يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تكوين وتنظيم ديناميكي لمجمعات البروتين الضوئي في غشاء ثيلاكويد النبات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل التفاعلات الوظيفية بين مجمعات البروتين الأصلي وتُبين اللدونة في تنظيم البروتين المعقد في ظروف بيئية مختلفة. اقامة هلام كاستر ثمانية سنتيمترات من 10 لوحات سنتيمتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام 0.75 ملليمتر الفواصل.
ضع خلاطًا متدرجًا على لوحة مقلة واربطه بالمضخة ال peristaltic بواسطة الأنابيب. نعلق إبرة حقنة على الطرف الآخر من الأنابيب ووضع الإبرة بين لوحة الزجاج والألومنيوم. وضع ستيرر مغناطيسي في الغرفة الثقيلة.
إعداد 3.5٪ و 12.5٪ من محلول الأكريلاميد في أنابيب أجهزة الطرد المركزي المخروطية 15 ملليلتر كما هو مفصل في بروتوكول النص لاستخدامها في التدرج هلام الفصل. لمنع البلمرة في وقت غير مناسب إبقاء أنابيب الطرد المركزي على الجليد أثناء إعداد الحلول. إضافة 5٪ APS و TEMED الحق قبل pippetting الحلول لخلاط التدرج.
Pipette حلول 12.5٪ للغرفة الثقيلة. إزالة فقاعات الهواء من القناة التي تربط غرفة الضوء والثقيلة عن طريق فتح صمام يربط بين الغرفتين مما يسمح للحل للدخول إلى غرفة الضوء. إغلاق صمام وماصة آثار الحل مرة أخرى إلى الغرفة الثقيلة.
وأخيرا ، ماصة 3.5 ٪ حل لغرفة الضوء. قم بتشغيل المُحرك المغناطيسي. افتح الصمامات، واشغل المضخة الرادلية.
السماح لحلول هلام للتدفق بين لوحة الزجاج والألومنيوم بمعدل تدفق حوالي 0.5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. يجب أن تكون الإبرة فوق السائل في جميع الأوقات. عندما الغرف الثقيلة والخفيفة قد افرغت لهم بالماء فائقة الخطورة.
والسماح للماء لتراكب بلطف سطح هلام. هلام البلمرة يستغرق حوالي ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. إعداد محلول الأكريلاميد 3٪لـ هلام التراص في درجة حرارة الغرفة.
الماصات هلام التراص على رأس هلام الفصل البلمرة ووضع مشط هلام عينة بين الزجاج والألمنيوم لوحة تجنب فقاعات الهواء. بعد السماح للجل البلمرة لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة المشط بلطف تحت الماء فائقة الpure. عند هذه النقطة يمكن تخزين الجل في أربع درجات مئوية إيجابية في ظروف رطبة لبضعة أيام.
تمييع thylakoids المعزولة مع الجليد الباردة 25BTH20G العازلة إلى تركيز الكلورو النهائي من ملليغرام واحد لكل ملليلتر. إعداد أنبوبين لكل عينة thylakoid لتنفيذ كل من بيتا DM وslakonin سولوبيلسيس. الآن إضافة حجم متساو من العازلة المنظفات.
اخلطي عينة المنظفات والثيلاكويد بلطف مع ماصة وتجنبي صنع فقاعات الهواء. Solubilize thylakoids لمدة دقيقتين على الجليد ل solubilization بيتا DM. أو 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف مستمر على الروك أو شاكر ل سولوبيلين digitonin.
بعد الحضانة، وإزالة المواد غير الذوبان عن طريق الطرد المركزي في 18، 000 غرام لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية إيجابية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر وإضافة 1/10 حجم من Coomassie الأزرق الرائعة العازلة إلى العينة. إعداد الجل في نظام كهرباء عمودي.
تعبئة غرفة العازلة العلوية مع المخزن المؤقت الكاثود الأزرق وصب المخزن المؤقت أنود إلى غرفة المخزن المؤقت السفلي. قم بتحميل عينات الـ thylakoid في الآبار. بدء electrophoresis وزيادة تدريجيا الجهد كما هو مدرج في بروتوكول النص.
تشغيل الجل في إيجابية أربع درجات مئوية إما باستخدام غرفة باردة أو ضبط درجة حرارة هلام مع نظام التبريد. تغيير المخزن المؤقت الكاثود الأزرق إلى مخزن مؤقت الكاثود واضحة عندما تم ترحيل الجبهة عينة حوالي 1/3 من هلام. بعد تشغيل electrophoretic مسح هلام مع ماسح ضوئي للصور الفوتوغرافية لأرشفة الصور.
لتنفيذ 2-SDS PAGE تجميع نظام الكهرباء العمودي باستخدام الفواصل ملليمتر واحد. إعداد هلام SDS القياسية مع مشط 2-D كما هو موضح في بروتوكول النص. قطع حارة من هلام BN ووضعها في أنبوب خمسة ملليلتر.
ثم إضافة ملليلترين من العازل Laemmli واحتضان الشريط لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. وضع حارة مع مساعدة من الفضاء على رأس هلام تجنب فقاعات الهواء. Pipette خمسة ميكروليترس من علامة الوزن الجزيئي على قطعة ضيقة من ورقة مرشح ووضع ورقة في البئر القياسية.
لختم شريط هلام BN وورق العلامة صب 0.5٪ agarose في تشغيل العازلة على رأس قطاع هلام والسماح لها لترسيخ. إجراء الكهرباء وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد تشغيل الكهربائية تخيل البروتينات مع وصمة عار SUPRO روبي أو تلطيخ الفضة.
تظهر هنا نتائج تمثيلية للأنماط المعقدة للبروتين الهلايكويد من بيتا DM وعينات التكّن-solubilized. تهاجر المجمعات الصغيرة بشكل أسرع أثناء تشغيل الكهرباء وبالتالي فهي في الجزء السفلي من الجل. في حين أن المجمعات الكبيرة في الجزء العلوي من الجل.
يحافظ Digitonin بشكل عام على مجمعات البروتين في التجمعات الأكبر ، بينما يتداخل بيتا DM مع تفاعلات البروتين البروتينية بين المجمعات. يتم تقديم تكوين الوحدة الفرعية لمجمعات البروتين من بيتا-DM و thylakoids الـ digitonin-solubilized هنا. تم العثور على الوحدات الفرعية لكل مجمع من الخط العمودي أسفل المجمع المحاذ.
من حيث المبدأ، كل بقعة في هلام 2-D يمثل بروتين فردي. ولكن في الممارسة العملية، قد تكون هناك عدة بروتينات من نفس الكتلة الجزيئية موجودة في بقعة واحدة. ويستند تحديد البقع على تحليل قياس الطيف الكتلي.
بعد تطبيق هذا الإجراء يمكن للمرء أن يستمر مع أساليب أخرى مثل المجهر الإلكتروني وتحليل الجسيمات واحد من مجمعات البروتين مائل من هلام الأصلي الأزرق من أجل الحصول على رؤى هيكلية في مجمعات البروتين. لتحديد غير معروف وحدات البروتين يمكن تحليلها مع المواصفات الكتلة بقع البروتين الفردية من ثنائي الأبعاد SDS PAGE. لا تنس أن العمل مع الأكريلاميد والتكسينين يمكن أن تكون ضارة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء قفازات واقية دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
