فإن الكتاب أن نعترف بتمويل من اليابان العلوم واستكشافية بحوث التكنولوجيا وكالة للتكنولوجيا المتقدمة (JST-ايراتو)، والطاقة الجديدة والتكنولوجيا الصناعية منظمة التنمية (نيدو)، وبرنامج تعزيز الابتكار الاستراتيجي عبر الوزاري (SIP)، اليابان .

1. إعداد صياغات الببتيد القائم على <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول الأوراق المالية من كل الببتيد على النحو التالي: (KH) 9 -BP100 (1 ملغ / مل أو 800 نانومتر)، Cytcox- (KH) 9 (1 ملغ / مل)، BP100 (1 ملغ / مل) و (BP100) 2 K 8 (70 ميكرومتر). وزن الكمية المطلوبة من كل الببتيد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ويضاف الماء عالى النقاء تعقيمها حل الببتيد. تخلط جيدا من قبل pipetting المتكررة حتى يتم الحصول على حل واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم وتنقية DNA البلازميد (PDNA)، الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsDNA) و RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) وفقا لمنهجيات الجزيئية القياسية. في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، وجعل الحلول الأسهم مع تركيز 1 ملغ / مل (PDNA وdsDNA) أو 400 نانومتر (الرنا المزدوج الجديلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون البروتين مع تركيز 7 ميكرومتر، عن طريق إذابة 1 ملغ من البروتين (على سبيل المثال، الكحول نازعة، ADH) مسحوق في 1 مل من محلول كربونات الصوديوم (0.1 م، ودرجة الحموضة 9). تسمية البروتين مع fتحقيقات luorescent مثل رودامين B (رهب) وفقا لبروتوكولات موحدة لتمكين التصور المجهري للبروتين تسليمها إلى الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين مكونات كل منها في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيبات الببتيد PDNA تستهدف السيتوبلازم، إضافة 6.4 ميكرولتر من (KH) 9 -BP100 (1 ملغ / مل) إلى 20 ميكرولتر من PDNA (1 ملغ / مل)، وتخلط جيدا من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. إضافة 773.6 ميكرولتر من الماء عالى النقاء تعقيمها لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر. استخدام بناء PDNA مصممة للتعبير النووي (P35S-RLuc-TNOS، الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيبات الببتيد PDNA تستهدف الميتوكوندريا، إضافة 6.6 ميكرولتر من Cytcox- (KH) 9 (1 ملغ / مل) إلى 20 ميكرولتر من PDNA (1 ملغ / مل)، وتخلط جيدا من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية ثم قم بإضافة 2.4 ميكرولتر من BP100 (1 ملغ / مل). يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في 256؛ مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى. إضافة 771 ميكرولتر من الماء عالى النقاء تعقيمها لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر. استخدام بناء PDNA مصممة للتعبير الميتوكوندريا (pDONR-COX2: rluc، الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيبات الببتيد لمكافحة dsDNA، إضافة 5.1 ميكرولتر من (KH) 9 -BP100 (1 ملغ / مل) إلى 8 ميكرولتر من dsDNA (1 ملغ / مل)، وتخلط جيدا من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. إضافة 786.9 ميكرولتر من الماء عالى النقاء تعقيمها لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيبات الببتيد الرنا المزدوج الجديلة، إضافة 50 ميكرولتر من (KH) 9 -BP100 (800 نيوتن متر) إلى 50 ميكرولتر من الرنا المزدوج الجديلة (400 نيوتن متر) وتخلط جيدا من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. إضافة 700 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيبات الببتيد من البروتين، إضافة 16 ميكرولتر من (BP100) 2 ك 8 (70 ميكرومتر) إلى 16 ميكرولتر من ADH (7 ميكرون) وتخلطكذلك من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. إضافة 768 ميكرولتر من الماء عالى النقاء تعقيمها لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للتركيبات لتحقيق الاستقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. </li></ol> 2. توصيف تركيبات الببتيد القائم على <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل حل (800 ميكرولتر) في كفيت لتحليل ديناميكية تشتت الضوء (DLS). تحديد القطر والتشتت المتعدد مؤشر الهيدروديناميكية المجمعات شكلت مع nanosizer زيتا، وذلك باستخدام 633 نانومتر وني الليزر عند 25 درجة مئوية مع زاوية الكشف ارتدادي من 173 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد قياسات حجم، ونقل كل حل (800 ميكرولتر) في خلية الشعرية مطوية لقياس المحتملة زيتا في المعلمات الافتراضية ثابت العزل الكهربائي، معامل الانكسار واللزوجة من الماء عند 25 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة كمية صغيرة من حل معقد، وتستخدم لتحليل دائرة الأراضي والمساحة، من خلال مجهر القوة الذرية (AFM). إيداع 10 ميكرولتر من حل معقد على سطح المشقوق تتعرض حديثا من ورقة الميكا وترك الميكا في الهواء بين عشية وضحاها الجافة في طبق بتري بلاستيكية مغطاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة من المجمعات في الهواء عند درجة حرارة 25 درجة مئوية باستخدام ناتئ السيليكون مع ثابت ربيع 1.3 نيوتن / متر في الوضع 27،28 التنصت. </li></ol> 3. تسلل أوراق النبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 3 أسابيع النباتات التي تزرع في التربة القديمة (نبات الأرابيدوبسيس thaliana 24، النيكوتين benthamiana 24 أو الحور 26). Transfect لا يقل عن 3 أوراق لتكون بمثابة ثلاث نسخ لتقدير حجم التعبير الجيني أو تسليم البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 1 مل حقنة بلاستيكية needleless مع 100 ميكرولتر من حل معقد للترنسفكأيشن من ورقة واحدة. ضع غيض من حقنة على سطح مجافي المحور من ورقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على طرف الحقنة ضد ورقة قليلا وتضغط على المكبس حقنة ببطء بينما تمارس الضغط مواجهة مع طإصبع ndex اليد من مادة اللاتكس القفاز من الجانب الآخر. تسلل ناجحة ويمكن ملاحظة مثل انتشار منطقة غارقة في الماء في ورقة. تسمية أوراق تسلل لسهولة تحديد الهوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ورقة transfected لفترات الأمثل التالية تسلل مع الببتيد PDNA (12 ساعة)، الببتيد لمكافحة dsDNA (12 ساعة)، الببتيد الرنا المزدوج الجديلة - مستحضرات (9 48 ساعة)، والببتيد بروتين (6 ساعات) وفقا للشروط التالية: 16 ساعة ضوء / 8 ساعات الظلام في 22 درجة مئوية لمدة A. thaliana والحور، أو 24 ساعة ضوء ثابت في 29 درجة مئوية لمدة benthamiana N.. </li></ol> 4. تقييم كفاءة ترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال كله transfected أوراق النباتات الصغيرة (على سبيل المثال.، A. thaliana) أو قسم 1 سم 2 من منطقة تسلل للنباتات الكبيرة (على سبيل المثال، N. benthamiana). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجارب ترنسفكأيشن باستخدام Renilla وسيفيراز (Rluc) ناقلات مراسل، وتحديد transfectioكفاءة ن كميا باستخدام أدوات Rluc الفحص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل ورقة رفعه أو قسم ورقة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 100 ميكرولتر من 1 × Rluc الفحص الاحتياطي تحلل في أنبوب. بنفس الطريقة، وإعداد لست] من الأوراق السيطرة غير transfected (ثلاث نسخ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن ورقة باستخدام مدقة التجانس واحتضان المحللة الناتجة عند 25 درجة مئوية لمدة 6-10 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي المحللة في 12470 × ز في microcentrifuge لمدة 1 دقيقة. نقل 20 ميكرولتر من المحللة تطهيرها من بئر في صفيحة 96-جيدا، واستخدام حجم المتبقية لتحديد مقدار تركيز البروتين الكلي باستخدام الفحص كيت BCA البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 1 × Rluc الفحص الركيزة (مخفف باستخدام العازلة Rluc الفحص) في البئر ومزيج من قبل pipetting بطيئة. وضع صفيحة في قارئ صفيحة المتعدد والشروع في القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح التلألؤ الخلفية (يعني من لاثلاث نسخ) من التلألؤ كل عينة التجريبية التي استمرت transfected ن. حساب نسبة من معان ضوئي (وحدات الخفيفة النسبية، RLU) لكمية من البروتين (ملغ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجارب ترنسفكأيشن باستخدام الأخضر بروتين فلوري (GFP) ناقلات مراسل أو البروتين fluorescently المسمى (على سبيل المثال، ADH-رهب)، ومراقبة مضان باستخدام متحد البؤر مجهر المسح بالليزر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع حواف ورقة كاملة (للمساعدة في إزالة الفراغات الهوائية)، في حين أن ورقة مقطوع يمكن استخدامها كما هي. إزالة المكبس من حقنة 10 مل ووضع كل ورقة أو ورقة القسم رفعه في المحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الغطاس ودفعها برفق إلى أسفل الحقنة دون سحق ورقة. سحب المياه في حقنة حتى يتم ما يقرب من نصف ملأها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشير حقنة صعودا ودفع في المكبس لإزالة الهواء من الحقنة من خلال طرف. تغطية غيض من حقنة وسحب المكبس ببطء لطرد الهواء من مرجةF. كرر هذه العملية عدة مرات حتى تظهر ورقة شفافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي سطح شريحة المجهر مع شريط لاصق. قطع مساحة مربعة على الشريط كبيرة بما يكفي لاستيعاب العينة ورقة باستخدام شفرة، وقشر قطعة مربعة من الشريط قبالة مع ملقط لإنشاء غرفة العينة. فإن الشريط بمثابة فاصل بين الشرائح وساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ورقة في غرفة مع سطح مجافي المحور تواجه التصاعدي وملء منطقة الغرفة المتبقية مع الماء. ختم ورقة داخل الغرفة مع ساترة الزجاج وتأمين حواف ساترة مع شريط لاصق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص العينة ورقة باستخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر تحت هدف 40X أو الهدف الغمر 63X المياه. GFP أو رهب مضان يمكن تصور في موجات الإثارة من 488 نانومتر أو 555 نانومتر، على التوالي. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Altman, A., Hasegawa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , (2011).</li><li>Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+molecular+farming:+systems+and+products.">Plant molecular farming: systems and products.</a> Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells.">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Nature. 327, 70-73 (1987).</li><li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation.">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).</li><li>Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transformation+of+plant+protoplasts+with+Ti-plasmid+DNA.">In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.</a> Nature. 296, 72-74 (1982).</li><li>Birch, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation:+problems+and+strategies+for+practical+application.">Plant transformation: problems and strategies for practical application.</a> Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).</li><li>Newell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+technology.+Developments+and+applications.">Plant transformation technology. Developments and applications.</a> Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).</li><li>Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+gene+transfer+from+transgenic+plants+to+terrestrial+bacteria--a+rare+event?.">Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event?.</a> FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).</li><li>Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+25,+Engineering+peptide-based+carriers+for+drug+and+gene+delivery.">Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery.</a> Engineering in Translational Medicine. , 667-689 (2014).</li><li>Nitta, S., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+nanoparticles+for+drug/gene+delivery+and+tissue+engineering.">Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).</li><li>Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(amino+acid)s/polypeptides+as+potential+functional+and+structural+materials.">Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials.</a> Polym. J. 47, 537-545 (2015).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+delivery+systems+of+bioactive+molecules.">Silk-based delivery systems of bioactive molecules.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).</li><li>Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+silk+protein-based+gene+delivery+systems.">Bioengineered silk protein-based gene delivery systems.</a> Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).</li><li>Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+nanocarrier+for+macromolecule+delivery+in+living+cells.">Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells.</a> IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).</li><li>Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+peptide+Bp100+as+a+cell-penetrating+tool+for+the+chemical+engineering+of+actin+filaments+within+living+plant+cells.">Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells.</a> ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+gene+carriers+with+cell+membrane+destabilizing+peptides.">Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides.</a> Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).</li><li>Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+mediated+by+recombinant+silk+proteins+containing+cationic+and+cell+binding+motifs.">Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs.</a> J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).</li><li>Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+nanocomplexes+with+tumor-homing+peptides+for+tumor-specific+gene+delivery.">Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery.</a> Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).</li><li>Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+silk-based+gene+carriers+for+tumor+cell-specific+delivery.">Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery.</a> Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).</li><li>Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+introduction+into+the+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana+via+peptide-based+carriers.">Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers.</a> Sci. Rep. 5, 7751 (2015).</li><li>Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+method.">Plant transformation method.</a> Patent. , (2015).</li><li>Ng, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+proteins+in+intact+plants+via+fusion+peptides.">Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides.</a> PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).</li><li>Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+gene+delivery+into+plant+cells+using+designed+peptide+carriers.">Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers.</a> Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).</li><li>Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+introduction+into+intact+plants+using+peptide-DNA+complexes.">Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes.</a> Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).</li><li>Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+gene+silencing+in+plants+via+synthetic+dsRNA+and+carrier+peptide.">Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+processes+of+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric+acid]+single+crystals+revealed+by+atomic+force+microscopy:+effects+of+molecular+weight+and+second-monomer+composition+on+erosion+rates.">Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates.</a> Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biopolyester+depolymerase+on+silicon+wafer+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+single+crystal+revealed+by+real-time+AFM.">Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM.</a> Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).</li><li>Kawai, S., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+procedure+for+DNA+transfection+with+polycation+and+dimethyl+sulfoxide.">New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).</li><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li><li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+transfection+by+physical+concentration+of+DNA+at+the+cell+surface.">Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface.</a> Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).</li><li>Boynton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+transformation+in+Chlamydomonas+with+high+velocity+microprojectiles.">Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.</a> Science. 240, 1534-1538 (1988).</li><li>Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+transformation.">Plastid transformation.</a> Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).</li><li>Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+plastids+in+higher+plants.">Stable transformation of plastids in higher plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).</li><li>Liu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+plant+mutants+with+large+genomic+DNA+fragments+by+a+transformation-competent+artificial+chromosome+vector+accelerates+positional+cloning.">Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).</li><li>Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shorter+T-DNA+or+additional+virulence+genes+improve+Agrobactrium-mediated+transformation.">Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation.</a> Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).</li><li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism.">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li><li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+wheat+(Triticum+spp.).">Transgenic wheat (Triticum spp.).</a> Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وتناقش الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي تم التعرف تجريبيا. تسلل حقنة، وعرض الصيغ القائمة على الببتيد في الأجواء داخل أوراق النبات من خلال الثغور. لضمان امتصاص القصوى من الحل، يجب إجراء عملية تسلل خارجا عندما النباتات تحت ظروف تؤدي إلى فتح الثغور أي.، مع توفير ما يكفي من المياه وذلك خلال الفترة الخفيفة. وفيما يتعلق إعداد مجمعات ترنسفكأيشن، لتركيبات التي تنطوي على مزيج من اثنين من الببتيدات (لاستهداف الميتوكوندريا تسليم DNA)، وتسلسل لإضافة كل عنصر بالغ الأهمية، وينبغي ألا مقلوب. هناك العديد من التعديلات معقولة لهذا الإجراء. خيار آخر للتسلل خلايا النبات هو استخدام تسلل الفراغ، التي هي قادرة على تقديم حل معقد إلى النباتات الكاملة و / أو الأنسجة جزئية بما في ذلكالخلايا الإنشائية قمي. لهذا الإجراء البديل، وغرقت الشتلات في حل ترنسفكأيشن، وبناء على ضغط الناتجة عن الفراغ، وأجبرت المجمعات الببتيد البضائع عبر الثغور وفي الخلايا النباتية (Yoshizumi، T.، بيانات غير منشورة). التعبير الجيني عابرة، بناء على الدراسات التي تستخدم الخلايا الحيوانية، وقد تبين لزيادة مع ارتفاع تركيز الحمض النووي 29-31. من المهم أن نلاحظ أن نسبة الببتيد إلى الحمض النووي يؤثر على الخصائص الفيزيائية الحيوية (الحجم، وتهمة السطحية) من المجمعات (الشكل 4)، الأمر الذي يؤثر كفاءة ترنسفكأيشن. وبالتالي، يجب على النسبة المثلى أن يستمر حتى مع زيادة تركيز الحمض النووي. واحدة من المزايا الرئيسية في استخدام الببتيدات كعامل توصيل الجينات / البروتين هو أن تسلسله هو قابل للضبط على الوفاء الوظيفة المطلوبة. على سبيل المثال، المجال استهداف الميتوكوندريا من الببتيد الناقل وصفها في هذا مسمارذ يمكن استبدالها مع تسلسل chloroplastic أو استهداف peroxisomal لتوطين هذه العضيات. في حين تحول بلاستيدات الخضراء ممكن في العديد من المصانع التي تستخدم biolistics 32-34، يمكن أن أيا من الأجرعية ولا طريقة biolistic إدخال جينات وراثية في الميتوكوندريا أو عضيات أخرى إلى جانب النواة (الجدول 2). لا توجد قيود المضيف مجموعة جامدة لترنسفكأيشن القائم على الببتيد، على عكس طريقة المستندة الأجرعية (الجدول 2). وحتى الآن، تركيبات لترنسفكأيشن من A. thaliana، N. benthamiana والحور وقد تم تحسين (الجدول 1)، ولكن يمكن أيضا أن تطبق أسلوب النيكوتين تبغ، نباتات الطماطم الصغيرة توم والأرز (على أساس التجارب الأولية)، وغيرها من النباتات أحادية وذوات الفلقتين. حتى الآن، ليس هناك قيود معروفة في حجم التحوير عند استخدام الببتيدات لناقلات الصورة ترنسفكأيشن. في المقابل، تم العثور على جزيئات الحمض النووي كبيرة للحد من كفاءة تحويل الأجرعية طرق بوساطة 35،36، والحد الأقصى لحجم العلوي لالجينات المحورة ما يقرب من 200 كيلو بايت تم الإبلاغ 37-39. باستخدام biolistics، من ناحية أخرى، قد تكون المنفصمة شظايا الحمض النووي كبيرة أثناء إعداد أو تسليم في النباتات 38. على الرغم من عدم الحد الأعلى وقد تم تحديد التحول biolistic حتى الآن، تم العثور على القيود المادية لتقييد حجم الحمض النووي التي يمكن نقلها إلى أقل بكثير من 150 كيلو بايت 40. الفوائد الرئيسية لاستخدام النظام القائم على الببتيد لنقل الجينات بالمقارنة مع النهج القائمة توظيف إما الأجرعية أو قصف microprojectile، التي نوقشت أعلاه، وتتلخص في الجدول 2. وجود عدد قليل من القيود لهذا الأسلوب كما هو عليه. أولا، تستهدف تقديم PDNA إلى العضيات محددة، مثل معهد ماساتشوستس للتكنولوجياochondria، وقد ثبت ذلك ممكنا من خلال مزيج بسيط من، متواليات اختراق الخلية وعضية العبور ملزم الحمض النووي على الرغم من أن الكفاءة كانت منخفضة. يمكن أن يتم الكشف عن التعبير التحوير، من خلال الفحص المجهري متحد البؤر، إلا في عدد قليل من السكان الميتوكوندريا في الخلايا. وبالتالي، هي مزيد من التعديلات اللازمة ل: (ط) تعزيز النبات من أكثر المجمعات عبر الخلية / غشاء organellar، و (ب) تحسين التفكك ونقل PDNA من الببتيد الناقل في العضية المستهدفة للتعبير. ثانيا، وذلك باستخدام هذا النظام تسليم الحمض النووي، وقد تحقق التعبير عابرة من الجينات مراسل خارجية بنجاح في مقصورة عصاري خلوي والميتوكوندريا من الخلايا. لم يثبت التأسيس مستقر والتعبير عن الجينات التي أدخلت في محطة نووية / الجينوم organellar بعد، ولكن نظرا لعدم وجود استراتيجيات اختيار مناسبة. ومع التسليم بأن هناك مجالات للتحسين أو مزيد من دevelopment، الاستراتيجية المستمدة من الببتيد هو موضح هنا تبقى تقنية بسيطة وتنوعا الذي مهد الطريق لتسليم البضائع المختلفة إلى أنواع النباتات المتنوعة.

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant's own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

<table><tbody><tr><td>(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;-BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-K&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-&lt;br/&gt; KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>1 ml and 10 ml Plastic Syringes</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Flat-Bottom Plate</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td><td>No. 835</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Seiko Instruments Inc.</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>For excision of leaves into 1-cm diameter disks</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>Folded Capillary Cell</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shimizu Akira Inc.</td><td>Stainless pincet 150</td><td></td></tr><tr><td>Homogenization Pestle</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Nisshin EM Co., Ltd.</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Research&amp;reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri Dish</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay Kit</td><td>Promega corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B Isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade and Handle</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Tip Cap</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Potentiometer</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

أدخلت مجموعة من الشحنات الأحماض والبروتينات النووية بنجاح في النباتات المختلفة باستخدام الببتيدات التي صممت لناقلات التسليم. أدت التفاعلات كهرباء بين الببتيدات الموجبة والشحنات السالبة في تشكيل المجمعات ترنسفكأيشن التي يمكن أن تسلل مباشرة إلى أوراق النبات باستخدام حقنة needleless (الشكل 1). وترد الصيغ الأمثل (تحدد تجريبيا في هذه الدراسات 21،23-26) لترنسفكأيشن من الخلايا النباتية في الجدول رقم 1، حيث يتم تمثيل كل نوع من مجموعة واسعة من البضائع تسليمها (PDNA، dsDNA، الرنا المزدوج الجديلة والبروتين). وكانت قطر يعني من كل الصيغ القائمة على الببتيد في نطاق تقريبي من 150-300 نانومتر. واستنادا إلى تحليل دائرة الأراضي والمساحة، عرض جميع التركيبات polydispersities حجم منخفضة نسبيا، مشيرا الى ان المجاميع الببتيد البضائع شكلت لديها توزيع حجم موحد. والأشكال التضاريسية منالمجمعات بين الببتيد وPDNA (الشكل 2A) أو البروتين (الشكل 2B)، على الميكا، تم تصوير كتبها فؤاد. وقد لوحظت المجمعات كروية متجانسة لكل من تركيبات الببتيد PDNA والببتيد من البروتين، وذلك بالاتفاق مع البيانات من القياسات DLS. من حيث إمكانات زيتا من المجمعات (الجدول 1)، وكان pDNA- والمجمعات المستمدة dsDNA صافي الرسوم سطح السلبي في حين أن المجمعات القائمة على الرنا المزدوج الجديلة تهمة سطح شبه محايدة. المجمعات الببتيد من البروتين، من جهة أخرى، وجهت بشكل إيجابي. تم تقييم كفاءات الببتيد PDNA وتركيبات الببتيد لمكافحة dsDNA في التوسط في ترنسفكأيشن من A. thaliana أو benthamiana N. كما نظم مصنع نموذج كمي ونوعي. كان يعمل في RLuc التعبير الجيني فحص لتقدير مستويات التعبير الجيني (الجدول 1)، لذلك، لهذا PDNA التجربة أوdsDNA ترميز الجين RLuc يجب أن تستخدم لcomplexation مع الببتيدات الناقل منهما. باستخدام (KH) 9 -BP100 / صياغة PDNA، والتسليم المستهدفة النووية والتعبير عن PDNA لا يمكن أن يتحقق، وبعد فترة حضانة من 12 ساعة، مع RLU / قيمة ملغ يقدر حوالي 1 × 10 5. للتسليم استهداف الميتوكوندريا والتعبير عن PDNA، وهو مزيج من الببتيدات، Cytcox- (KH) 9 و BP100، مطلوب لتكوين معقد. مع نفس فترة حضانة الأمثل من 12 ساعة، ولكن تم تحقيق مستوى أدنى بكثير من ترنسفكأيشن (حوالي 1 × 10 3 RLU / ملغ). وفي الوقت نفسه، كان مطلوبا الفترة المماثلة الحضانة (12 ساعة)، ومستوى التعبير الجيني (حوالي 1 × 10 3 RLU / ملغ) / سجلت للمجمعات تستند dsDNA، كما وضعت باستخدام (KH) 9 -BP100 الببتيد. وأجريت تقييمات نوعية في التعبير الجيني من خلال الملاحظة المجهرية المباشرة للأوراق تعامل مع prepar المجمعاتإد باستخدام PDNA أو dsDNA ترميز الجين مراسل GFP. في الخلايا transfected مع المجمعات غير المستهدفة الببتيد PDNA، ونشر مخضر المقابلة مع لوحظ التعبير GFP بشكل واضح وجدت في توطين في العصارة الخلوية (الشكل 3A). كانت اختلافات واضحة في نمط توطين مضان GFP اضحة في خلايا تسلل مع المجمعات الببتيد PDNA استهداف الميتوكوندريا. هنا، كان مخضر منقط أن colocalize مع وصمة عار الميتوكوندريا واضحة، مما يؤكد خصوصية التعبير الجيني حصرا في حجرة الميتوكوندريا من الخلايا (الشكل 3B). في حالة تركيبات الببتيد من البروتين، وتصريف البضائع البروتين (ADH) إلى fluorophore (رهب) تمكين التصور من البروتين تسليمها في حجرة داخل الخلايا. في غضون فترة حضانة قصيرة من 6 ساعات، تم العثور على بروتين ADH-رهب (الأزرق) ليتم توزيعها في جميع أنحاءالعصارة الخلوية وفجوة من الخلايا تسلل (الشكل 3C). وفي الوقت نفسه، يمكن أن يتحقق أسفل اللائحة السريع والفعال للتعبير الجينات في النباتات المختلفة باستخدام تركيبات الببتيد الرنا المزدوج الجديلة. في التجربة الأولى، تم اختراق ورقة A. thaliana مع الببتيد الرنا المزدوج الجديلة مجمعات لإسكات الجينات كالكون سينسيز (كلية العلوم الصحية) مسؤولة عن الأنثوسيانين (الصبغة الحمراء) الحيوي في ظل ظروف الجفاف. الفرق في مظهر A. thaliana يترك تحت العادي (الشكل 3D، أ) وظروف الجفاف (الشكل 3D، ب) تقدم وسيلة سهلة لتقييم كلية العلوم الصحية إسكات باستخدام صياغة الببتيد الرنا المزدوج الجديلة الأمثل (السهم 1 يشير إلى المنطقة تسلل). في التجربة الثانية، تم اختراق المجمعات الببتيد الرنا المزدوج الجديلة في أوراق المعدلة وراثيا A. thaliana التعبير عن بروتين فلوري أصفر (YFP). يمكن أن ينظر إلى انخفاض واضح في التعبير YFP في خلايا البشرة 9 ساعة صمعاهدة الفضاء الخارجي ترنسفكأيشن (الشكل 3E، F). تم التحقق من فعالية صياغة في التعبير الجيني الذي ينظم عليها في نظام النباتية المختلفة (الحور، 12 ساعة بعد ترنسفكأيشن) أيضا (الشكل الجيل الثالث 3G، H). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> الشكل 1: صياغات استنادا الببتيد من أجل تسليم الأحماض النووية والبضائع البروتين في النباتات الحية. تتكون الببتيدات الناقل مصممة من polycations مترافق إلى اختراق الخلية أو تسلسل عبور organellar. Polycations تمكن ملزمة و / أو التكثيف من البضائع المشحونة سلبا وكذلك الهروب من مقصورة endosomal التالية استيعاب داخل الخلايا. وتوسطت تسليم البضائع إلى داخل الخلايا وبالتالي إلى العضيات المحددة من قبل خلية اختراق تسلسل وتسلسل عبور organellar، على التوالي. الشحنات المختلفة التي يمكن أن تكون ناجحهسلمت LLY في المصنع تشمل الأحماض النووية مثل PDNA، dsDNA والرنا المزدوج الجديلة، وكذلك البروتينات نموذج مثل زلال المصل البقري (BSA)، نازعة الكحول (ADH) والسترين (البديل من البروتين الفلوري أصفر). الجزيئات النشطة بيولوجيا قادرة على شكل مجمعات ترنسفكأيشن مع تقارن الببتيد عبر التفاعلات كهرباء، والتي يتم تقديمها في أوراق النبات عن طريق التسلل حقنة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> الشكل 2: الأشكال التضاريسية من تركيبات استنادا الببتيد. (A) AFM السعة صورة (KH) 9 -BP100 صياغة / PDNA في N / P 0.5. (ب) صورة ارتفاع AFM من (BP100) 2 ك 8 صياغة / ADH في راتي الرحىس 10. مستنسخة بإذن من مصادر منشورة 23،24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> الشكل (3): مجهرية تقييم ترنسفكأيشن الكفاءة باستخدام محسن صياغات القائم على الببتيد. (A) عصاري خلوي GFP التعبير (الأخضر)، والتمييز بوضوح بين تألق ذاتي بلاستيدات الخضراء (الأحمر)، لوحظ في خلايا نسيج الورقة المتوسط الاسفنجية من A. thaliana يترك تسللوا مع (KH) 9 صياغة -BP100 / PDNA (N / P 0.5 و 12 ساعة ). تم الكشف عن (B) التعبير GFP (الأخضر) في الميتوكوندريا (الحمراء) في خلايا البشرة من أوراق A. thaliana تسلل مع Cytcox- (KH) 9 / BP100 / صياغة PDNA (N / P 0.5 لكل ببتيده؛ 12 ساعة). وأظهرت صور مكبرة من الميتوكوندريا مع التعبير GFP في لوحة اليمينية المتطرفة. (ج) تسليم ADH-رهب (الأزرق) إلى خلايا نسيج الورقة المتوسط الاسفنجية من A. thaliana يترك بوساطة (BP100) 2 ك 8 في نسبة الرحى الببتيد / البروتين من 10، تصور 6 ساعة بعد تسلل. (D) ورقة A. thaliana قبل (أ) وبعد (ب) العلاج (KH) 9 -BP100 / صياغة الرنا المزدوج الجديلة (نسبة المولي 2 و 48 ساعة)، والتي أسفرت عن قمع المسار الحيوي الأنثوسيان. وقد تسلل صيغة مشابهة تحتوي على GFP5 الرنا المزدوج الجديلة في ورقة عن السيطرة السلبية (ج). سهام 1 و 3 تشير إلى منطقة مخترقة بينما السهام 2 و 4 تشير إلى منطقة غير مخترقة داخل ورقة. (E) A. thaliana يترك التعبير عن بروتين أصفر فلوري (YFP) و (F) وتقلص مضان YFP التالية تسلل مع<html> (KH) 9 -BP100 / صياغة الرنا المزدوج الجديلة (نسبة المولي 2، 9 ساعة). (G) أوراق الحور المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين أصفر فلوري (YFP) و (H) وتقلص YFP مضان بعد تسلل مع (KH) 9 صياغة -BP100 / الرنا المزدوج الجديلة (نسبة المولي 2 و 12 ساعة). مستنسخة بإذن من مصادر منشورة 21،23،24،26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> الشكل (4): الاختلاف في الببتيد إلى الحمض النووي (N / P) نسبة وتأثير على خصائص البيوفيزيائية من المجمعات. مع زيادة الببتيد إلى نسبة الحمض النووي، وانخفاض الصيغ القائمة على الببتيد في الحجم في حين-زيتا المحتملة القيم الانتقال من السلبية إلى الإيجابية./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> الجدول 1: توصيف وتقييم الصيغ المختلفة على أساس الببتيد. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.</a> <img alt="الجدول 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> الجدول 2: مقارنة بين القائمة تقنيات الحمض النووي تسليم المستندة إلى الببتيد وغيرها من النباتات السليمة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants at JoVE.com

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

الببتيد المستمدة من طريقة لنقل الجينات والبروتينات عبر الخلوي والحواجز Organellar في النباتات

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Views.  RIKEN Center for Sustainable Resource Science. Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Video: Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

عابر التعبير الجيني في التبغ باستخدام الجمعية جيبسون وجين غون

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Environment

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

تعبير عابر في نيكوتيانا بينثاميانا يترك لإنتاج ترتيربين في نطاق التحضير

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Biochemistry

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Chemistry

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

خلية الى خلية ضخم الجزيئات النقل الفحص في بلانتا الاستفادة من قصف Biolistic

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Biology

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Immunology and Infection

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

الأمثل والاستفادة من<em&gt; الأجرعية</em&gt; بوساطة إنتاج بروتين عابر في<em&gt; نيكوتيانا</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

البروتين التسليم المباشر للخلايا الثدييات عن طريق خلية قابلة للاختراق السيستئين<sub&gt; 2</sub&gt; العاهل<sub&gt; 2</sub&gt; مجالات الزنك الاصبع

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

طريقة بسيطة لعزل بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيق لتحليل التعبير الجيني عابر

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

توصيل الجزيئات في النباتات باستخدام جهاز التسريب المباشر

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

تسليط الضوء على المؤلف: جهاز التسريب المباشر لتوصيل الجزيئات في النباتات  

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

جهاز التسريب المباشر لتوصيل الجزيئات في النباتات

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

الببتيد المستمدة من طريقة لنقل الجينات والبروتينات عبر الخلوي والحواجز Organellar في النباتات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video