המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא הדור של וירוס זיקה רקומביננטי זיהומיות מ שיבוט cDNA באורך מלא, התאספו כרומוזום מלאכותי חיידקי תחת שליטתו של האמרגן האנושי cytomegalovirus מיידית מוקדם. הפיתוח של מערכת גנטית הפוכה עבור וירוסי RNA כגון וירוס זיקה מאפשרים מניפולציה ישירה של הגנום של הנגיף ללמוד היבטים מרובים של הביולוגיה הנגיפית ופתוגנזה ולפתח אסטרטגיית חיסון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי הבנייה של שיבוט זיהומיות וירוס זיקה כרומוזום מלאכותי חיידקי מתגבר על הרעילות הקשורה הגנום flavivirus ומאפשר הצלה של וירוס זיהומיות על ידי transfection ישיר של שיבוט CDNA BAC לתאים רגישים.
מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על בניית שיבוטים cDNA זיהומיות יציבה ומתפקדת באופן מלא עבור flaviviruses אחרים, כמו גם וירוסי RNA אחרים תקע חיובי. כדי להתחיל בהליך זה, לבנות את שיבוט cDNA וירוס זיקה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, באמצעות אתרי הגבלה מתאימים. ארבעה שברי דנ"א המשתרעים על פני הגנום של נגיף זיקה, כשלצדם מקדם ה-CMV האנושי בקצה ה-5 פריים, וריבוזום נגיף הדלתא של הפטיטיס והפסקת הורמון הגדילה והרצפים הפוליאדניליים בקצה השלישי, מורכבים בפלסמיד כרומוזום מלאכותי חיידקי.
ראשית, לגדל מושבה אחת של E.coli DH10B נושאת את שיבוט זיהומיות וירוס pBAC-זיקה בחמישה מיליליטר של מדיום LB המכיל כלוראמפניקול במשך שמונה שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות. לאחר מכן, מוסיפים 500 מיליליטר של מדיום LB המכיל כלוראמפניקול לבקבוקון שני ליטר. מוסיפים מיליליטר מתרבות החיידקים המוכנה לבקבוק ומגדלים את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 14 עד 16 שעות עד שה-OD600 הוא בערך 0.6 עד 0.8.
לאחר מכן, השתמש בערכה מסחרית שפותחה במיוחד עבור טיהור BAC כדי לטהר את שיבוט cDNA זיהום BAC על ידי תזה אלקליין על ידי ביצוע הוראות היצרן. יום אחד לפני transfection, צלחת תאי Vero לתוך בארות של צלחת שש באר בצפיפות של 500, 000 תאים לתוך גם בינוני צמיחה. כדי להכין את תערובת ההמרה, הוסיפו ארבעה מיקרוגרם של שיבוט ה-CDNA BAC ל-250 מיקרוליטרים של סרום בגודל בינוני ומערבבים היטב.
בצינור נפרד, לדלל 12 microliters של סוכן transfection ב 250 microliters של סרום מופחת בינוני. מערבולת לערבב ותדרגר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, שלב את CDNA BAC מדולל עם סוכן transfection.
מערבבים בזהירות ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות. במהלך תקופת הדגירה הזו, השתמש במדיום צמיחה ללא אנטיביוטיקה כדי לשטוף את תאי Vero ולהשאיר את התאים במיליליטר אחד של מדיום טרי ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן, להפיץ את 500 microliters של cDNA ותערובת reagent transfection על תאי Vero dropwise.
רוק את הצלחת קדימה ואחורה כדי לערבב לדגר את התאים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות. לאחר מכן, להסיר את מדיום transfection ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום צמיחה טרי עם אנטיביוטיקה. הדגירה את התאים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני, הקפד לבדוק כל יום עבור אינדוקציה של אפקט ציטופתי.
לאחר ארבעה עד שישה ימים של חילוף, כאשר CPE הוא סביב 50 עד 75% לאסוף את תרבות הרקמה supernatants ב 15 מיליליטר צינורות חרוט צנטריפוגה במשך 10 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר. לאחר מכן, לקצור את supernatants המכיל וירוס זיקה רקומביננטי להשליך את כדורי התא. אלקוט העל-טבעי בקריפטובות ואחסן אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי להתחיל, לגדל תאי Vero ל 90%confluence. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהדביק אותם עם הנגיף שחולץ עם ריבוי של זיהום של 0.1 במדיום הצמיחה המכיל 2%FBS. מניחים את לוחות התאים באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני וסלעים כל 15 דקות לתקופת ההסגף של 90 דקות.
לאחר סחתוע ויראלי, להסיר את inoculum ויראלי ולהוסיף מדיום צמיחה טרי עם 2%FBS. דגירה שלושה או ארבעה ימים באותם תנאים בשימוש בעבר. כאשר CPE הוא כ 75% לאסוף את תרבות הרקמה על טבעי צנטריפוגה כדי להסיר פסולת הסלולר.
לאחר מכן, לקצור את העל-טבעי המכיל וירוס זיקה רקומביננטי ולהשליך את גלולה. אל תהפוך את העל-טבעי לקריפטובות. מניחים את הצינורות בקופסת הקפאה ומאחסנים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כאשר מוכן, להסיר aliquot וירוס מהמקפיא ולקבוע את הטיטר ויראלי על ידי פלאק תדא כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, שיבוט cDNA יציב באורך מלא של זן וירוס זיקה ריו גרנדה דו נורטה נטאל נוצר על ידי שיבוט ברצף ארבעה שברי cDNA חופפים לתוך כרומוזום מלאכותי חיידקי pBeloBAC11 באמצעות שיטות שיבוט קונבנציונליות ואתרי הגבלה ייחודיים נוכח בגנום ויראלי. שיבוט cDNA באורך מלא זה היה מוקף בקצה חמשת הפריים על ידי מקדם cytomegalovirus האנושי כדי לאפשר את הביטוי של RNA ויראלי בגרעין של תאים מפוספסים בקצה שלוש פריים על ידי ריבוזום וירוס דלתא הפטיטיס ואחריו סיום הורמון גדילה bovine ורצף polyadenylation לייצר RNAs המכיל את הקצה המדויק שלוש פריים של הגנום ויראלי.
לאחר CDNA BAC מורכב, וירוס זיהומיות ניתן לשחזר בקלות לאחר transfection ישיר של תאי ורו רגישים עם שיבוט CDNA BAC באמצעות ליפוזומים cationic. באמצעות גישה זו, R זיקה וירוס RGN ניתן להציל עם titers גבוה יותר ממיליון יחידות לוח להרכיב למיליליטר. בנוסף, הנגיף שחולץ גורם לאפקט ציטופתי ברור ומייצר לוחות הומוגניים בגודל של כשני מילימטרים.
זהות הנגיף שניצלה מאושרת באמצעות ניתוח שפעת חיסונית באמצעות נוגדן חד שבטי ספציפי לחלבון E של נגיף זיקה. בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי וירוס זיקה רקומביננטי זיהומיות ניתן להציל שיבוטים cDNA באורך מלא התאספו BAC. לסיכום, פיתחנו גישה גנטית הפוכה של וירוס זיקה רב עוצמה המבוססת על שימוש כרומוזום מלאכותי חיידקי שניתן להתאים כדי ליצור זיהומים יציבים ופונקציונליים עם שיבוט cDNA של וירוסי RNA אחרים בעלי גדיל חיובי כדי להקל על חקר הפתולוגיה, לפתח חיסון, או להקל על זיהוי של תרופה עם פעילות אנטי ויראלית.
