蓝色本机凝胶电泳法分析囊体膜蛋白配合物

该方法有助于回答有关植物胸腺膜中光合作用蛋白复合物的组成和动态组织等关键问题。该技术的主要优点是，它允许分析原生蛋白质复合物之间的功能相互作用，并阐明蛋白质复合物在不同环境条件下的可塑性。使用 0.75 毫米垫片根据制造商的说明，将凝胶脚轮 8 厘米由 10 厘米板设置。

将梯度搅拌器放在搅拌板上，然后用管道将其与近侧泵连接。将注射器针连接到管子的另一端，将针头放在玻璃板和铝板之间。将磁力搅拌器放在重室中。

在15毫升锥形离心管中准备3.5%和12.5%丙烯酰胺溶液，详见文本协议，用于分离凝胶梯度。为了防止不合时宜的聚合，在准备溶液时将离心管放在冰上。在将溶液点到梯度混合器之前，请添加 5%的 APS 和 TEMED。

将 12.5% 的溶液移位到重室。通过打开连接两个腔室的阀门，使溶液进入轻室，清除连接轻室和重室的通道上的气泡。关闭阀门，将溶液的痕迹移液回重室。

最后，将 3.5% 溶液移液到光室。打开磁力搅拌器。打开阀门，然后打开近位泵。

允许凝胶溶液以每分钟约 0.5 毫升的流速在玻璃板和铝板之间流动。针头必须一直高于液体。当重而轻的腔室清空时，用超纯水填充它们。

让水轻轻地覆盖凝胶表面。凝胶聚合在室温下大约需要一到两个小时。在室温下为堆叠凝胶准备 3%丙烯酰胺溶液。

将堆叠凝胶移液到聚合分离凝胶顶部，并在玻璃和铝板之间放置样品凝胶梳，避免气泡。在室温下让凝胶聚合 30 至 60 分钟后，在超纯水中轻轻取下梳子。此时，凝胶可以在潮湿的条件下储存在正摄氏四度下几天。

用冰冷的25BTH20G缓冲液稀释分离的胸腺素，使最终叶绿素浓度为每毫升1毫克。为每个胸腺激素样品准备两个管子，以执行β-DM和数字素溶解。现在添加等量的洗涤剂缓冲液。

将洗涤剂和胸腺样品轻轻与移液器混合，避免产生气泡。在冰上溶解胸腺体两分钟，进行β-DM溶解。或在室温下 10 分钟，在摇杆或摇床上连续温和混合，进行数字溶解。

孵育后，在正4摄氏度下，在18000克的离心中去除不溶解物质，20分钟。将上流液转移到新的 1.5 毫升管中，并将 1/10 体积的 Coomassie 明亮蓝色缓冲液添加到样品中。在垂直电泳系统中设置凝胶。

用蓝色阴极缓冲器填充上部缓冲室，将阳极缓冲液倒至下缓冲室。将胸腺样品装入井中。启动电泳并逐渐增加文本协议中列出的电压。

使用冷室或使用冷却系统调整凝胶温度，以正 4 摄氏度运行凝胶。当样品前部迁移约 1/3 的凝胶时，将蓝色阴极缓冲液更改为透明阴极缓冲液。电泳运行后，使用照片扫描仪扫描凝胶以进行图像存档。

要执行 2-SDS PAGE，请使用 1 毫米分空间器组装垂直电泳系统。使用文本协议中描述的二-D梳子准备标准 SDS 凝胶。从 BN 凝胶切割车道，并放在五毫升管中。

然后加入两毫升的莱姆利缓冲液，在室温下轻轻摇晃，孵育带45分钟。在凝胶顶部的垫片的帮助下，将车道放置，避免气泡。在一块窄的滤纸上移出分子量标记的五微升，将纸张放在标准井中。

要密封 BN 凝胶条，标记纸将 0.5% 的 agarose 倒在凝胶条顶部的运行缓冲液中，并允许其凝固。根据标准协议执行电泳。电泳运行后，用SUPRO红宝石染色或银染色来可视化蛋白质。

此处显示了β-DM和数字蛋白溶解样品的胸腺蛋白复杂模式的代表性结果。小复合物在电泳运行过程中迁移速度更快，因此在凝胶的下部。而大型复合物位于凝胶的上部。

Digitonin 通常保留了较大组件中的蛋白质复合物，而 beta DM 会干扰复合物之间的实验室蛋白-蛋白质相互作用。这里介绍了β-DM和数字蛋白溶解性胸腺体蛋白复合物的亚单位组成。每个复合物的子单元从对齐的复合物下方的垂直线找到。

原则上，二-D凝胶的每个点代表单个蛋白质。但在实践中，一个点中可能存在一些相同分子质量的蛋白质。点的识别基于质谱分析。

应用此程序后，可以继续进行其他方法，如电子显微镜和从蓝色原生凝胶中分出的蛋白质复合物的单粒子分析，以便获得对蛋白质复合物的结构洞察。为了识别未知蛋白质亚单位，可以通过质的规格分析二维SDS PAGE中的单个蛋白质点。不要忘记，使用丙烯酰胺和数字素可能极其有害，执行此程序时应始终采取预防措施，如戴上防护手套。