Notre protocole décrit un système in vitro simple, pour étudier l’effet des molécules isolées sur la morphologie et la structure du carbonate de calcium. Cette technique est avantageuse dans les cas où les biomolécules que je teste sont coûteuses, ou disponibles en petites quantités, ainsi que lorsque des précipitations lentes de carbonate de calcium sont nécessaires. En outre, il permet de sonder plusieurs expériences de précipitations dans les mêmes conditions à la fois.
Tout d’abord, préparer l’expérience de contrôle. Utilisez de l’eau distillée triple et de l’éthanol pour nettoyer les morceaux de verre et la verrerie. Utilisez un stylo diamant pour couper des morceaux d’une lame de microscope en verre, de sorte qu’ils s’insèrent dans un puits d’une plaque de 96 puits.
Placez les places en verre dans un bécher avec de l’eau distillée triple, de sorte que l’eau recouvre les glissières en verre. Sonicate dans un sonicator de bain pendant 10 minutes. Décanter l’eau.
Ajouter de l’éthanol pour couvrir les toboggans en verre et sonifier à nouveau dans un sonicateur de bain pendant 10 minutes. Ensuite, séchez les glissières et la verrerie avec un jet de gaz azoté, et placez-les dans un nettoyeur de plasma d’air pendant 10 minutes à 130 watts. Dans un capot à vapeur, remplir les puits aux coins d’une plaque de 96 puits de poudre de carbonate d’ammonium et sceller la plaque à l’aide de papier d’aluminium.
Couvrir le papier d’aluminium d’un film de paraffine. Nettoyez tout carbonate résiduel d’ammonium à l’aide de gaz azoté. Placez les morceaux de verre préalablement coupés et nettoyés dans cinq puits différents les plus proches du centre.
Remplissez chaque puits portant un morceau de verre avec 100 microlitres de solution de chlorure de calcium préparé avec de l’eau distillée triple à un gradient croissant de 10, 20, 30, 40 et 50 millimolaires concentrations. Ensuite, perforez le couvercle de chacun des puits contenant du carbonate d’ammonium trois fois à l’aide d’une aiguille. Remettre le couvercle, sceller les bordures avec du film de paraffine, et le garder à 18 degrés Celsius dans un incubateur pendant 20 heures.
Pendant l’incubation, le carbonate d’ammonium est décomposé en ammoniac et en dioxyde de carbone, qui se diffusent en solutions de chlorure de calcium, ce qui entraîne la formation de cristaux de carbonate de calcium. Après l’incubation, ouvrez soigneusement le couvercle à l’intérieur d’un capot de fumée et utilisez une boucle pour enlever les cristaux formés à l’interface eau-air. Utilisez une pince à épiler pour transférer les morceaux de verre dans un bécher contenant de l’eau distillée double pour une courte trempette.
Ensuite, retirez les échantillons du bécher et utilisez du ruban adhésif à double face pour fixer les morceaux de verre sur le fond de la boîte de Pétri. Sécher l’eau excessive en touchant les bordures de la lame, avec des lingettes de tissu. Couvrir la boîte de Pétri et la placer dans un dessiccateur pendant 24 heures.
Observez les cristaux formés sur les morceaux de verre avec un microscope optique droit à 10 à 40 fois grossissement. Les cristaux rhombohédral observés sont très probablement calcite. Si, en plus des cristaux rhombohédral, la solution contient des cristaux sphériques qui sont très probablement vaterite, répéter le protocole de cristallisation, en s’assurant que l’étape de nettoyage est effectuée correctement.
En outre, assurez-vous qu’il n’y a pas de carbonate d’ammonium dans les zones de la plaque autres que les puits dédiés. La concentration optimale de chlorure de calcium est déterminée selon l’échantillon riche en cristaux de calcite à facettes lisses sans cristaux de vaterite. Pour commencer, nettoyez les toboggans en verre et la verrerie comme cela a été fait précédemment.
Dans une hotte fumigène, placer la poudre de carbonate d’ammonium dans les coins d’une plaque de 96 puits. Dans chaque puits où il y aura des précipitations, placez un morceau de verre qui a été coupé et nettoyé. Préparer les puits de contrôle.
Dans deux puits témoins, pipette 90 microlitres de 25 millimlaires Tris tampon au pH 8, complétée par du chlorure de sodium de 100 millimlaires. Ajouter ensuite 10 microlitres de 0,5 solution molaire de stock de chlorure de calcium. Ensuite, ajustez la concentration de la protéine additive TapA à 10 micromolaires TapA, chlorure de sodium de 100 millimlaires et tampon tris de 25 millimolaires au pH 8.
Préparer l’additif contenant des puits en ajoutant 90 microlitres de la solution additive. Ajouter 10 microlitres de 0,5 solution molaire de stock de chlorure de calcium à l’additif contenant des puits pour atteindre la concentration optimale à 50 millimlaires de chlorure de calcium déterminé précédemment. Préparer la plaque avec des trous sur le couvercle sur les puits contenant du carbonate d’ammonium, et incuber à 18 degrés Celsius comme cela a déjà été fait.
Après l’incubation, préparer les morceaux de verre dans une boîte de Pétri comme avant, et placer le plat dans un dessiccateur pendant 24 heures. Pour quantifier le pourcentage de masse des additifs dans les précipités de carbonate de calcium, vérifiez d’abord le coefficient d’extinction de l’additif utilisé. Ensuite, utilisez un microbalance pour peser les morceaux de verre où les cristaux se sont formés.
Après cela, racler les cristaux du verre dans un tube eppe avec 1,2 millilitres de 0,1 solution d’acide acétique molaire. Vortex brièvement, puis placer le tube dans un sonicateur pour sonifier l’échantillon jusqu’à ce que les cristaux disparaissent. Conserver l’échantillon à température ambiante pendant 24 heures.
Pesez la glissière de verre après avoir gratté les cristaux. Mesurer l’absorption UV A de la solution sonique de 1,2 millilitre à 280 nanomètres pour l’additif protéique. Utilisez l’équation Beer-Lambert pour calculer sa concentration c.
L est le chemin optique à l’intérieur de la cuvette. Pour calculer la masse des additifs dans le cristal, utilisez l’équation, c fois v égale m, si la concentration est en milligrammes par millilitre. Si la concentration est dans les grains de beauté par litre, puis calculer les grains de beauté en appliquant c fois v égale n.
Ensuite, utilisez le poids moléculaire pour calculer la masse des additifs. Calculer le pourcentage de poids des additifs dans les cristaux. M est la masse des additifs, et delta m s, est la masse des cristaux de carbonate de calcium qui ont été grattés sur le morceau de verre.
Les images SEM montrent la comparaison entre un contrôle approprié avec des faces calcites lisses, et calcite cristaux avec des visages composés d’étapes. Les cristaux sphériques sont vaterites. Les expériences de lutte réussies et infructueuses ont abouti à la spectroscopie raman, montrant les spectres typiques de calcite et de vaterite respectivement.
La division du changement raman à environ 1080 par centimètre est la caractéristique la plus évidente du vaterite. Les cristaux de carbonate de calcium formés en présence de TapA, sont distincts des cristaux de contrôle. Un assemblage sphérique complexe de carbonate de calcium, composé de microcrystals calcite multiples a été formé.
Le spectre Raman des cristaux formés en présence de TapA, est similaire au spectre de calcite. Les spectres absorbants du TapA, et le contrôle sans additif, ont été mesurés après dissolution des cristaux dans l’acide. Le pourcentage de masse de TapA a été déterminé à 1,8 plus ou moins 0,2%Il est essentiel de suivre attentivement les étapes de nettoyage, et de s’assurer que les normes de contrôle sont respectées avant de tester l’effet des additifs sur la formation de carbonate de calcium.
En outre, il est important d’éliminer tout excès de carbonate d’ammonium sous forme en poudre des puits. Le carbonate d’ammonium se décompose en ammoniac et en dioxyde de carbone. L’ammoniac est toxique s’il est inhalé et, par conséquent, le carbonate d’ammonium ne doit être manipulé qu’à l’intérieur d’un capot de fumée.
Afin d’évaluer la morphologie interne et la structure des cristaux, vous pouvez les sectionner à l’aide d’un faisceau iion focalisé, l’image des sections avec un microscope électronique de transmission, et de mesurer les modèles de diffraction électronique à partir d’endroits spécifiques le long des sections. Cette technique a déjà été utilisée pour étudier l’effet de diverses molécules sur la morphologie et la structure du carbonate de calcium. Nous avons élaboré cette méthode aux biopolymères qui sont produits par les cellules bactériennes dans les biofilms.
Il sera intéressant d’effectuer des études supplémentaires avec d’autres biopolymères produits par différentes souches bactériennes.
