الوصول إلى تفاعلات الهدف ميكرورنا العصبية مع وظائف ميكرورنا أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية MicroRNAs تنظيم العمليات البيولوجية المختلفة في كل من الدول الصحية والمامراضة. ويصف هذا البروتوكول عملية التكاثر من خلال استراتيجية تحديد أهداف ميكرورنا وmicroRNAs الوظيفية حيث أن التحقق من الهدف المباشر لليورانات الصغيرة يشكل تحديا. يمكن أن يوفر بروتوكولنا رؤى حول وظيفة microRNAs الفردية والآثار المترتبة على ميكرورنا في علاج السرطان.
حساب تركيز مثبط نصف القصوى هو وسيلة هامة، ليس فقط لدراسات الحمض النووي الريبي الصغير ولكن للتقييم الفعّال للأدوية المضادة للسرطان الأخرى. بروتوكولنا سيكون مفيدا للباحثين الجدد منذ وصفنا الطريقة الأساسية لفهم مستوى microRNAs في الخلية. لبدء البروتوكول، عد الخلايا مع عداد الخلية.
لوحة الخلايا في لوحة 96 جيدا. في اليوم التالي، وإعداد مجموعة من الخلائط transfection نقل الخلايا في عدة تركيزات النهائي من محاكاة التحكم microRNA، وميكر الحمض النووي الريبي-107 تقليد. من مخزون من 25 ميكرومولار التحكم microRNA تقليد، أو ميكرورنا-107 تقليد، وتمييع وإضافة تقليد السيطرة أو ميكرورنا-107 تقليد في وسائل الإعلام المصل مخفضة جنبا إلى جنب مع كاشف transfection في أنابيب microcentrifuge.
اخلطي خليطاً يحتوي على القلة بلطف باستخدام ميكروسيبيت. بعد حضانة 10 دقيقة في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، بلطف مزيج الخلائط المحتوية على القلة مرة أخرى، ثم إضافة 50 ميكرولترات من الخلائط في كل بئر. إبقاء الخلايا المُصابة بالعدوى في حاضنة ثقافة الخلايا.
التعرق بعناية وسائل الإعلام ثقافة الخلية في كل بئر من لوحة وملء بسرعة 100 ميكرولترات من 10٪ حمض ثلاثي الكلور، أو TCA، في كل بئر. الحفاظ على لوحة تحتوي على 10٪ TCA في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، اغسل الطبق عدة مرات عن طريق غمره في حوض مع ماء الصنبور.
إزالة المياه الزائدة من داخل الآبار عن طريق التنصت على لوحة حتى لا يكون هناك ماء اليسار، وتجفيف لوحة. ماصة 50 ميكرولترات من 0.4٪ حل SRB في كل بئر بما في ذلك الآبار الفارغة. اصافح الطبق بلطف حتى يغطي حل SRB 0.4٪ بالتساوي الجزء السفلي من الآبار.
ثم، احتضان لوحة لمدة 40 إلى 60 دقيقة. بعد الحضانة، وغسل لوحة مع حمض الخليك 1٪حتى يتم غسلها تماما صبغة غير منضمة بعيدا. ماصة 100 ميكرولترات من 10 ملليمتر تريس حل قاعدة في الآبار المقابلة، بما في ذلك الآبار الفارغة.
إبقاء لوحة على شاكر لمدة 10 دقائق. قياس امتصاص في 492 نانومتر. حساب النسبة المئوية لمتوسط الامتصاص والانحراف المعياري لكل مجموعة باستخدام قيم الامتصاص في مقايسة SRB.
استيراد البيانات الخام بما في ذلك تركيزات المعالجة، ومتوسط الامتصاص، والانحراف المعياري إلى البرنامج عن طريق محاذاة البيانات رأسياً. انقر فوق علامة التبويب إنشاء رسم بياني واختر أشرطة أخطاء مبعثر بسيطة. حدد أعمدة ورقة العمل كقيم رمز، ثم انقر فوق التالي.
في لوحة تنسيق البيانات، حدد أزواج X-Y وانقر على التالي. حدد أعمدة البيانات المطابقة في لوحة تحديد البيانات. انقر فوق إنهاء لإنشاء المؤامرة.
انقر نقراً مزدوجاً فوق المحور س لتعديل نوع المقياس في قياس المحور. تغيير نوع المقياس من خطي إلى سجل. تعديل رقم نطاق البداية والانتهاء إلى 0.01 و 200 على التوالي.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق أي مؤامرة مبعثر، اختر منحنى صالح، والذهاب إلى الفئة الفرعية معرفة المستخدم. حدد منحنى استجابة الجرعة. انقر فوق الأزرار التالية، ثم انقر فوق إنهاء.
انتقل إلى علامة التبويب التقرير، ثم تحقق من قيم n و k و R. تشغيل PCR كما هو مفصل في بروتوكول النص المصاحب. ثم الانتقال إلى الهضم المزدوج عن طريق الجمع بين خليط التفاعل، بما في ذلك الإنزيمات تقييد إكسو1 و Not1 واحد في أنبوب.
احتضان المخاليط لمدة ثلاث إلى أربع ساعات في حمام مائي 37 درجة مئوية. تشغيل المنتجات هضم مزدوج على هلام agarose 1٪. ثم قطع العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
تنقية منتجات PCR هضم مزدوج وناقلات لوسيفراز من العصابات مختط. مواصلة ربط منتجات PCR في ناقلات لوسيفيراز عن طريق إعداد 20 ميكرولترات من خليط التفاعل الربط بما في ذلك الحمض النووي ligase. لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنبوب لمدة 10 إلى 15 ثانية.
احتضان الربط في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها باستخدام دورة حرارية. في اليوم التالي، قم بإجراء التحويل عن طريق إضافة مخاليط الربط إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا مختصة. اضغط بلطف على الأنبوب وابقيه على الجليد لمدة 20 دقيقة.
بسرعة وبلطف نقل أنبوب إلى كتلة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. بعد الصدمة الحرارية، ضع الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة. انتشار الخلايا المختصة على لوحة LB أجار.
تنمو الخلايا المختصة في حاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، واختيار مستعمرة فردية وإعادة اصطناع الإشريكية في واحدة من أنابيب 8 قطاع التي تحتوي على المياه فائقة الخطورة، وتكرار هذه الخطوة لإعادة إنشاء E.coli من أربع إلى ثماني مستعمرات مختارة عشوائيا. نقل 25 ميكرولترات من تعليق الإشريكية القولونية إلى مجموعة أخرى من أنابيب 8 قطاع.
تنفيذ PCR مستعمرة باستخدام تعليق الإشريكية القولونية. إعداد المقايسة لوسيفراز في لوحة 24 جيدا. إضافة واحد إلى اثنين من عشر مرات إلى الخلايا الأربعة في وسائل الإعلام ثقافة الخلية 500 microliter لكل بئر.
بعد الحضانة بين عشية وضحاها، transfect 50 نانوغرام من ناقلات لوسيفيراز في الخلايا مع تقليد السيطرة أو تقليد ميكرورنا محددة باستخدام كاشف transfection. في اليوم التالي، اغسل داخل الآبار مرتين باستخدام محلول الفوسفات العازل. تطبيق 200 ميكرولترات من كاشف التحلل في الآبار والقيام بما فيه الكفاية تحلل الخلايا قبل قياس نشاط luciferase.
الحفاظ على لوحة تهتز لمدة 15 دقيقة على الأقل. نقل خمسة إلى 10 ميكرولترات من الخلايا في أنبوب جديد، وإضافة 100 ميكرولترات من الكاشف واحد وعلى الفور مزيج الحل عن طريق pipetting. ثم قراءة نشاط لوسيفراز اليراعات باستخدام مقياس الإضاءة لمدة 10 إلى 15 ثانية.
إضافة 100 ميكرولترات من الكاشف اثنين في نفس الأنبوب ثم مزيج عن طريق الأنابيب مرتين. وأخيرا، اقرأ نشاط رينيلا لوسيفيراز لمدة 10 إلى 15 ثانية باستخدام مقياس الإضاءة. يظهر RTPCR انخفاضًا كبيرًا في خلايا ميكرورنا-107 وPANC-1 وCAPAN-1 مقارنة بالخلايا HPNE.
وقد تم تنظيم مستويات ميكرورنا-301 بشكل كبير في خلايا PANC-1 وCAPAN-1، مقارنة بالخلايا HPNE. يوضح مقايسة SRB في هذه الدراسة بوضوح أن انتشار خلايا PANC-1 انخفض بعد ميكرورنا-107 يحاكي التكاثر. يظهر فحص 11 هدفًا متوقعًا محتملًا لـ microRNA-107 بوضوح أن synuclein gamma فقط ، أو SNCG ، وهو منظم إيجابي لنمو الخلايا السرطانية يتفاعل مباشرة مع خلايا microRNA-107 و PANC-1 ، مما يشير إلى أن ميكرورنا -107 يمكن أن ينظم بشكل سلبي انتشار خلايا PANC-1 عن طريق تعديل تعبير SNCG.
إن مقايسات انتشار الخلايا البالغة التي تستخدم الكيان القائم على التترا هيدرولوم وCFSE قابلة للتطبيق على فحص تأثير مثل محاكاة ميكرورنا، اعتمادا على أنواع الخلايا. استنادا إلى وظيفة التحقق التجريبي من microRNAs، مطلوب مراجعة منهجية لقاعدة البيانات وبرنامج التنبؤ الهدف لتضييق قائمة الأهداف المرشحة قبل التكهنات لوسيفيراز. لتقييم الكفاءة الجمع بين microRNAs مع الأدوية المضادة للسرطان، فمن المفيد لحساب القيم IC المعدلة استنادا إلى بروتوكول لدينا لتقييم مؤشر الجمع.
