هذا البروتوكول يسمح لنا لتحديد ما إذا كان خطأ المتغيرات في الجينات البشرية التي ترتبط بأمراض تؤثر على وظيفة البروتين. هذا من الصعب إنجاز حسابيا حتى مع دولة من بين أحدث الخوارزميات. هذه التقنية تسمح بتحليل سريع للمتغيرات missense في البروتينات البشرية باستخدام نظام في الجسم الحي Drosophila melanogaster الذي هو أسرع وأكثر كفاءة من حيث التكلفة من الكائنات الحية نموذج الفقاريات.
إن إثبات أن متغيرًا معينًا يؤثر على وظيفة البروتين يساهم بشكل مباشر في تشخيص الأمراض النادرة ويعمل كنقطة انطلاق لتحليل آلية المرض والعلاجات المحتملة. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص عند دراسة المتغيرات المرتبطة بأمراض نادرة ، ولكن يمكن تطبيقه على الأمراض الأكثر شيوعًا مثل التوحد والسرطان. يمكن أن يكون تحديد الأنماط الظاهرية القابلة للاستنساخ في الذباب التي تعكس وظيفة البروتين أمرًا صعبًا.
قد تختلف الأنماط الظاهرية من جين إلى آخر ويمكن أن تكون خفية. يمكن إجراء الدراسات الوظيفية للمتغيرات في البروتينات البشرية باستخدام دروسوفيليا على أساس تجارب الإنقاذ أو دراسات فرط التعبير. قبل البدء في الإجراء، وجمع المعلومات حول الجينات البشرية من الفائدة والعظام لها كائن حي نموذجي.
لاختبار وظيفة متغير من قبل فرط التعبير عن المرجعية والبروتينات البشرية المتغيرة في النظام البصري يطير، وتوليد الذباب المعدلة وراثيا التي تعبر عن مرجع أو متغير cDNAs الإنسان من الفائدة تحت سيطرة تسلسل تنشيط Gal4 المنبع أو نظام UAS. لتحديد خط Gal4 محدد للتعبير عن البروتينات البشرية في أنسجة ذبابة محددة، عبر ثلاث إلى خمس الإناث العذراء من خط Gal4 مع ثلاثة إلى خمسة ذكور من كل من خطوط CDNA الإنسان المعدلة وراثيا في قوارير واحدة أو في التكرارات. نقل الصلبان كل يومين إلى ثلاثة أيام للحصول على أكبر عدد من الحيوانات eclosing من صليب واحد ممكن وفحص الحيوان eclosed تحت مجهر تشريح لتحديد أي اختلافات بين المرجعية وسلالات متغير.
إذا كان هناك عيب مرئي، صورة الذباب لتوثيق الأنماط الظاهرية. لتوليد الذباب لاختبار العيوب الوظيفية في النظام البصري، عبر الإناث العذراء من خط rhodopsin 1 Gal4 إلى الذكور مع مرجع أو البديل UAS الإنسان cDNA transgenes للتعبير عن البروتينات البشرية من الاهتمام في photoreceptors R1 إلى R6 في شبكية العين ذبابة. بمجرد أن يبدأ الذباب في الإكلاج ، وجمع النسل في قوارير جديدة وإعادة القنينات إلى حاضنة تعيين إلى درجة الحرارة التجريبية المناسبة لمدة ثلاثة أيام إضافية للسماح للنظام البصرية لتنضج.
في نهاية الحضانة ، قم بشل الذباب باستخدام طريقة تخدير مناسبة ولصق جانب واحد من كل ذبابة بلطف على شريحة مجهر زجاجي. بعد إنشاء تلاعب الكهربائي، ضع شعري زجاجي 1.2 ملليمتر في جرة إبرة وكسر أنبوب الشعيرات الدموية للحصول على اثنين من الأقطاب الحادة المجوفة المدببة بأقطار أقل من 0.5 ملليمتر. ملء الشعيرات الدموية مع محلول ملحي 100 ميليمولار مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء وشريحة الشعيرات الدموية الزجاجية على أقطاب الأسلاك الفضية.
المشبك الشعيرات الدموية في مكان وتأقلم الذباب إلى الظلام التام لمدة 10 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. في نهاية التعود، ضع الشريحة التي تحتوي على الذباب على جهاز التسجيل وحركة المناقربين الذين يحملون الإشارة وتسجيل الأقطاب بالقرب من ذبابة الفائدة. مشاهدة غيض من القطب، ضع بعناية القطب المرجعي في صدر الذبابة اختراق بشرة ووضع القطب تسجيل على سطح العين.
للتسجيلات الكهربائية الناجحة، الحرص على تطبيق كمية مناسبة من الضغط على تسجيل القطب بحيث أنه يسبب غمازة صغيرة دون اختراق العين. عندما تم وضع الأقطاب الكهربائية، إيقاف الضوء الأساسي لمدة ثلاث دقائق لإعادة التكيف الذباب إلى البيئة المظلمة. في نهاية فترة إعادة التكدّس، افتح الغالق واغلقه مرة واحدة في الثانية لمدة 20 ثانية مسجلاً الرسوم الكهربائي من 15 ذبابة على الأقل لكل شريحة لكل نمط جيني لكل حالة باستخدام نفس الأقطاب الكهربائية.
عندما تكون التسجيلات من الذباب المرجعي والمتغير كاملة، قارن التسجيلات الكهربائية من المرجع، البديل والضوابط لتقييم الاختلافات. ثم تقييم البيانات electroretinogram للتغيرات في على العابرين، إزالة القطبية، قبالة العابرين وإعادة القطب. في هذه التجربة التمثيلية، أجريت دراسات تستند إلى فرط التعبير عن TBX2 منذ TBX2 مرجع الإنسان لم يتمكن من استبدال وظيفيا جين ذبابة تقويم العظام مما يجعل استراتيجيات الإنقاذ القائم مستحيلة.
عندما كان المرجع TBX2 الإنسان overexed في العين النامية وأجزاء من الدماغ باستخدام Gal4 العين، وفرط التعبير يؤدي إلى ما يقرب من 85٪ فتاكة وانخفاض كبير في حجم العين. وعلى النقيض من ذلك، فإن ترانسجين المتغير أقل قوة في التسبب في الفتك ويحفز على نمط ظاهري صغير للعين يستخدم نفس السائق في ظل ظروف تجريبية متطابقة مما يشير إلى أن البديل يؤثر على وظيفة البروتين. بالإضافة إلى ذلك، عندما يكون TBX2 مرجع الإنسان هو overexed في photoreceptors باستخدام rhodopsin Gal4، وفرط التعبير يسبب تغيير كبير في تتبع electroretinogram.
هذا النمط الظاهري هو أكثر اعتدالا عندما يتم التعبير عن البروتين البديل تقديم مزيد من الأدلة على أن البديل من الفائدة يؤثر على وظيفة البروتين في الجسم الحي. من المهم أن نلاحظ أن كل جين فريد من نوعه لذلك لا توجد تجربة واحدة يمكن أن تقيم تأثير جميع المتغيرات المرتبطة بالمرض. وبالإضافة إلى العمل مع نظم الصحة الذاتية البشرية، يمكن للمرء أيضا أن يحدد ما إذا كان لهذا البديل عواقب وظيفية من خلال إدخال متغيرات مماثلة في بقايا حفظها تطوريا من جين الذبابة التقويمية.
وباستخدام هذه الطريقة، ساهمنا في عدد من دراسات اكتشاف الجينات للأمراض البشرية بالتعاون مع شبكة الأمراض غير المشخصة ومجموعات أخرى.
