يصف بروتوكولنا نظامًا بسيطًا في المختبر ، لدراسة تأثير الجزيئات المعزولة على المورفولوجيا وبنية كربونات الكالسيوم. هذه التقنية مفيدة في الحالات التي تكون فيها الجزيئات الحيوية التي اختبرتها مكلفة ، أو متوفرة بكميات صغيرة ، وكذلك عند الحاجة إلى هطول أمطار كربونات الكالسيوم البطيئة. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح للتحقيق في تجارب هطول الأمطار متعددة في ظل نفس الظروف في وقت واحد.
أولاً، قم بإعداد تجربة التحكم. استخدام الماء المقطر الثلاثي والإيثانول لتنظيف القطع الزجاجية والأواني الزجاجية. استخدام قلم الماس لقطع قطعة من شريحة المجهر الزجاجي، بحيث أنها تناسب في بئر من لوحة 96-جيدا.
ضع الأماكن الزجاجية في كوب مع الماء المقطر الثلاثي ، بحيث يغطي الماء الشرائح الزجاجية. سونيكات في حمام sonicator لمدة 10 دقائق. اطهر الماء
إضافة الإيثانول لتغطية الشرائح الزجاج، و sonicate مرة أخرى في sonicator حمام لمدة 10 دقيقة. ثم جفف الشرائح والأواني الزجاجية مع تيار من غاز النيتروجين، ووضعها في منظف بلازما الهواء لمدة 10 دقائق في 130 واط. في غطاء محرك الدخان، وملء الآبار في زوايا لوحة 96 جيدا مع مسحوق كربونات الأمونيوم، وختم لوحة باستخدام رقائق الألومنيوم.
تغطية احباط مع فيلم البارافين. تنظيف أي كربونات الأمونيوم المتبقية باستخدام غاز النيتروجين. ضع القطع الزجاجية التي تم قطعها وتنظيفها سابقًا في خمس آبار مختلفة أقرب إلى المركز.
املأ كل قطعة زجاجية تحمل 100 ميكرولترات من محلول كلوريد الكالسيوم المعدة بالماء المقطر الثلاثي بمعدل تدرج متزايد يبلغ 10، 20، 30، 40، و50 ملليمولر. بعد ذلك، ثقب غطاء كل من الآبار التي تحتوي على كربونات الأمونيوم ثلاث مرات مع إبرة. ضع الغطاء مرة أخرى، وختم الحدود مع فيلم البارافين، وابقائه عند 18 درجة مئوية في حاضنة لمدة 20 ساعة.
أثناء الحضانة، تتحلل كربونات الأمونيوم إلى الأمونيا وثاني أكسيد الكربون، والتي تنتشر في محالل كلوريد الكالسيوم، مما يؤدي إلى بلورات كربونات الكالسيوم في تشكيل. بعد الحضانة، فتح الغطاء بعناية داخل غطاء الدخان، واستخدام حلقة لإزالة البلورات التي تشكلت في واجهة الماء والهواء. استخدم ملاقط لنقل القطع الزجاجية إلى كوب يحتوي على ماء مقطر مزدوج لتراجع قصير.
ثم، إزالة العينات من الكأس، واستخدام الشريط على الوجهين لإصلاح القطع الزجاجية على الجزء السفلي من طبق بيتري. المياه الزائدة الجافة لمس حدود الشريحة، مع مناديل الأنسجة. غطي طبق بيتري، وضعه في مجفف لمدة 24 ساعة.
مراقبة بلورات شكلت على القطع الزجاجية مع المجهر البصرية تستقيم في 10 إلى 40 مرة التكبير. بلورات rhombohedral لوحظ هي على الأرجح الكالسيت. إذا بالإضافة إلى بلورات rhombohedral، والحل يحتوي على بلورات كروية التي هي على الأرجح vaterite، كرر بروتوكول التبلور، والتأكد من أن يتم تنفيذ خطوة التنظيف بشكل صحيح.
وعلاوة على ذلك، تأكد من عدم وجود كربونات الأمونيوم في مناطق من لوحة غير الآبار المخصصة. يتم تحديد التركيز الأمثل لكلوريد الكالسيوم وفقا للعينة الغنية مع بلورات الكالسيت على نحو سلس الأوجه دون بلورات فاتريت. لتبدأ، والشرائح الزجاج نظيفة والأواني الزجاجية كما فعلت سابقا.
في غطاء الدخان، ضع مسحوق كربونات الأمونيوم في زوايا لوحة 96 بئرًا. في كل بئر حيث هطول الأمطار سوف تحدث، مكان قطعة الزجاج الذي تم قطع وتنظيفها. إعداد آبار التحكم.
في بئرين تحكم، ماصة 90 ميكرولترات من 25 ميليمولار تريس العازلة في 8 ، وتستكمل مع كلوريد الصوديوم 100 ملليمولار. ثم إضافة 10 ميكرولتردات من 0.5 مولا كلوريد حل. ثم, ضبط تركيز البروتين المضافة TapA إلى 10 تابا micromolar, 100 كلوريد الصوديوم ميليمولار, و 25 ملليمتر تريس العازلة في درجة الH 8.
إعداد المضافات التي تحتوي على الآبار بإضافة 90 ميكرولترات من محلول المضافة. إضافة 10 ميكرولترات من 0.5 مولر محلول مخزون كلوريد الكالسيوم إلى المضافات التي تحتوي على الآبار للوصول إلى التركيز الأمثل في كلوريد الكالسيوم 50 ميليمولر التي تم تحديدها سابقا. إعداد لوحة مع ثقوب على الغطاء على الآبار التي تحتوي على كربونات الأمونيوم، واحتضان في 18 درجة مئوية كما كان عليه سابقا.
بعد الحضانة، إعداد القطع الزجاجية في طبق بيتري كما فعلت من قبل، ووضع الطبق في مجفف لمدة 24 ساعة. لتحديد النسبة المئوية للكتلة من المواد المضافة في ترسبات كربونات الكالسيوم، تحقق أولاً من معامل الانقراض للمضافة المستخدمة. ثم، استخدام الثقل الدقيق لوزن القطع الزجاجية حيث شكلت البلورات.
بعد ذلك، كشط البلورات قبالة الزجاج في أنبوب eppe مع 1.2 ملليلتر من 0.1 حمض الخلية الضرس الحل. دوامة لفترة وجيزة، ومن ثم وضع الأنبوب في sonicator ل sonicate العينة حتى تختفي البلورات. تخزين العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
تزن الشريحة الزجاجية بعد كشط قبالة البلورات. قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية A من 1.2 ميل سونيكاتيد ملليلتر في 280 نانومتر للبروتين المضافة. استخدام معادلة بير لامبرت لحساب تركيزها ج.
L هو المسار البصري داخل cuvette. لحساب كتلة المواد المضافة في البلورة، استخدم المعادلة، c مرات v يساوي م، إذا كان التركيز في ملليغرام لكل ملليلتر. إذا كان التركيز في الشامات لكل لتر، ثم حساب الشامات تطبيق c مرات الخامس يساوي n.
ثم استخدام الوزن الجزيئي لحساب كتلة من المواد المضافة. حساب نسبة الوزن من المواد المضافة في البلورات. M هي كتلة المواد المضافة، ودلتا م، هي كتلة بلورات كربونات الكالسيوم التي تم كشطها من قطعة الزجاج.
تظهر صور SEM المقارنة بين التحكم السليم مع الوجوه الكالسيت الملساء ، وبلورات الكالسيت مع وجوه تتألف من خطوات. البلورات الكروية هي vaterite. أسفرت تجارب التحكم الناجحة وغير الناجحة عن إجراء التحليل الطيفي لرامان، الذي أظهر الأطياف النموذجية للكالسيت و vaterite على التوالي.
تقسيم التحول رامان في حوالي 1080 في السنتيمتر الواحد هو السمة الأكثر وضوحا من vaterite. بلورات كربونات الكالسيوم التي تشكلت في وجود TapA، هي متميزة عن بلورات التحكم. تم تشكيل مجمع كربونات الكالسيوم كروية معقدة، تتألف من بلورات صغيرة الكالسيت متعددة.
الطيف رامان من البلورات التي تشكلت في وجود تابا، يشبه طيف الكالسيت. تم قياس الطيف الماص من TapA ، والتحكم بدون المادة المضافة ، بعد انحلال البلورات في الحمض. تم تحديد نسبة مئوية من TapA لتكون 1.8 زائد أو ناقص 0.2٪ من المهم اتباع خطوات التنظيف بعناية، والتأكد من أن معايير التحكم تتحقق قبل اختبار تأثير المواد المضافة على تشكيل كربونات الكالسيوم.
وبالإضافة إلى ذلك، من المهم إزالة أي فائض من كربونات الأمونيوم في شكل مسحوق من الآبار. تتحلل كربونات الأمونيوم إلى الأمونيا وثاني أكسيد الكربون. الأمونيا سامة إذا استنشقت، وبالتالي، يجب التعامل مع كربونات الأمونيوم داخل غطاء الدخان فقط.
من أجل تقييم مورفولوجيا الداخلية وهيكل بلورات، يمكنك قسم لهم باستخدام شعاع أيون مركزة، صورة المقاطع مع المجهر الإلكتروني انتقال، وقياس أنماط الحيود الإلكترون من مواقع محددة على طول المقاطع. وقد سبق استخدام هذه التقنية لدراسة تأثير الجزيئات المختلفة على مورفولوجيا وبنية كربونات الكالسيوم. لقد قمنا ببلورة هذه الطريقة إلى البولوميرات الحيوية التي تنتجها الخلايا البكتيرية في الأغشية الحيوية.
سيكون من المثير للاهتمام إجراء دراسات إضافية مع السلالات الحيوية الأخرى التي تنتجها سلالات بكتيرية مختلفة.
