تعد الجينات المفرطة في الخلايا طريقة مهمة لدراسة وظيفة الجينات. يسمح التنا نقل مستقر مع الفيروس الرجعي بدمج الجينات الذاتية في الجينوم المضيف والتعبير عنه بشكل مستمر. التقطنا مستعمرات واحدة من عدوى الفيروسات الرجعية وولّدنا خطوط خلايا مستقرة تفرط في التعبير عن DR3 الموسومة بالعلم.
وعوضت خطوط الخلية لعدم توافر الأجسام المضادة DR3 جيدة وقدمت أدوات ممتازة لوظيفة DR3 وظيفة في المختبر وفي الجسم الحي. نحن ولدت خطوط الخلايا فرط التعبير DR3 عن طريق التقاط مستعمرة واحدة من العدوى الفيروسية. خطوط الخلية من مستعمرة واحدة يمكن أن تحافظ على التجانس والنقاء.
بالإضافة إلى ذلك، فإن البروتوكول سهل وبسيط في التعامل معه. لبدء هذا الإجراء، تنمو خلايا بلات-A بين عشية وضحاها في أطباق 60 ملليمتر مع أربعة ملليلتر من DMEM. عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ التقاء، واستخدام كاشف transfection نقل لهم مع اثنين من ميكروغرام من البلازميد شيدت كما هو مبين في دليل الشركة المصنعة.
بعد 72 ساعة، اجمع المُندفع. باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر معقم، تصفية وسائل الإعلام، والحفاظ على تعليق الفيروسية في الظلام عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك، تنمو الخلايا HT29 بين عشية وضحاها في طبق 60 ملليمتر مع DMEM، احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
عندما تصل الخلايا إلى 30 إلى 50٪ التقاء، تصيبهم بمليلترين من التعليق الفيروسي في وجود ثمانية ميكروغرام من البوليبرين لكل ملليلتر من التعليق الفيروسي. احتضان الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى ست ساعات. ثم، الطامح تعليق الفيروسية.
إضافة أربعة ملليلتر من DMEM الطازجة والعودة الطبق إلى الحاضنة. في 24 ساعة بعد العدوى، وإزالة وسائل الإعلام من الأطباق وغسل الخلايا بعناية مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني ما قبل الدافئة. إضافة ملليلتر واحد من التربسين EDTA، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.
باستخدام المجهر في التكبير 10 مرات، ومراقبة الخلايا لضمان أن معظمها قد فصل. بعد ذلك، إضافة ملليلتر اثنين من DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS لوقف التربسينية، وجمع تعليق الخلية في أنبوب 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة فائقة.
إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 ملليلتر من DMEM والماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط. بعد ذلك، تمييع الخلايا بعوامل 30 و100 و300. بذور الخلايا هي 150 ملليمتر الأطباق التي تحتوي كل 20 ملليلتر من DMEM تحتوي على blasticidin بتركيز من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر.
احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع إلى أسبوعين تقريبا. خلال هذه الفترة، استخدم مجهر مقلوب في 10 مرات التكبير لمراقبة المستعمرات كل يوم. وضع علامة على المستعمرات المعزولة جيداً في قاع الطبق عندما يكون قطر المستعمرات حوالي ملليمترين.
عندما تكون فترة الحضانة كاملة ، تتبخر المتوسطة وتغسل الخلايا بثلاثة ملليلترات من برنامج تلفزيوني مُدفأ مسبقًا. أضف مليلترين من التربسين EDTA في طبق 60 ملليمتر. استخدام ملقط العقيمة لالتقاط اسطوانات الاستنساخ المعقم autoclaved ووضعها في الطبق.
ثم، التقاط الاسطوانات التي سوف تحتوي الآن كل ما يقرب من 30 ميكرولترات من EDTA تريبسين، ووضعها بلطف على المستعمرات ملحوظ. إعادة الطبق إلى الحاضنة لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، تحقق من الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها قد فصلت.
عندما رفعت الخلايا، في 70 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة لكل اسطوانة لإلغاء تنشيط التربسين. استخدم ماصة 200 ميكرولتر لخلط تعليق الخلية بلطف، مع التأكد من عدم تحريك الأسطوانة أثناء الاختلاط. تعيين اثنين من لوحات 24-جيدا، وتسمية لهم لوحة A ولوحة B.Add ملليلتر واحد من DMEM إلى كل بئر.
إضافة 30 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة A، وإضافة 70 ميكرولترات إلى الآبار المقابلة من لوحة B.Place لوحات مرة أخرى إلى الحاضنة. عندما تكون الخلايا في لوحة B في التقاء 90٪، وإزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا بعناية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني تماما، وإضافة 50 ميكرولترات من 1X SDS-PAGE تحميل العازلة لlyse الخلايا.
بعد خمس دقائق، نقل الخلية من لوحة 24 جيدا إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. تغلي العينات في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تشغيل العينات على هلام 10٪ SDS في الجهد المستمر من 80 فولت لمدة 15 دقيقة ثم في 120 فولت لمدة ساعة واحدة.
ثم نقل البروتين إلى غشاء فلوريد بوليفينيدين عن طريق نقل الرطب في تيار ثابت من 400 مللي مبل في ساعتين. تخفيف الجسم المضاد الرئيسي بمعامل 5,000 في 5٪ حليب غير داتين الذي يذوب في TBST. إضافة الجسم المضاد FLAG إلى الغشاء، واحتضان في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
باستخدام مجموعة التهزات إلى 200 دورة في الدقيقة، قم بغسل الغشاء باستخدام TBST لمدة 15 دقيقة، منعشة لـ TBST كل خمس دقائق. ثم، تمييع الأجسام المضادة مضادة ماوس الثانوية من قبل عامل من 10،000 في 5٪ الحليب غير الدهنية. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في أربع درجات مئوية لمدة خمس إلى ست ساعات.
غسل الغشاء على شاكر decoloring مرة أخرى كما هو موضح سابقا. بعد ذلك، استخدم ال chemiluminescence الغربية المحسنة ونظام وثائق هلام لصورة الغشاء والكشف عن التعبير FLAG. أولاً، جمع كل من HT29 و HT29-DR3 الخلايا بواسطة trypsinization، واستخدام عداد خلية تلقائي لقياس كثافة الخلية.
بذور الخلايا في آبار 12-صحن مع DMEM في كثافة 30،000 الخلايا في البئر، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، إضافة 10 نانومولار من الديازاوناميد إلى كل بئر يحتوي على خلايا باستخدام 1٪ DMSO كتحكم سلبي، ونقل لوحات إلى حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 48 ساعة من العلاج، صور الخلايا تحت المجهر في 10 مرات التكبير.
بعد ذلك، بذور كل من الخلايا HT29 و HT29-DR3 في آبار 96-جيدا مع DMEM في كثافة 3،000 الخلايا في البئر، والسماح لهم أن تنمو في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إضافة تركيزات diazonamide تصاعد الجرعة على النحو المبين في بروتوكول النص. بعد 48 ساعة من العلاج، استخدم مجموعة فحص الخلية المستندة إلى الإنارة لقياس قابلية الخلية للحياة.
قم بإزالة لوحة 96-well من الحاضنة، واتركها تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبًا. ثم، إضافة 50 ميكرولترات من الكواشف إلى كل بئر، ويهز لوحة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لlyse الخلايا. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ومن ثم استخدام قارئ microplate لتحديد الإنارة من كل بئر.
توصيف خلايا HT29 عن طريق طعن DR3 يكشف عن أن المستنسخين يعبرون عن مستويات متفاوتة من DR3 في حين أن الخلايا البرية من النوع لا تظهر التعبير الجيني الخارجية. الجينات واحد وخمسة وينظر إلى التعبير عن أعلى مستويات DR3، وذلك يتم اختيار لمزيد من التجارب. ويلاحظ مورفولوجيا خلايا HT29 وHT29-DR3 بعد معالجته لمدة 48 ساعة مع الديازوناميد.
تعرض خلايا HT29-DR3 موتاً مبوبًا واضحًا مع غشاء خلية مكسورة وأنقاض الخلايا. ومع ذلك، تظهر خلايا HT29 فقط اعتقال mitotic مع الخلايا سليمة التي يحمل شكل خلية الجولة لأعلى. ثم يتم تحديد صلاحية الخلية من هذه الأنواع من الخلايا بعد معالجتها لمدة 48 ساعة مع ثلاثة نانوموللار من الديازوناميد.
وينظر إلى خلايا HT29-DR3 أن يكون لها موت الخلية من أكثر من 80٪بينما تظهر خلايا HT29 الأبوية استجابة طفيفة فقط في شكل اعتقال ميتو المتعدد. وهذا يشير إلى أن فرط التعبير من DR3 إعادة تشكيل المسار المبرمج الناجم عن الديازوناميد في هذه الخلايا. تخفيفات تسلسلية مناسبة مهمة للحصول على كثافة الأمثل من استنساخ واحد.
من المهم أيضا التأكد من أن كل اسطوانة استنساخ تحتوي على مستعمرة واحدة فقط وتجنب تلويث المستعمرات القريبة. وD3 خطوط الخلايا المفرطة سهل الدراسة الكيميائية الحيوية من الآليات الجزيئية في المختبر. نحن ولدت HT29-DR3 xenografts من خلال الحقن تحت الجلد من خلايا HT29-DR3، وساعد في وضع آليات من الخلايا المبرمج الناجمة عن العوامل المضادة للتشنج في الجسم الحي.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الجينات ذات الاهتمام في خطوط الخلايا الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خروج الجينات هو طريقة أخرى للدراسة الوظيفية ، ويمكن تكييف بروتوكولنا مع أنظمة الضربة القاضية للجينات. وبالتالي، فإنه ينطبق عموما لتوضيح وظائف الجينات.
تذكر لإسقاط الفيروس ترحيل إلى القمامة إلى حاويات محددة للتخلص من السلامة.
