الهدف العام لهذا الإجراء التجريبي هو توليد فيروس زيكا المؤتلف المعدي من استنساخ cDNA كامل الطول ، تم تجميعه في كروموسوم اصطناعي بكتيري تحت سيطرة المروج الفوري لفيروس استئصال الفجل الكيسي البشري. ويتيح تطوير نظام وراثي عكسي لفيروسات الحمض النووي الريبي الريبي مثل فيروس زيكا التلاعب المباشر بجينوم الفيروس لدراسة جوانب متعددة من البيولوجيا الفيروسية والأمراض واستنباط استراتيجية اللقاح. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن بناء فيروس زيكا المستنسخ المعدي ككروموسوم اصطناعي بكتيري يتغلب على السمية المرتبطة بجينوم فيروس الفلافلايا ويسمح بإنقاذ الفيروس المعدي عن طريق العدوى المباشرة باستنساخ BAC cDNA في الخلايا المعرضة للخطر.
ويمكن تطبيق هذه المنهجية على بناء مستنسخات معدية مستقرة وكاملة الوظائف من الحمض النووي الريبي (cDNA) لغيرها من فيروسات الفلافويين وكذلك فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى التي تقطعت بها السبل. للبدء في هذا الإجراء، إنشاء استنساخ فيروس زيكا cDNA كما هو موضح في بروتوكول النص، وذلك باستخدام مواقع تقييد المخصصة. يتم تجميع أربع شظايا الحمض النووي التي تغطي الجينوم فيروس زيكا محاطة بمروج CMV الإنسان في نهاية خمسة رئيس وريبوسوم فيروس دلتا التهاب الكبد وإنهاء هرمون النمو البقري وتسلسلات تعدد الأدنيلي في نهاية ثلاثة prime في بلازمي كروموسوم اصطناعي بكتيري.
أولاً، تنمو مستعمرة واحدة من E.coli DH10B تحمل استنساخ فيروس PBAC-Zika المعدية في خمسة ملليلتر من متوسطة LB تحتوي على الكلورامفينيكول لمدة ثماني ساعات في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. ثم، إضافة 500 ملليلتر من متوسطة LB التي تحتوي على الكلورامفينيكول إلى قارورة سعة لترين. إضافة ملليلتر واحد من الثقافة البكتيرية المعدة إلى القارورة وتنمو الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 14 إلى 16 ساعة حتى OD600 هو تقريبا 0.6 إلى 0.8.
بعد ذلك، استخدم مجموعة تجارية وضعت خصيصا لتنقية BAC لتنقية استنساخ عدوى CDNA عدوى BAC عن طريق تحلل القلوية باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قبل يوم واحد من عملية نقل الدم، لوحة خلايا فيرو في آبار لوحة ستة بئر في كثافة 500،000 الخلايا في بئر في متوسط النمو. لإعداد مزيج transfection، إضافة أربعة ميكروغرام من استنساخ CDNA BAC إلى 250 ميكرولترات من المصل خفضت المتوسطة ومزيج بعناية.
في أنبوب منفصل، تمييع 12 ميكرولترات من عامل transfection في 250 ميكرولترات من المصل متوسطة مخفضة. دوامة لخلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، الجمع بين cDNA BAC المخفف مع عامل transfection.
اخلطي بعناية ويندمجي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة هذه، استخدام متوسط النمو دون المضادات الحيوية لغسل خلايا فيرو وترك الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة دون المضادات الحيوية. ثم، وتوزيع 500 ميكرولترات من cDNA وخليط كاشف transfection على خلايا فيرو قطرة.
صخرة لوحة ذهابا وإيابا لخلط واحتضان الخلايا في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات. بعد ذلك، إزالة الوسيط transfection وإضافة ملليلتر اثنين من متوسطة النمو الطازجة مع المضادات الحيوية. احتضان الخلايا في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، مع التأكد من التحقق من كل يوم لالتحث عن تأثير cytopathic.
بعد أربعة إلى ستة أيام من transfection، عندما CPE حوالي 50 إلى 75٪ جمع اعالي ثقافة الأنسجة في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر والطرد المركزي لمدة 10 دقائق لإزالة الحطام الخلوي. ثم، حصاد supernatnatants تحتوي على فيروس زيكا المؤتلف والتخلص من الكريات الخلية. Aliquot المُندفع في الأنابيب المبردة وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية.
للبدء، تنمو خلايا فيرو إلى التقاء 90٪. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وتصيبهم مع الفيروس انقاذ مع تعدد العدوى من 0.1 في متوسطة النمو التي تحتوي على 2٪ FBS. ضع الصفائح من الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون والصخور كل 15 دقيقة لفترة الامتزاز 90 دقيقة.
بعد الامتزاز الفيروسي، وإزالة inoculum الفيروسية وإضافة متوسط النمو جديدة مع 2٪ FBS. احتضان ثلاثة أو أربعة أيام بنفس الشروط المستخدمة سابقا. عندما CPE هو ما يقرب من 75٪ جمع ثقافة الأنسجة الفائقة والطرد المركزي لإزالة الحطام الخلوي.
ثم، حصاد فائقة تحتوي على فيروس زيكا المؤتلف والتخلص من بيليه. Aliquot المُندفع إلى أنابيب التبريد. ضع الأنابيب في صندوق تجميد وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية.
عندما تكون جاهزة، إزالة aliquot الفيروس من الفريزر وتحديد titer الفيروسية عن طريق فحص البلاك كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يتم إنشاء نسخة مستقرة وكاملة cDNA من سلالة فيروس زيكا ريو غراندي دو نورتي ناتال عن طريق استنساخ تسلسلي أربع شظايا cDNA متداخلة في الكروموسوم الاصطناعي البكتيري pBeloBAC11 باستخدام طرق الاستنساخ التقليدي ومواقع تقييد فريدة موجودة في الجينوم الفيروسي. وقد أحاطت هذه النسخة cDNA كامل الطول في نهاية خمسة رؤساء من قبل المروج الفيروس المضخم للخلايا البشرية للسماح للتعبير عن الحمض النووي الريبي الفيروسي في نواة الخلايا المصابة وفي نهاية ثلاثة رؤساء من قبل فيروس التهاب الكبد دلتا الريبوسوم تليها إنهاء هرمون النمو البقري وتسلسل polyadenylation لإنتاج الحمض النووي الريبي التي تحتوي على نهاية ثلاثة رؤساء بالضبط من الجينوم الفيروسي.
مرة واحدة يتم تجميعها CDNA BAC، يمكن بسهولة استرداد الفيروس المعدية بعد transfection المباشر من خلايا فيرو عرضة مع استنساخ CDNA BAC باستخدام الدهون الكاتيونية. باستخدام هذا النهج، يمكن إنقاذ فيروس R Zika RGN مع أكثر من مليون وحدة تشكيل البلاك لكل ملليلتر. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي الفيروس الذي تم إنقاذه إلى تأثير خليثي واضح ويولد لويحات متجانسة تبلغ مساحتها حوالي 2 ملليمتر.
يتم تأكيد هوية الفيروس التي تم إنقاذها عن طريق تحليل الفلورسنس المناعي باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة محدد للبروتين فيروس زيكا E. وعموماً، تثبت هذه النتائج أنه يمكن إنقاذ فيروس زيكا المؤتلف المعدي من استنساخ cDNA كامل الطول الذي تم تجميعه في شهادة البكالوريا. وخلاصة القول، لقد طورنا نهجا جينيا عكسيا لفيروس زيكا القوي القائم على استخدام كروموسوم اصطناعي بكتيري يمكن تكييفه لتوليد العدوى المستقرة والوظيفية مع استنساخ الحمض النووي من فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى التي تعمل على حبلا إيجابي لتسهيل دراسة علم الأمراض، وتطوير لقاح، أو لتسهيل تحديد المخدرات مع النشاط المضاد للفيروسات.
