هنا نقدم فحص نواة بسيطة فحص تحليل Aspergillus flavus النمو وإنتاج الأفلاتوشين في حبات الذرة التي تعبر عن البروتين المضاد للفطريات. باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر التعبير عن سلالة الفلافات Aspergillus، ونحن رصد العدوى وانتشار الفطريات في حبات ناضجة في الوقت الحقيقي. هذا الفحص البسيط يوفر وسيلة موثوقة لتقييم قدرة نواة الذرة على مقاومة عدوى الزلاجة و إنتاج الأفلاتوشين.
نتائج هذا المختبر فحصاً التي أجريت في ظل ظروف خاضعة للرقابة على حبات ناضجة يرتبط جيدا مع نتائج العدوى في ظل ظروف الميدان. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون الدكتور راجتيلاك ماجومدار، وهو من مختبرنا، جنبا إلى جنب مع كريستين سيكلر وديفيد أمبروسيو، فنيي العلوم البيولوجية أيضا من مختبرنا. للبدء، الغراء 20 اثنين من قبعات المفاجئة مم في طبق بيتري لإنشاء قبعات المملكة العربية السعودية.
دع الغراء يجف لمدة 48 ساعة قبل استخدام القبعات. في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية رش علبة bioassay مربع مع 70٪ الإيثانول في الماء. دع صينية الهواء تجف.
أضف ورق كروماتوغرافيا معقمة إلى صينية جافة. رش تسعة من القبعات السعودية مع 70٪ الإيثانول والسماح لهم الهواء الجاف. ثم ضع القبعات على علبة اِيُوائي.
لكل خط ذرة معدلة وراثيا يجري اختبارها، حدد 20 حبة غير التالفة ووضعها في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. باستخدام المجهر ستيريو الطاولة حدد فقط حبات غير التالفة للمجايسة. حبات التالفة هي أكثر عرضة لهجوم Aspergillus وإنتاج المزيد من الأفلاتوشين، وبالتالي انحراف النتائج وليس يمثل الصفات المضادة للفطريات أو مضادات الميكروبات الحقيقية من مجموعة متنوعة.
إضافة 70٪ الإيثانول إلى كل أنبوب. دع الحبوب تعقيم لمدة أربع دقائق بينما تهزها بلطف في بعض الأحيان. بعد هذا بلطف صب قبالة الإيثانول وشطف بلطف حبات في الماء غير المؤين العقيمة ثلاث مرات.
الحصول على ثقافة ستة أيام من وصمة عار 70 اسبرجيلوس flavus التعبير عن GFP نمت على V8 المتوسطة. إضافة 20 مل من العقيمة 0.02٪ تريتون X-100 في المياه ديوند. واستخدم حلقة معقمة لتكشط من الجراثيم.
الماصات قبالة inoculum ونقلها إلى 300 مل منقار معقمة. إعداد تخفيف خمسة أضعاف مع 0.02٪ تريتون X-100 واستخدام مقياس الهيموسيت لإجراء العد بوغ. تخفيف مرة أخرى إذا لزم الأمر للحصول على 100 مل مع تركيز أربعة ملايين جراثيم لكل مل.
صب قبالة inoculum في القارص فارغة. ضع حبات في منقار معقمة 300 مل مع شريط ضجة ويحرك لمدة ثلاث دقائق. باستخدام ملقط نقل حبات إلى طبق bioassay، مع التأكد من وضع نواة واحدة فقط في كل غطاء.
أضف 30 مل من الماء غير المؤين إلى الجزء السفلي من كل صينية من علب البيوراسا. واحتضان في 31 درجة مئوية لمدة سبعة أيام. بعد سبعة أيام من التلقيح مع A.flavus، التقاط صور من أربع حبات التي تم تعيينها للتحليل المجهري والتصوير الفوتوغرافي.
ثم استخدام الأنسجة الرخوة والمياه ديوند لتنظيف الخارج من حبات. قم بأداء أقسام طولية من حبات التقط الصور مباشرة تحت المجهر الفلوري. لتحضير حبات للتحليل، قم بتنظيف السطح الخارجي من حبات المتبقية بنسيج ناعم وماء غير مأون.
مكان أربع حبات، والتي تشكل مندوب واحد، في 15 مل المسمار قبعة البولي قارورة تحتوي على اثنين من كرات الفولاذ المقاوم للصدأ. تجميد على الفور قارورة في النيتروجين السائل وتخزينها في 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمضي قدما في مزيد من المعالجة والتحليل. عندما تكون جاهزة، وإزالة حبات من الفريزر واستخدام التجانس لطحن لهم في 1500 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق.
استخدم نفس المواد الأرضية لتحليل GFP وتحديد الأفلاتوشين والتحليل الجزيئي، بحيث تكون جميع القيم ممثلة للعينات. في حين ينصح على الأقل من ثلاثة تكرارات، أكثر هو دائما أفضل اعتمادا على توافر حبات ذات نوعية جيدة. في هذه الدراسة يتم تحويل الأجنة غير ناضجة من خطوط الذرة HI-II باستخدام Agrobacterium tumefaciens EHA101 سلالة تحتوي على ناقلات المقصد النباتية النهائية التي تعبر عن الجين Lablab purpureus AILP تحت سيطرة المروج 35S من فيروس فسيفساء القرنبيط.
أظهر تضخيم PCR لجين AILP المستهدف وجود 548 bp amplicon لوحظ فقط في خطوط الذرة المعدلة وراثيا. أظهر الجين AILP التعبير في خطوط المعدلة وراثيا في حين لم يلاحظ أي تعبير AILP في محطات التحكم. تتعرض الجراثيم في مرحلة مبكرة من الزرع إلى مستخلصات أوراق خام من نباتات الذرة المعدلة وراثياً الصغيرة لمدة 20 ساعة.
ارتفاع طول كامل من الجراثيم المعرضة لاستخراج أوراق معدلة وراثيا تظهر 58 إلى 80٪ انخفاض مقارنة مع السيطرة السلبية. سلالة A.flavus المستخدمة تحتوي على مراسل GFP الذي يتيح رصد وكمية النمو الفطري في الوقت الحقيقي. ويلاحظ انخفاض كبير في الفلورية GFP في حبات AILP المعدلة مقارنة بالتحكم السلبي الأيزوجيني.
ويُنظر إلى انخفاض كبير في النمو الفطري لخطوط AILP أربعة وخمسة و69٪ و72٪ على التوالي. خطوط أخرى تظهر انخفاضا من 35 إلى 60٪ في مقارنة مع حبات التحكم. ولوحظ انخفاض بنسبة 62 إلى 88٪ في محتوى الأفلاتوشين في حبات AILP مقارنة بالتحكم.
ويُنظر إلى الخط الرابع على أنه أدنى محتوى من أفلاتوشين عند 486 نانوغرام لكل غرام، يليه خطوط أخرى تتراوح بين 640 و1498 نانوغرام لكل غرام في حبات. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق إضافية مثل استخدام مقياس الفلور لتحديد كمية GFP ونموه الفطري. يمكن استخدام مجموعات تجارية تعتمد على المناعة أو HPLC أو EPLC لإجراء كمية الأفلاتوشين.
يوفر توافر المملكة العربية السعودية وسيلة سريعة وبسيطة لتحديد مقاومة التلوث أفلاتوشين. ويمكن تقييم خطوط تربية الذرة المختلفة بسرعة باستخدام هذه التقنية. في حين أن فحص النواة ليس خطرا، يجب على المشغل حماية نفسه من التعرض لأسبيرجيلوس الجراثيم flavus، واستخدام معدات الحماية المناسبة.
