هذه التقنية رافض متعددة الفوتون بالليزر المسح المجهري بالتزامن مع الليزر فلاش التحليل الضوئي لجزيء النيكوتين القابل للتكشط الضوئي. السماح بالتنشيط الدقيق لمستقبلات الكولينينية النيكوتينية. هذه التقنية تسمح لغرامة ملعقة الزمانية السيطرة على تطبيق مستقبلات النيكوتين ناهض، وتوفير أداة قوية لدراسة أنماط التعبير الوظيفي مستقبلات ونقل cholinergic متشابك أو حجم.
قبل البدء في الإجراء، استخدم مُجرّد ماصة قابل للبرمجة لسحب ميكروبيبت زجاجي بقطر فتحة 20 إلى 40 ميكرومتر. سلالة ما يقرب من ملليلتر من تسجيل الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون. وإعادة تعليق ما يكفي من النيكوتين المُنشط ضوئيًا في محلول التسجيل المصفى ليسفر عن تركيز نهائي بمليمولار اثنين.
قم بملء التطبيق المحلي المسحوب micropipette مع 50 ميكرولترات من الدواء القابل للانكامل الضوئية ، وتأمين الماصات في حامل ماصة محمولة على ميكرومانيبولاتور. قم بتوصيل حامل الماصات عبر طول مناسب من الأنابيب إلى نظام طرد الضغط القادر على تطبيق الضغط المنخفض المستمر. واستخدام micromanipulator للمناورة ماصة التطبيق المحلي في حل تسجيل خارج الخلية.
ضع طرف الماصات قليلاً فوق عينة أنسجة دماغ الماوس، أي ما يقرب من 50 ميكرومتر من الخلية التي تهمك. وطبق لفترة وجيزة جنيه إلى جنيهين لكل بوصة مربعة من الضغط على الماصة. وينبغي أن يكون هناك حد أدنى من أي تشريد للخلية ذات الاهتمام.
بعد تحقيق ثابت كامل الخلية المشبك التصحيح، بدوره على التطبيق المنخفض على جهاز طرد الضغط، وتشبع الأنسجة المحيطة بالخلية مع النيكوتين photoactivatable لمدة دقيقة إلى دقيقتين. التطبيق المحلي يقدم تعقيد إضافية إلى التجربة. لكنه يجنب المركب ويسمح باستخدام تركيزات أعلى من PA-Nic.
لتطبيق حمام النيكوتين القابل للتكشط الضوئي ، قم أولاً بحل ما يكفي من الدواء المتحلل في حجم من محلول التسجيل المناسب لإعادة تدوير مستمر إلى تركيز نهائي 100 ميكرومولار. وتحميل الخليط الناتج في نظام التسريب. ثم تبدأ إعادة تدوير محلول النيكوتين القابل للتكشط الضوئي بمعدل 1.5 إلى 2 ملليمتر في الدقيقة ، باستخدام أنابيب مع الحد الأدنى من القطر الداخلي وطول العام لتقليل حجم إعادة تدوير المطلوبة.
أثناء إعادة تدوير, فقاعة باستمرار الحل مع كاربوجين, والحفاظ على درجة حرارة الحمام في 32 درجة مئوية في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة. تطبيق حمام يستفيد من بساطة والتوحيد من السلطة الفلسطينية-Nic تغلغل الأنسجة. لكنه يستخدم بالضرورة أقل تركيزات الطاقة الدقيقة PA-Nic، وينفق كميات أعلى من إجمالي المركب.
للتصور الحي لخليوة هابينولا المتوسطة، واستخدام الضوء المنقولة أو الأشعة تحت الحمراء التفاضلية النقيض البصريات وكاميرا الفيديو لإنشاء مستقرة، كامل الخلية تسجيل المشبك التصحيح. بعد إنشاء التكوين المرفق بالخلايا عالي المقاومة، ولكن قبل الاقتحام، قم بتبديل الإعداد والبرامج إلى وضع المسح الضوئي بالليزر. بعد اقتحام، واستخدام الليزر المسح للتحقق من أن صبغة التصوير من الفائدة هو ملء سلبي الخلايا العصبية عن طريق الانتشار.
السماح للصبغة لملء المقصورات الخلوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة على الأقل قبل استخدام وظيفة المسح الحي لتصور الخلايا العصبية والمقصورة دون الخلوية من الفائدة. حدد معلمات التصوير التي تسمح بالتصور المباشر الدقيق للميزات العصبية، ومعالجة الإعدادات المناسبة للتأثير على أو تغيير عرض التصور، القرار، نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووقت الحصول على إطار الصورة حسب الضرورة. لتحسين تباين الإشارة، افتح نافذة جدول البحث وضبط إعدادات الجدول والسقف.
لتحديد منطقة ذات أهمية داخل النسيج، حدد التكبير البصري 1X واستخدم عناصر التحكم بالغسل. استخدم أداة السلسلة Z لتحديد موضع بدء وإيقاف يحتوي على خلية الاهتمام. قم بتعيين حجم خطوة من ميكرومتر واحد، وحدد حجم صورة التي سوف تعطي صورة ذات دقة عالية.
غالباً 1، 024 في 1، 024 بكسل لكل خط. ثم صورة متتالية للخلايا العصبية في كل طائرة Z التي تحتوي على الخلية. لمعايرة تحفيز الليزر، ابدأ مسح النظام باستخدام طاقة ليزر تصوير أكبر من الحد الأدنى، وصقل التركيز الموضوعي على طبقة الفلورية ذات العلامة الحمراء الرقيقة.
حدد منطقة داخل حقل الفلوريسنس واضحة من الحطام ومغلفة بالتساوي مع علامة، وفتح الأدوات والمعايرة وقائمة المحاذاة لتحديد وظيفة galvocalibration غير مُجَرَّد. اتبع البرنامج التعليمي البقع حرق للمعايرة المكانية للزوج مرآة galvanometer الثاني، واختيار الليزر 405 نانومتر، وقوة تحفيز الليزر من 400، وفترة التحفيز من 20 مللي ثانية. لتُسفر عن ثقوب قطرها 1-5 ميكرومتر في العلامة الحمراء.
حدد التحديث لتحفيز الصورة وتحديثها بعد حرق النقطة المركزية، ثم نقل مؤشر أحمر مستدير إلى الموقع الفعلي للبقعة في الوسط، واليمين، والأدنى مركز للحصول على شبكة من تسعة بقع. لاختبار المعايرة، افتح نافذة نقاط العلامة و تنشيط معلمات التحفيز للبقع المحددة يدويًا في منطقة جديدة من العينة، مع الحرص على تحميل أحدث ملف معايرة صحيح في نافذة نقاط العلامة. ثم قم بتطبيق نبض اختبار للتحقق من المعايرة الصحيحة.
للصورة لفترة وجيزة وتحديد موقع منطقة دون الخلية من الفائدة، حدد المسح الحية واستخدام زيادة التكبير البصري لتصور أي هياكل صغيرة حسب الضرورة. ضع علامة نقطة واحدة نقطة التقاطع المتاخمة مباشرة لغشاء الخلية، وتعيين المعلمات phototimulation إلى واحد إلى 50 مللي ثانية مدة، وقوة ليزر واحد إلى أربعة ملليوات، وعلى الأقل محاكمة واحدة. ثم حدد تشغيل نقاط علامة لبدء بروتوكول نقاط العلامة، ومراقبة الحصول على البيانات الكهربائية فيزيولوجيا في الوقت الحقيقي.
يتم الكشف بسهولة عن النيكوتين القابل للتكف عن 2PE من واحد ملليمتر PA-Nic أثناء طرد الضغط من ماصة التطبيق المحلية كما هو موضح. في حين أن تسليم المنتجات الكيميائية الضوئية الرئيسية من تفاعل التحليل الضوئي النيكوتين قابلة للتنفيس لا تولد أي إشارة الفلورسنت في نفس التركيز وقوة الإثارة والطول الموجي. إظهار خصوصية نتائج النيكوتين القابلة للتكد ٍيت.
التصوير من النيكوتين القابل للتكرار الضوئية تطبيقها على أنسجة الدماغ كما هو موضح يكشف عن وجود المخدرات داخل 100 إلى 200 ميكرومتر من ماصات التطبيق المحلي. تأكيد أن النيكوتين القابل للتكشط الضوئي يمكن أن يتم تسليمه بفعالية إلى أنسجة الدماغ عن طريق التطبيق المحلي. هنا ، تظهر صور عالية الجودة التي يبدو أن مورفولوجيا الخلايا العصبية كاملة ، يتم تقليل الضوضاء ، والحطام لا تتداخل مع تفسير مورفولوجيا الخلوية.
غير أن هذه الصور ذات نوعية أقل. نظرا لانخفاض نسبة الإشارة إلى الخلفية وإلى وجود حطام كبير. إقران 2 فوتون الليزر المسح المجهري من الخلايا العصبية هابينولا المتوسطة في شرائح الدماغ مع الليزر فلاش التحليل الضوئي من السلطة الفلسطينية كما هو مبين، ويسمح للتوفيق بين الاستجابات الكهربائية الفيزيولوجية مع مورفولوجيا الخلوية.
يسمح التحليل الضوئي البؤري الأحادي الذي يتم تنفيذه على فترات زمنية مدتها 10 ثوانٍ بوقت كافٍ للتعافي بالنسبة للتيار الذي يحمل خط الأساس. بينما يؤدي الفاصل الزمني أقصر ثانية واحدة إلى زيادة تدريجية في الحالي عقد كما يمضي البروتوكول. مما يشير إلى أن النيكوتين ليس لديه ما يكفي من الوقت لنشر بعيدا عن النظام مع فترات أقصر.
عند تصميم التجارب التي تستخدم الجزيئات القابلة للتنيف الضوئي، من المهم أن تتذكر أن تختار مؤشرات الفلورسنت وأن تبلغ الفلوروفوريس مع أطياف انبعاث الإثارة المتوافقة. PA-Nic متوافق مع الفلوروفهورات الأكثر شيوعا بسبب ذروتها قصيرة الطول الموجي للتحلل الضوئي. عند اختيار أنسب PA-Nic تقنية التطبيق، من المهم أن تنظر بعناية في التعبير الوظيفي، والنشاط الفسيولوجي لمستقبلات النيكوتين في الخلايا العصبية من الفائدة.
استخدام المهرة من هذه التقنية يسمح للسيطرة الدقيقة ملعقة الزمانية من تطبيق النيكوتين، والتي تمكن من إمكانيات جديدة مثيرة لدراسة حركية المشاركة مستقبلات النيكوتين الأصلية، والتعريب دون الخلوية، وتعديل النشاط العصبي من قبل تنشيط مستقبلات النيكوتين.
