control sin mercurio. Los picos fluorescentes se pueden cuantificar para mostrar la señal fluorescente en función de la concentración de mercurio o cadmio. Tanto para los biosensores inducibles como para los constitutivos, la concentración de mercurio o cadmio en el centro del rango lineal de los sensores inducibles debe utilizarse para probar variables.
Estos son ejemplos de un resultado no concluyente con zinc. Y un resultado concluyente con magnesio y manganeso sobre la biodisponibilidad de mercurio para el biosensor. El resultado con zinc no es concluyente porque la fluorescencia constitutiva se descompone con fluorescencia inducible que indica toxicidad.
Al intentar este procedimiento es importante recordar entrar en las concentraciones de cadmio o mercurio, ya que estos se utilizarán para calibrar el biosensor. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el modelado termodinámico de sistemas acuosos para responder a preguntas adicionales como cómo afectan a su biodisponibilidad especies químicas específicas de mercurio o cadmio. No olvide que trabajar con cadmio y mercurio y ácidos fuertes como el ácido sulfúrico puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipos de protección personal durante la realización de este procedimiento.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología ambiental exploraran mercurio anaeróbico casi en tiempo real o biodisponibilidad de cadmio y microbios genéticamente tratables.
